大鼠磨牙及牙周组织中神经纤维分布：神经丝蛋白免疫组织化学研究
作者：樊成涛 段银钟 金岩 孙应明 李媛
单位：樊成涛(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；段银钟(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；金岩(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；孙应明(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；李媛(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：牙齿；牙髓；牙周；神经丝蛋白；免疫组织化学；大鼠
牙体牙髓牙周病学杂志000309 【摘 要】 目的：观察大鼠磨牙及牙周组织神 经纤维分布 特点。方法：大鼠磨牙及其牙槽骨脱钙后切片并行神经丝蛋白(NFP)免疫 组织化学染色。结果：大鼠磨牙、牙周膜及牙龈中神经纤维丰富，神经 丝蛋白阳性神经纤维在髓角处形成牙本质细胞下丛，其中一些神经纤维进 入牙本质。在牙周膜，神经丝蛋白阳性神经纤维在牙根下段密集分布。在牙周膜内存在两型 神经末梢：游离神经末梢及Ruffini终末。前者在整个牙周膜内皆有分布，后者常成组地局 限分布在牙根下1/3。在游离龈中神经丝蛋白阳性神经呈丛状分布，在靠近结合上皮处分布 更为密集。结论：神经丝蛋白阳性神经纤维在牙齿及其支持组织的不同部位形态和数量不同，具有特征性分布。
, 百拇医药
【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)03-0143-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，2000,10(3)：143]
Distribution of nerve fibers in rat molar and periodontium: An immunohistochemical investigation of neurofilament protein
FAN Cheng-tao, DUAN Yin-zhong, JIN Yan, et al
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
, 百拇医药
【Abstract】 AIM: To investigate the distribution characters of nerve fibers in rat molar and periodontium. METHODS: Decalcified material inc luding the alveolar bone was sectioned and stained by means of immunohistochemis try for detection of the neurofilament protein(NFP). RESULTS: There were plenty of nerve fibers in rat molars, periodontal ligament and gingiva. NFP-positive nerve fibers formed a s ubodontoblastic plexus in the roof area of the dental pulp. Some of them entered the predentin and dentin directly through the dentinal tubules. In the periodon tal ligament, NFP-positive nerve fibers were found densely distributed in the lo wer half of the alveolar socket. Two types of nerve terminals were recognized in the periodontal ligament: free nerve endings and Ruffini endings. The former distributed in the whole periodontal ligament. The latter was locat ed to the lower third of the alveolar socket. A plexus of NFP-positive nerves was revealed in the free gingiva, the i nnervation being denser toward the epithelium of the gingiva crevice. CONCLUSIO N: The teeth and surrounding tissues have characteristic distribution of NFP-immunoreactive nerve fibers.
, 百拇医药
【Key words】 teeth; dental pulp; periodontium; nuerofil ament protein;immunohistochemistry; rat
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2000,10(3):143]
牙体组织有丰富的神经分布，牙髓神经主要是痛感受器，而牙 周神 经除了感受痛觉以外，还对触压觉有反应。牙齿及牙周组织神经的分布特征一直是口腔研究 工作者感兴趣的课题， 它对弄清牙齿的痛觉感受、口腔反射等具有重要作用，但是由于神经染色技术的不完 善，目前对牙齿及牙周组织神经的分布还缺乏详细的介绍，在某些方面仍然存在争议[ 1]。
由于抗神经丝蛋白(neurofliament protein,NFP)免疫组化染色方法观察神经结构比其它形 态学方法清晰，并且其免疫活性不因组织脱钙而降低[2]，所以本实验采用抗NFP 免疫组织化学染色方法，观察大鼠磨牙及牙周组织神经纤维的分布。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验动物
健康雌性SD大鼠16只，体重(200±10)g。
1.2 实验仪器
冰冻切片机，Olympus 双目显微镜及其显微照像系统。
1.3 样本固定及免疫组织化学染色
实验大鼠用速眠新(0.8ml/kg)肌肉注射后深度麻醉，40g/L多聚甲醛心脏灌注固定后，立即 取上颌骨浸入上述固定液内固定24h，4mol/L甲酸和0.5mol/L甲酸钠溶液脱钙5d，去除多 余组织块保留磨牙及牙周组织，入300g/L蔗糖缓冲液过夜，按近远中向做冰冻切片，厚40 μm，常规ABC法免疫组织化学染色。用正常羊血清替代一抗，进行完全相同的免疫组织 化学染色，苏木精衬染胞核。
, 百拇医药
2 结果
2.1 抗体替代对照实验均为阴性
2.2 牙髓及牙本质神经支配
来源于上齿槽神经分支的粗大的NFP免疫反应阳性(NFP-IR)神经束从根尖孔进入牙髓，也有 部分神经从侧支根管进入。神经纤维束在根髓中部穿过并发出少量细小的树状分支(图1)， 到达冠髓后在多细胞层下方成扇形分开，分支成小束，最后在髓角处形成Raschkow丛，其中 ，一些神经纤维穿过牙本质细胞层垂直进入前期牙本质及钙化牙本质，也有少数的神经纤维 沿牙髓-牙本质界走行一段后进入牙本质，也有一些神经纤维在前期牙本质中折返(图2 )。
2.3 牙周膜神经支配
牙周膜NFP-IR神经数量少于牙髓，且根尖1/3处较多，较粗的神经纤维位于牙周膜中部稍偏 向牙槽骨侧，并向牙骨质方向发出较细的分支，常伴血管分布(图3)。其来源为根尖神经的 分支，也有一部分穿过牙槽骨壁的孔洞进入牙周膜。
, 百拇医药
图1 成束的NFP-IR神经纤维走行于根髓中部，并发出树状分支支配根髓 ×20
图2 大鼠磨牙牙髓腔，示Raschkow丛，一些神经纤维进入牙本质 ×40
图3 大鼠磨牙远中牙周膜，示一些较粗的神经纤维发出分支朝向牙骨质 ×40
图4 大鼠磨牙根尖部，示Ruffini小体与游离神经末梢共存 ×40
图5 大鼠磨牙根分叉，示NFP-IR神经束自髓室底的小孔进入并支配牙髓 ×20
, 百拇医药
图6 大鼠游离龈，示NFR-IR在靠近结合上皮处密集排列，一些神经纤维进入结合上皮层 ×20
在牙周膜里可观察到两种神经终末：一种为较细的游离神经末梢，多数 纵向走行于牙周膜内 ，少数弯曲走行，呈串珠或条索状，在牙周膜的各个部位皆可看到；另外一种分布在牙周膜 下1/3处，尤其根尖附近，与游离神经末梢常共存，常成组分布，形态不规则，终末突触小 结呈树状、把手状或钟状分支，终末部膨大，边缘可见明显的皱褶，似桑椹状，在牙髓内未 见此种神经末梢存在(图4)。
根分叉处牙周膜神经纤维较少，多为游离神经末梢，也可看到成束的神经纤维经髓室底的小 管进入牙髓(图5)。
2.4 牙龈神经纤维
牙龈的神经纤维丰富，主要是游离神经末梢，分布呈丛状，在靠近结合上皮处，神经纤维更 加密集并朝向结合上皮平行排列(图6)，有的也进入结合上皮层，但是在龈乳头处神经纤维 分布较少，仅可见散在的神经末梢。
, 百拇医药
3 讨论
神经丝蛋白属神经元胞浆内的中间丝成分，由Mr分别为6.8×104、14.5×104及20 ×104的三联多肽组成[3]，本实验清晰地观察到牙髓和牙周组织含有大量的NFP -IR神经纤维，表明NFP可用于牙齿及牙周神经纤维的研究。
关于牙周膜神经纤维的分布历来存在争议，Sakata[4]认为在牙周膜中部神经纤维 较多，而Kato[5]认为根尖1/3牙周神经纤维最多，并且在根分叉区牙周膜无神 经纤维分布。本实验发现，在根尖1/3神经纤维分布最密集，但在根分叉区牙周膜内仍然 有 少量神经纤维分布，同时有一些神经纤维束穿过髓室底部的小管进入并支配牙髓组织，这种 现象在既往文献中未见报道，对解释牙髓牙周综合征的发生机理及疼痛特点提供了形态学上 的依据，但是人磨牙是否具有类似的结构尚需进一步研究。
, 百拇医药
王莉梅[6]通过顺行性自显影神经解剖示踪术观察到牙周膜神经纤维靠近牙骨质， 但孙剑[7]通过降钙素基因相关肽(CGRP)免疫组织化学研究发现神经纤维分布靠近 牙槽骨侧，本实验中牙周膜内较粗的神经纤维干位于牙周膜中部偏牙槽骨侧，其分支向牙骨 质延伸，显示了神经纤维在牙周膜内的完整结构，而以上两种不同的观点可 能为所观察到的神经纤维属于不同节段的神经纤维。
Maeda[8]观察到大鼠牙周膜内存在把手状或钟状膨大的神经末梢，但未发现在人 牙周膜内存在的环形终末，而王莉梅发现大鼠牙周膜含有环状或盘旋状的神经终末，本实验 发现大鼠牙周膜里存在两种神经末梢，即游离神经末梢和终末膨大的神经末梢，后者根据其 形态及分布，可以判定是一种机械感受器——Ruffini终末，但未观察到环状的终末。以上 结果的 差异可能为研究方法的不同及种属的差异所致。牙周膜内两种不同的神经终末具有不同的生 理功能，Ruffini终末属于牵张感受器，对触压觉及机械形变起反应，并参与痛前感觉 [9]，而游离神经末梢主要是对痛觉起反应。
, 百拇医药
另外，本实验观察到在游离龈里近结合上皮处神经纤维丰富，表明其对维护牙周内环境的稳 定起重要作用，而在龈乳头处较少，这与临床上患者的主观反应一致。
传统的观念认为牙髓神经主要为痛觉感受，但Fried[10]认为，一些牙髓神经可 能 调控“痛前感受”以及一些非伤害性神经功能，诸如传递参与咀嚼控制的机械感受，本实验 在髓角处观察到有一些神经纤维进入牙本质，表明髓角处比其他部位敏感，但是牙本质神经 是否参与了以上这些功能并不清楚，有待于继续深入探索。
国家自然科学基金资助课题(95070770)
【参考文献】
[1] Linden RWA. Periodontal mechanoreceptors and their functions. I n: Taylor A ed. Neurophysiology of the jaws and teeth. London: Macmillan Press, 1 990. 52
, http://www.100md.com
[2] Maeda T, Kobayshi S. Innervation of periodontal ligament and dent a l pulp in the rat incisor: An immunohistochemical investigation. Cell Tissue Res , 1988,251;13
[3] Schlaepfer WW, Freeman LA. Neurofilament protein of rat periphera l nerve and spinal cord. J Cell Biol, 1978,78:653
[4] Sakata S, Kamio E. Fiber diameters and response of single units i n the periodontal nerve of the cat mandibular canine. Bull Tokyo Dent Coll, 1970 ,11;223
, http://www.100md.com
[5] Kato T, Ichikawa H, Wakisaka S, et al. The distribution of va soactive intestinal polypeptide and calcitonin gene-related peptide in the perio dontal ligament of mouse molar teeth. Arch Oral Biol, 1990,35:63
[6] 王莉梅， 王满恩，刘鼎新. 三叉神经节细胞在牙及牙周膜中的纤维投射实 验. 中华口腔医学杂志，1992，4：198
[7] 孙剑，杨宏军，林珠. 大鼠磨牙正常牙周膜感觉神经分布. 实用口腔医学 杂志，1997，1：16
[8] Maeda T, Iwanaga T, Fujita T, et al. Distribution of nerve fi be rs immunoreactive to neurofilament protein in rat molars and periodontium. Cell Tissue Res, 1987,249:13
, 百拇医药
[9] Rhodin J. Histology, A text and atlas. New York: Oxford Universit y press, 1973.294
[10] Fried K, Arvidsson J, Robertson B, et al. Combined retrograde tracing and enzyme/immunohistochemistry of trigeminal ganglion cell bodies inn ervating tooth pulps in the rat. Neuroscience, 1989, 33:101
收稿日期：1999-10-29, http://www.100md.com
单位：樊成涛(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；段银钟(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；金岩(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；孙应明(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；李媛(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：牙齿；牙髓；牙周；神经丝蛋白；免疫组织化学；大鼠
牙体牙髓牙周病学杂志000309 【摘 要】 目的：观察大鼠磨牙及牙周组织神 经纤维分布 特点。方法：大鼠磨牙及其牙槽骨脱钙后切片并行神经丝蛋白(NFP)免疫 组织化学染色。结果：大鼠磨牙、牙周膜及牙龈中神经纤维丰富，神经 丝蛋白阳性神经纤维在髓角处形成牙本质细胞下丛，其中一些神经纤维进 入牙本质。在牙周膜，神经丝蛋白阳性神经纤维在牙根下段密集分布。在牙周膜内存在两型 神经末梢：游离神经末梢及Ruffini终末。前者在整个牙周膜内皆有分布，后者常成组地局 限分布在牙根下1/3。在游离龈中神经丝蛋白阳性神经呈丛状分布，在靠近结合上皮处分布 更为密集。结论：神经丝蛋白阳性神经纤维在牙齿及其支持组织的不同部位形态和数量不同，具有特征性分布。
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【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)03-0143-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，2000,10(3)：143]
Distribution of nerve fibers in rat molar and periodontium: An immunohistochemical investigation of neurofilament protein
FAN Cheng-tao, DUAN Yin-zhong, JIN Yan, et al
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
, 百拇医药
【Abstract】 AIM: To investigate the distribution characters of nerve fibers in rat molar and periodontium. METHODS: Decalcified material inc luding the alveolar bone was sectioned and stained by means of immunohistochemis try for detection of the neurofilament protein(NFP). RESULTS: There were plenty of nerve fibers in rat molars, periodontal ligament and gingiva. NFP-positive nerve fibers formed a s ubodontoblastic plexus in the roof area of the dental pulp. Some of them entered the predentin and dentin directly through the dentinal tubules. In the periodon tal ligament, NFP-positive nerve fibers were found densely distributed in the lo wer half of the alveolar socket. Two types of nerve terminals were recognized in the periodontal ligament: free nerve endings and Ruffini endings. The former distributed in the whole periodontal ligament. The latter was locat ed to the lower third of the alveolar socket. A plexus of NFP-positive nerves was revealed in the free gingiva, the i nnervation being denser toward the epithelium of the gingiva crevice. CONCLUSIO N: The teeth and surrounding tissues have characteristic distribution of NFP-immunoreactive nerve fibers.
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【Key words】 teeth; dental pulp; periodontium; nuerofil ament protein;immunohistochemistry; rat
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2000,10(3):143]
牙体组织有丰富的神经分布，牙髓神经主要是痛感受器，而牙 周神 经除了感受痛觉以外，还对触压觉有反应。牙齿及牙周组织神经的分布特征一直是口腔研究 工作者感兴趣的课题， 它对弄清牙齿的痛觉感受、口腔反射等具有重要作用，但是由于神经染色技术的不完 善，目前对牙齿及牙周组织神经的分布还缺乏详细的介绍，在某些方面仍然存在争议[ 1]。
由于抗神经丝蛋白(neurofliament protein,NFP)免疫组化染色方法观察神经结构比其它形 态学方法清晰，并且其免疫活性不因组织脱钙而降低[2]，所以本实验采用抗NFP 免疫组织化学染色方法，观察大鼠磨牙及牙周组织神经纤维的分布。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验动物
健康雌性SD大鼠16只，体重(200±10)g。
1.2 实验仪器
冰冻切片机，Olympus 双目显微镜及其显微照像系统。
1.3 样本固定及免疫组织化学染色
实验大鼠用速眠新(0.8ml/kg)肌肉注射后深度麻醉，40g/L多聚甲醛心脏灌注固定后，立即 取上颌骨浸入上述固定液内固定24h，4mol/L甲酸和0.5mol/L甲酸钠溶液脱钙5d，去除多 余组织块保留磨牙及牙周组织，入300g/L蔗糖缓冲液过夜，按近远中向做冰冻切片，厚40 μm，常规ABC法免疫组织化学染色。用正常羊血清替代一抗，进行完全相同的免疫组织 化学染色，苏木精衬染胞核。
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2 结果
2.1 抗体替代对照实验均为阴性
2.2 牙髓及牙本质神经支配
来源于上齿槽神经分支的粗大的NFP免疫反应阳性(NFP-IR)神经束从根尖孔进入牙髓，也有 部分神经从侧支根管进入。神经纤维束在根髓中部穿过并发出少量细小的树状分支(图1)， 到达冠髓后在多细胞层下方成扇形分开，分支成小束，最后在髓角处形成Raschkow丛，其中 ，一些神经纤维穿过牙本质细胞层垂直进入前期牙本质及钙化牙本质，也有少数的神经纤维 沿牙髓-牙本质界走行一段后进入牙本质，也有一些神经纤维在前期牙本质中折返(图2 )。
2.3 牙周膜神经支配
牙周膜NFP-IR神经数量少于牙髓，且根尖1/3处较多，较粗的神经纤维位于牙周膜中部稍偏 向牙槽骨侧，并向牙骨质方向发出较细的分支，常伴血管分布(图3)。其来源为根尖神经的 分支，也有一部分穿过牙槽骨壁的孔洞进入牙周膜。
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图1 成束的NFP-IR神经纤维走行于根髓中部，并发出树状分支支配根髓 ×20
图2 大鼠磨牙牙髓腔，示Raschkow丛，一些神经纤维进入牙本质 ×40
图3 大鼠磨牙远中牙周膜，示一些较粗的神经纤维发出分支朝向牙骨质 ×40
图4 大鼠磨牙根尖部，示Ruffini小体与游离神经末梢共存 ×40
图5 大鼠磨牙根分叉，示NFP-IR神经束自髓室底的小孔进入并支配牙髓 ×20
, 百拇医药
图6 大鼠游离龈，示NFR-IR在靠近结合上皮处密集排列，一些神经纤维进入结合上皮层 ×20
在牙周膜里可观察到两种神经终末：一种为较细的游离神经末梢，多数 纵向走行于牙周膜内 ，少数弯曲走行，呈串珠或条索状，在牙周膜的各个部位皆可看到；另外一种分布在牙周膜 下1/3处，尤其根尖附近，与游离神经末梢常共存，常成组分布，形态不规则，终末突触小 结呈树状、把手状或钟状分支，终末部膨大，边缘可见明显的皱褶，似桑椹状，在牙髓内未 见此种神经末梢存在(图4)。
根分叉处牙周膜神经纤维较少，多为游离神经末梢，也可看到成束的神经纤维经髓室底的小 管进入牙髓(图5)。
2.4 牙龈神经纤维
牙龈的神经纤维丰富，主要是游离神经末梢，分布呈丛状，在靠近结合上皮处，神经纤维更 加密集并朝向结合上皮平行排列(图6)，有的也进入结合上皮层，但是在龈乳头处神经纤维 分布较少，仅可见散在的神经末梢。
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3 讨论
神经丝蛋白属神经元胞浆内的中间丝成分，由Mr分别为6.8×104、14.5×104及20 ×104的三联多肽组成[3]，本实验清晰地观察到牙髓和牙周组织含有大量的NFP -IR神经纤维，表明NFP可用于牙齿及牙周神经纤维的研究。
关于牙周膜神经纤维的分布历来存在争议，Sakata[4]认为在牙周膜中部神经纤维 较多，而Kato[5]认为根尖1/3牙周神经纤维最多，并且在根分叉区牙周膜无神 经纤维分布。本实验发现，在根尖1/3神经纤维分布最密集，但在根分叉区牙周膜内仍然 有 少量神经纤维分布，同时有一些神经纤维束穿过髓室底部的小管进入并支配牙髓组织，这种 现象在既往文献中未见报道，对解释牙髓牙周综合征的发生机理及疼痛特点提供了形态学上 的依据，但是人磨牙是否具有类似的结构尚需进一步研究。
, 百拇医药
王莉梅[6]通过顺行性自显影神经解剖示踪术观察到牙周膜神经纤维靠近牙骨质， 但孙剑[7]通过降钙素基因相关肽(CGRP)免疫组织化学研究发现神经纤维分布靠近 牙槽骨侧，本实验中牙周膜内较粗的神经纤维干位于牙周膜中部偏牙槽骨侧，其分支向牙骨 质延伸，显示了神经纤维在牙周膜内的完整结构，而以上两种不同的观点可 能为所观察到的神经纤维属于不同节段的神经纤维。
Maeda[8]观察到大鼠牙周膜内存在把手状或钟状膨大的神经末梢，但未发现在人 牙周膜内存在的环形终末，而王莉梅发现大鼠牙周膜含有环状或盘旋状的神经终末，本实验 发现大鼠牙周膜里存在两种神经末梢，即游离神经末梢和终末膨大的神经末梢，后者根据其 形态及分布，可以判定是一种机械感受器——Ruffini终末，但未观察到环状的终末。以上 结果的 差异可能为研究方法的不同及种属的差异所致。牙周膜内两种不同的神经终末具有不同的生 理功能，Ruffini终末属于牵张感受器，对触压觉及机械形变起反应，并参与痛前感觉 [9]，而游离神经末梢主要是对痛觉起反应。
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另外，本实验观察到在游离龈里近结合上皮处神经纤维丰富，表明其对维护牙周内环境的稳 定起重要作用，而在龈乳头处较少，这与临床上患者的主观反应一致。
传统的观念认为牙髓神经主要为痛觉感受，但Fried[10]认为，一些牙髓神经可 能 调控“痛前感受”以及一些非伤害性神经功能，诸如传递参与咀嚼控制的机械感受，本实验 在髓角处观察到有一些神经纤维进入牙本质，表明髓角处比其他部位敏感，但是牙本质神经 是否参与了以上这些功能并不清楚，有待于继续深入探索。
国家自然科学基金资助课题(95070770)
【参考文献】
[1] Linden RWA. Periodontal mechanoreceptors and their functions. I n: Taylor A ed. Neurophysiology of the jaws and teeth. London: Macmillan Press, 1 990. 52
, http://www.100md.com
[2] Maeda T, Kobayshi S. Innervation of periodontal ligament and dent a l pulp in the rat incisor: An immunohistochemical investigation. Cell Tissue Res , 1988,251;13
[3] Schlaepfer WW, Freeman LA. Neurofilament protein of rat periphera l nerve and spinal cord. J Cell Biol, 1978,78:653
[4] Sakata S, Kamio E. Fiber diameters and response of single units i n the periodontal nerve of the cat mandibular canine. Bull Tokyo Dent Coll, 1970 ,11;223
, http://www.100md.com
[5] Kato T, Ichikawa H, Wakisaka S, et al. The distribution of va soactive intestinal polypeptide and calcitonin gene-related peptide in the perio dontal ligament of mouse molar teeth. Arch Oral Biol, 1990,35:63
[6] 王莉梅， 王满恩，刘鼎新. 三叉神经节细胞在牙及牙周膜中的纤维投射实 验. 中华口腔医学杂志，1992，4：198
[7] 孙剑，杨宏军，林珠. 大鼠磨牙正常牙周膜感觉神经分布. 实用口腔医学 杂志，1997，1：16
[8] Maeda T, Iwanaga T, Fujita T, et al. Distribution of nerve fi be rs immunoreactive to neurofilament protein in rat molars and periodontium. Cell Tissue Res, 1987,249:13
, 百拇医药
[9] Rhodin J. Histology, A text and atlas. New York: Oxford Universit y press, 1973.294
[10] Fried K, Arvidsson J, Robertson B, et al. Combined retrograde tracing and enzyme/immunohistochemistry of trigeminal ganglion cell bodies inn ervating tooth pulps in the rat. Neuroscience, 1989, 33:101
收稿日期：1999-10-29, http://www.100md.com