地塞米松在诱发先天性腭裂发病中对表皮生长因子受体表达的影响
作者：邓末宏 李宏礼 傅豫川 董红梅
单位：邓末宏(汕头大学医学院第一附院口腔科515030)；董红梅(病理教研室)；李宏礼(湖北医科大学口腔医学院)；傅豫川(湖北医科大学口腔医学院).
关键词：地塞米松；腭裂；表皮生长因子受体
口腔颌面外科杂志000312 摘 要：目的 检测地塞米松诱发NIH小鼠先天性腭裂时对表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响。方法 在GD1212天小时给怀孕小鼠腹腔注射磷酸地塞米松注射液(50mg/kg)，对照组则以等量生理盐水代替。分别于GD1312、GD1412、GD1512天小时取出胎鼠头部标本，作冠状位切片。采用免疫组化方法检测胚胎腭中EGFR的表达。结果 EGFR的表达随胚胎腭的发育而增高，实验组EGFR增高的速度较慢。结论 地塞米松诱发先天性腭裂发病与EGFR表达的改变有关。
, http://www.100md.com
中图分类号：R782.2 文献标识码：A 文章编号：1005-4979(2000)03-0225-03
EFFECTS OF DEXAMETHASHONE ON EXPRESSION OF
EGFR DURING INDUCTION CLEFT PALATE
DENG Mo-hong，LI Hong-li，FU Yu-chuan，DONG Hong-mei
(College of Stomatology，Hubei Medical University，Wuhan 430070)
Abstract：Objective To explore effects of Dexamethasone on EGFR expression during induction cleft palate.Methods Pregnant NIH mice were injected Dexamethasone(50mg/kg) intraperitoneally in GD 1212，control group mice were given the same dose of NS. Fetuses were removed out in GD1312、GD1412、GD1512，heads were sliced in coronal plane. Expression of EGFR in embryonic palate were detected by immunohistochemical methods.Results Expression of EGFR is on the same level on both group in GD1312，and is lower in experimental group in GD1412(P<0.05). In GD1512，expression of EGFR is lower in mesenchymal cell(P<0.05) and higher in MEE cell of experimental group.Conclusion Cleft palate induced by Dexamethasone may be related with alterated expression of EGFR.
, 百拇医药
Key words：Dexamethasone; Epidermal growth factor receptor(EGFR); Cleft palate
先天性腭裂是口腔颌面部常见的先天性畸形，发病率高。尽管在临床上对于这种发育畸形的序列治疗已日趋完善，但该病发病机理尚不清楚。
胚胎腭的发生发育是一系列连续、复杂的生物学过程，在这一系列复杂的过程中，需要激素、第二信使、生长因子等参与生命活动信号的传递。Brunet等发现[1]，体外培养的腭器官中，125I-EGF的结合位点广泛存在，并随着腭器官的发育而发生时空性改变。Abbott和Shiota曾报道表皮生长因子受体(EGFR)在胚胎腭发育过程不同时期会发生改变[2，3]。这些结果提示EGFR在胚胎腭发育中具有重要作用。本研究采用免疫组化方法检测胚胎腭发育过程中EGFR的表达变化以及地塞米松对其表达的影响，探讨EGFR在小鼠胚胎腭发育及先天性腭裂发病中的作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验材料
6～8周龄体重25～30g雌性NIH小鼠60只，随机分为对照组及实验组，每组30只。兔抗小鼠EGFR抗体，Boster公司产品。S-P免疫组化染色试剂盒，Santa公司产品。DAB显色试剂盒，Santa公司产品。
1.2 标本制备
经与雄鼠交配后，如发现阴栓，认为雌鼠已受孕，记为GD00天小时(gestation day，GD)。实验组在GD1212天小时腹腔注射磷酸地塞米松(50mg/kg)[4]，对照组以同等量生理盐水代替。分别于GD1312、GD1412、GD1512天小时颈椎脱位处死母鼠，每组各为5只，剖腹取出胎鼠，切取胎鼠头部。标本经4%多聚甲醛固定24h后，序列酒精脱水，石蜡包埋。以麦克尔氏软骨为基准面，作冠状位4～5μm厚连续切片，H-E染色，脱水，封片，光镜观察。
, 百拇医药
1.3 免疫组化染色
用S-P方法进行免疫组化染色，主要步骤如下：切片脱蜡至水，置3%H2O2中浸泡10min以消除内源性过氧化物酶，正常山羊血清37°C孵育20min以降低非特异性着色。适当稀释的兔抗小鼠EGFR抗体37°C孵育2h，生物素化的二抗作用20min，三抗作用20min，DAB显色3min，苏木素复染。以购自北京中山公司的阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.4 图像处理
光镜观察染色结果，选取阳性染色切片经电视摄像系统输入HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像细胞测量系统分析，每个时期各选10个视野。
2 结 果
2.1 光镜观察
, 百拇医药
GD1312天小时对照组及实验组胚胎舌体位置较高，腭突位于舌体两侧向下垂直生长。GD1412天小时对照组舌体降至口底，腭突上抬至舌体上方呈水平相对生长，部分腭突相互接触，中间嵴上皮在中线区形成上皮中缝。实验组腭突位于舌体两侧开始上抬。GD1512天小时对照组腭突接触融合，上皮中缝消失，间充质细胞相互连接形成完整的腭器官。实验组腭突在舌体上方呈水平生长，但体积较小，不能在中线区相互接触，腭裂形成(图1)。
2.2 免疫组化染色
EGFR着色位于细胞膜和细胞浆中，呈棕黄色。在胚胎腭中主要表达于上皮成份中，间充质中有散在表达(图2)。
2.3 地塞米松对胚胎腭上皮细胞中EGFR表达的影响
, 百拇医药 免疫组化染色结果经计算机图像处理系统分析后，将其平均光度值记录如附表。
2.4 地塞米松对胚胎腭间充质细胞中EGFR表达的影响
结果见附表。免疫组化染色结果经计算机图像处理系统分析后，取平均光度值记录如图3。
图1 实验组GD1512天小时腭突体积较小，形成HC样裂 H-E×33
图2 实验组GD1512天小时腭突EGFR表达方式SP×66
附表 地塞米松诱发先天性腭裂对EGFR表达的影响
, 百拇医药
口腔面上皮
腭突中嵴上皮
鼻腔面上皮
1312
对照组
0.022±0.004
0.022±0.009
0.026±0.007
(n=10)
实验组
0.023±0.008
0.024±0.007
, 百拇医药
0.024±0.003
1412
对照组
0.137±0.042
0.143±0.019
0.121±0.025
(n=10)
实验组
0.064±0.009*
0.046±0.014*
0.058±0.013*
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1512
对照组
0.172±0.027
-
0.191±0.053
(n=10)
实验组
0.184±0.033
0.179±0.024
0.171±0.031
*与对照组相比P<0.05
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图3 地塞米松诱发性腭裂对间充质表达EGFR的影响
3 讨 论
先天性腭裂是由遗传和环境因素综合作用而引起的先天性发育畸形，其中环境因素尤其是化学物质与其发生密切相关。目前已发现不少药物如糖皮质激素类、维生素A类、TCDD等均可诱发先天性腭裂，其中地塞米松致畸率高[5]，致畸引起的腭突体积小、上抬延迟并不能在中线区相互接触融合，从而形成HC样裂。这与临床常见的先天性腭裂在形态学上较相似，因而我们在本研究中采用地塞米松作为致畸药物。
EGFR是一种单跨膜糖蛋白，分子质量为170kD，其胞外部分可以结合表皮生长因子(EGF)，胞内部分能与ATP结合。当EGFR胞外部分与其配体相互结合后，致酪氨酸酸激酸活化，引起受体酪氨酸发生磷酸化，胞外信号由此向细胞内传递并扩大，从而启动胞核内有关基因，促进细胞增殖。虽然表皮生长因子可以在体外培养过程中促进鼠胚胎腭中间嵴上皮(MEE)和间充质细胞(MEPM)的增殖[6，7]，但这一作用最终仍需EGFR的参与。Shiota报道[2]，在胚胎发育过程中，小鼠胚胎腭口腔面上皮及中间嵴上皮均可表达EGFR，并随着发育而出现时间性和空间性的改变。这一发现提示EGFR可能参与胚胎腭发育的调节过程。我们在实验中发现，在胚胎腭的发育早期(GD1312天小时)，对照组与正常组胚胎腭EGFR的表达无明显差别；在胚胎形成时期(GD1412天小时)，对照组腭突发育充分，其中表达的EGFR明显要高(P<0.05)；到了腭器官形成以后(GD1512天小时)，EGFR在实验组MEE仍有较高的表达，但在间充质中表达较对照组低(P<0.05)。结合形态学分析，EGFR的表达异常可能与实验组小腭突的形成及MEE的持续存在有关。
, 百拇医药
TCDD作用于怀孕早期的母体可以诱发TCDD样裂，其腭突可充分发育并上抬至水平位相互接触，但并不发生融合。以TCDD作用于体外培养的胚胎腭突，尽管其中EGF含量降低，但MEE仍表达较高的EGFR并持续增殖[8]。这说明EGFR在胚胎腭发育形成过程中，不仅可以促使MEPM细胞的增殖，还可能抑制胚胎腭发育过程中MEE细胞的程序性死亡。由于EGFR表达水平较高，尽管腭突可以相互接触，但MEE细胞仍保持完整，从而腭突无法相互融合形成完整的腭器官。
在胚胎发育过程中，有多种物质参与了生命调节活动。本研究发现地塞米松诱发先天性腭裂可能与EGFR异常表达相关，同时尚有TGFβ的改变，因此先天性腭裂的确切发病机理尚有待于进一步深入的研究。
作者简介：邓末宏(1971-)，男，安徽东至县人，硕士.
参考文献：
, 百拇医药 [1] Brunet CL，Sharpe PM，Ferguson MW. The distribution of epidermal growth factor binding sites in the developing mouse palate[J]. Int J Dev Biol，1993; 37(3): 451-458.
[2] Shiota K，Fujita S，Akiyama T，et al. Expression of the epidermal growth factor receptor in developing fetal mouse palates: an immunohistochemical study[J]. Am J Anat，1990，188(4): 401-406.
[3] Abbott BD，Garner J，Ferguson MW. Immmunodetection of epidermal growth factor(EGF)，EGF receptor，and transforming growth factor alpha(TGF alpha) during murine palatogenesis in vivo and vitro[J]. Anat Embryol(Berl)，1991; 184(1): 83-91.
, 百拇医药
[4] 傅玉川，黄洪章，李祖兵.小鼠腭发育及腭裂形成过程的渐进性观察[J].口腔医学纵横，1995；11(1)：16-18.
[5] 傅玉川，黄洪章，李祖兵.建立远交系小白鼠胚胎腭裂模型的实验研究[J].现代口腔医学杂志，1994；8(2)：70-73.
[6] Barbara D，Abbott BD，Robert M，et al. Influence of retinoids and EGF on growth of embryonic mouse palatal epithelia in culture[J]. In Cellular and Development Biology，1988; 24(4): 343-352.
[7] Kathleen J，Gavel Thompson，Robert M，et al. Epidermal growth factor modulator of murine embryonic palate mesenchymal cell proliferation，polyamine biosynesis and polyamine transport[J]. J Cell Physiol; 1989，140(2): 359.
[8] Abbott BD. TCDD-induced alterned expression of growth factors may have a role in producing cleft palate and enhancing the incidence of clefts after coadministration of retinioc acid and TCDD[J]. Toxicol Appl pharmacol，1990; 106(3): 418.
收稿日期：1999-05-28, http://www.100md.com
单位：邓末宏(汕头大学医学院第一附院口腔科515030)；董红梅(病理教研室)；李宏礼(湖北医科大学口腔医学院)；傅豫川(湖北医科大学口腔医学院).
关键词：地塞米松；腭裂；表皮生长因子受体
口腔颌面外科杂志000312 摘 要：目的 检测地塞米松诱发NIH小鼠先天性腭裂时对表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响。方法 在GD1212天小时给怀孕小鼠腹腔注射磷酸地塞米松注射液(50mg/kg)，对照组则以等量生理盐水代替。分别于GD1312、GD1412、GD1512天小时取出胎鼠头部标本，作冠状位切片。采用免疫组化方法检测胚胎腭中EGFR的表达。结果 EGFR的表达随胚胎腭的发育而增高，实验组EGFR增高的速度较慢。结论 地塞米松诱发先天性腭裂发病与EGFR表达的改变有关。
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中图分类号：R782.2 文献标识码：A 文章编号：1005-4979(2000)03-0225-03
EFFECTS OF DEXAMETHASHONE ON EXPRESSION OF
EGFR DURING INDUCTION CLEFT PALATE
DENG Mo-hong，LI Hong-li，FU Yu-chuan，DONG Hong-mei
(College of Stomatology，Hubei Medical University，Wuhan 430070)
Abstract：Objective To explore effects of Dexamethasone on EGFR expression during induction cleft palate.Methods Pregnant NIH mice were injected Dexamethasone(50mg/kg) intraperitoneally in GD 1212，control group mice were given the same dose of NS. Fetuses were removed out in GD1312、GD1412、GD1512，heads were sliced in coronal plane. Expression of EGFR in embryonic palate were detected by immunohistochemical methods.Results Expression of EGFR is on the same level on both group in GD1312，and is lower in experimental group in GD1412(P<0.05). In GD1512，expression of EGFR is lower in mesenchymal cell(P<0.05) and higher in MEE cell of experimental group.Conclusion Cleft palate induced by Dexamethasone may be related with alterated expression of EGFR.
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Key words：Dexamethasone; Epidermal growth factor receptor(EGFR); Cleft palate
先天性腭裂是口腔颌面部常见的先天性畸形，发病率高。尽管在临床上对于这种发育畸形的序列治疗已日趋完善，但该病发病机理尚不清楚。
胚胎腭的发生发育是一系列连续、复杂的生物学过程，在这一系列复杂的过程中，需要激素、第二信使、生长因子等参与生命活动信号的传递。Brunet等发现[1]，体外培养的腭器官中，125I-EGF的结合位点广泛存在，并随着腭器官的发育而发生时空性改变。Abbott和Shiota曾报道表皮生长因子受体(EGFR)在胚胎腭发育过程不同时期会发生改变[2，3]。这些结果提示EGFR在胚胎腭发育中具有重要作用。本研究采用免疫组化方法检测胚胎腭发育过程中EGFR的表达变化以及地塞米松对其表达的影响，探讨EGFR在小鼠胚胎腭发育及先天性腭裂发病中的作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验材料
6～8周龄体重25～30g雌性NIH小鼠60只，随机分为对照组及实验组，每组30只。兔抗小鼠EGFR抗体，Boster公司产品。S-P免疫组化染色试剂盒，Santa公司产品。DAB显色试剂盒，Santa公司产品。
1.2 标本制备
经与雄鼠交配后，如发现阴栓，认为雌鼠已受孕，记为GD00天小时(gestation day，GD)。实验组在GD1212天小时腹腔注射磷酸地塞米松(50mg/kg)[4]，对照组以同等量生理盐水代替。分别于GD1312、GD1412、GD1512天小时颈椎脱位处死母鼠，每组各为5只，剖腹取出胎鼠，切取胎鼠头部。标本经4%多聚甲醛固定24h后，序列酒精脱水，石蜡包埋。以麦克尔氏软骨为基准面，作冠状位4～5μm厚连续切片，H-E染色，脱水，封片，光镜观察。
, 百拇医药
1.3 免疫组化染色
用S-P方法进行免疫组化染色，主要步骤如下：切片脱蜡至水，置3%H2O2中浸泡10min以消除内源性过氧化物酶，正常山羊血清37°C孵育20min以降低非特异性着色。适当稀释的兔抗小鼠EGFR抗体37°C孵育2h，生物素化的二抗作用20min，三抗作用20min，DAB显色3min，苏木素复染。以购自北京中山公司的阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.4 图像处理
光镜观察染色结果，选取阳性染色切片经电视摄像系统输入HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像细胞测量系统分析，每个时期各选10个视野。
2 结 果
2.1 光镜观察
, 百拇医药
GD1312天小时对照组及实验组胚胎舌体位置较高，腭突位于舌体两侧向下垂直生长。GD1412天小时对照组舌体降至口底，腭突上抬至舌体上方呈水平相对生长，部分腭突相互接触，中间嵴上皮在中线区形成上皮中缝。实验组腭突位于舌体两侧开始上抬。GD1512天小时对照组腭突接触融合，上皮中缝消失，间充质细胞相互连接形成完整的腭器官。实验组腭突在舌体上方呈水平生长，但体积较小，不能在中线区相互接触，腭裂形成(图1)。
2.2 免疫组化染色
EGFR着色位于细胞膜和细胞浆中，呈棕黄色。在胚胎腭中主要表达于上皮成份中，间充质中有散在表达(图2)。
2.3 地塞米松对胚胎腭上皮细胞中EGFR表达的影响
, 百拇医药 免疫组化染色结果经计算机图像处理系统分析后，将其平均光度值记录如附表。
2.4 地塞米松对胚胎腭间充质细胞中EGFR表达的影响
结果见附表。免疫组化染色结果经计算机图像处理系统分析后，取平均光度值记录如图3。
图1 实验组GD1512天小时腭突体积较小，形成HC样裂 H-E×33
图2 实验组GD1512天小时腭突EGFR表达方式SP×66
附表 地塞米松诱发先天性腭裂对EGFR表达的影响
, 百拇医药
口腔面上皮
腭突中嵴上皮
鼻腔面上皮
1312
对照组
0.022±0.004
0.022±0.009
0.026±0.007
(n=10)
实验组
0.023±0.008
0.024±0.007
, 百拇医药
0.024±0.003
1412
对照组
0.137±0.042
0.143±0.019
0.121±0.025
(n=10)
实验组
0.064±0.009*
0.046±0.014*
0.058±0.013*
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1512
对照组
0.172±0.027
-
0.191±0.053
(n=10)
实验组
0.184±0.033
0.179±0.024
0.171±0.031
*与对照组相比P<0.05
, http://www.100md.com
图3 地塞米松诱发性腭裂对间充质表达EGFR的影响
3 讨 论
先天性腭裂是由遗传和环境因素综合作用而引起的先天性发育畸形，其中环境因素尤其是化学物质与其发生密切相关。目前已发现不少药物如糖皮质激素类、维生素A类、TCDD等均可诱发先天性腭裂，其中地塞米松致畸率高[5]，致畸引起的腭突体积小、上抬延迟并不能在中线区相互接触融合，从而形成HC样裂。这与临床常见的先天性腭裂在形态学上较相似，因而我们在本研究中采用地塞米松作为致畸药物。
EGFR是一种单跨膜糖蛋白，分子质量为170kD，其胞外部分可以结合表皮生长因子(EGF)，胞内部分能与ATP结合。当EGFR胞外部分与其配体相互结合后，致酪氨酸酸激酸活化，引起受体酪氨酸发生磷酸化，胞外信号由此向细胞内传递并扩大，从而启动胞核内有关基因，促进细胞增殖。虽然表皮生长因子可以在体外培养过程中促进鼠胚胎腭中间嵴上皮(MEE)和间充质细胞(MEPM)的增殖[6，7]，但这一作用最终仍需EGFR的参与。Shiota报道[2]，在胚胎发育过程中，小鼠胚胎腭口腔面上皮及中间嵴上皮均可表达EGFR，并随着发育而出现时间性和空间性的改变。这一发现提示EGFR可能参与胚胎腭发育的调节过程。我们在实验中发现，在胚胎腭的发育早期(GD1312天小时)，对照组与正常组胚胎腭EGFR的表达无明显差别；在胚胎形成时期(GD1412天小时)，对照组腭突发育充分，其中表达的EGFR明显要高(P<0.05)；到了腭器官形成以后(GD1512天小时)，EGFR在实验组MEE仍有较高的表达，但在间充质中表达较对照组低(P<0.05)。结合形态学分析，EGFR的表达异常可能与实验组小腭突的形成及MEE的持续存在有关。
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TCDD作用于怀孕早期的母体可以诱发TCDD样裂，其腭突可充分发育并上抬至水平位相互接触，但并不发生融合。以TCDD作用于体外培养的胚胎腭突，尽管其中EGF含量降低，但MEE仍表达较高的EGFR并持续增殖[8]。这说明EGFR在胚胎腭发育形成过程中，不仅可以促使MEPM细胞的增殖，还可能抑制胚胎腭发育过程中MEE细胞的程序性死亡。由于EGFR表达水平较高，尽管腭突可以相互接触，但MEE细胞仍保持完整，从而腭突无法相互融合形成完整的腭器官。
在胚胎发育过程中，有多种物质参与了生命调节活动。本研究发现地塞米松诱发先天性腭裂可能与EGFR异常表达相关，同时尚有TGFβ的改变，因此先天性腭裂的确切发病机理尚有待于进一步深入的研究。
作者简介：邓末宏(1971-)，男，安徽东至县人，硕士.
参考文献：
, 百拇医药 [1] Brunet CL，Sharpe PM，Ferguson MW. The distribution of epidermal growth factor binding sites in the developing mouse palate[J]. Int J Dev Biol，1993; 37(3): 451-458.
[2] Shiota K，Fujita S，Akiyama T，et al. Expression of the epidermal growth factor receptor in developing fetal mouse palates: an immunohistochemical study[J]. Am J Anat，1990，188(4): 401-406.
[3] Abbott BD，Garner J，Ferguson MW. Immmunodetection of epidermal growth factor(EGF)，EGF receptor，and transforming growth factor alpha(TGF alpha) during murine palatogenesis in vivo and vitro[J]. Anat Embryol(Berl)，1991; 184(1): 83-91.
, 百拇医药
[4] 傅玉川，黄洪章，李祖兵.小鼠腭发育及腭裂形成过程的渐进性观察[J].口腔医学纵横，1995；11(1)：16-18.
[5] 傅玉川，黄洪章，李祖兵.建立远交系小白鼠胚胎腭裂模型的实验研究[J].现代口腔医学杂志，1994；8(2)：70-73.
[6] Barbara D，Abbott BD，Robert M，et al. Influence of retinoids and EGF on growth of embryonic mouse palatal epithelia in culture[J]. In Cellular and Development Biology，1988; 24(4): 343-352.
[7] Kathleen J，Gavel Thompson，Robert M，et al. Epidermal growth factor modulator of murine embryonic palate mesenchymal cell proliferation，polyamine biosynesis and polyamine transport[J]. J Cell Physiol; 1989，140(2): 359.
[8] Abbott BD. TCDD-induced alterned expression of growth factors may have a role in producing cleft palate and enhancing the incidence of clefts after coadministration of retinioc acid and TCDD[J]. Toxicol Appl pharmacol，1990; 106(3): 418.
收稿日期：1999-05-28, http://www.100md.com