自体骨髓基质细胞用于牙周骨缺损移植的动物实验研究
作者：刘宏伟 欧龙 庞劲凡 袁志萍
单位：刘宏伟(第一军医大学南方医院，广东 广州 510515)；欧龙(解放军总医院，北京 100853)；庞劲凡(解放军总医院，北京 100853)；袁志萍(解放军总医院，北京 100853)
关键词：牙周病； 细胞移植； 骨再生
牙体牙髓牙周病学杂志000301 【摘 要】 目的：应用分离的骨髓干细胞(MSC) 进行牙周骨缺损的自体移植动物实验，观察MSC用于牙周再生治疗的可行性。方 法：体外分离狗髂骨的MSC，体外培养，移植前进行MSC的体外钙化实验，以胶 原膜为移植载体，将MSC移植到狗下颌后牙的根分叉骨缺损中，覆盖国产聚四氟乙烯膜，30 d后进行组织学观察。结果：分离的MSC在体外均出现了不同程度的 钙化；动物实验结果发现， MSC移植组达到了骨缺损的完全修复，无根面吸收；对照组骨 再生高度明显低于实验组(P<0.01)，并有上皮结缔组织长入。两组均有明显的新生牙 骨质的形成。结论：MSC移植可加快牙槽骨的再生，治疗牙周骨缺损的研究和应用是可行的。MSC 有望成为牙周再生细胞的体外来源。
, http://www.100md.com
【中图号】 R781.4 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)03-0117-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，2000，10(3)：117]
The study of bone marrow stem cells transplantation on
alveolar bone defect in dogs
LIU Hong-wei, OU Long, PANG Jin-fan，et al
Nanfang Hospital, The First Military Me dical Univesity, Guangzhou, 510515
, 百拇医药
【Abstract】 AIM： To evaluate the effect of transplantation of bone marrow stem cells on regen eration of periodontal bone defect. METHODS: MSC was i solated from iliac marrow of two dogs. Cells were cultured and mineralized in vitro treated with dexamethasone， -Glycerophosphate and ascorbic acid .In the mean time， cells were transplanted into the furcation bone defec ts using collegen carrier and e-pTFE membrane were covered. The histological obs ervation was carried out after 30 days. RESULTS: MSC show e d the mineralized character in vitro. The bone defects transplanted w ith MSC were fully restored, and the defects in control group only covered with e -pTFE membrane were partially restored. Epithelium and connective tissue betwe en furcation and top of new bone were observed in control group. New cementum wa s formed in both groups. CONCLUSION: The periodo ntal bone defect of furcation can be fully repaired with MSC transplantation wit hout epithelium and connective growed into. The results indicated that MSC was h opeful cell source of transplantation for periodontal bone defect.
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【Key words】 periodontics； cell transplantation; bone regeneration
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2000,10(3):117]
牙周新附着和牙周组织的再生关键取决于牙周膜细胞(periodontal ligament cell, PDLC )，在老年人牙周缺损和较大面积的牙周缺损病例中，尽管采取某些方法，如引导组织再 生和生物因子等方法，但由于PDLC来源受到限制，因此影响到组织修复的速度和量。骨髓中 的干细胞(bone marrow stem cell，MSC)具有多方向的分化能力，已有应用该细胞的 移植修复骨组织和软骨组织缺损的报道[1]。本实验将分离的狗髂骨MSC用于狗自体 牙周缺损的修复，观察该细胞在牙周组织修复中的作用。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 骨髓间充质细胞的分离
成年雄性狗2只，各抽取髂骨骨髓20ml，放于含有20ml DMEM (低糖)培养液(内含 肝素3000U/ml)的50ml离心管内，1000r/min离心5min，去上清液。细胞沉淀用700ml/L Percol(Sigma公司)梯度离心， 460×g，15min。该梯度离心将细胞分为3层，其中最 上一层为低密度层，富含MSC，将该层吸出，培养液洗，放入含有100ml/L小牛血清和抗菌素 的低糖DMEM中静置培养5d后换液，3d换液1次；骨髓分离细胞约8d后形成单独的细胞群 ，每个细胞群称为细胞克隆；2个个体共有细胞群9个(4个+5个)。细胞呈梭形。15d后 胰酶消化，收集细胞传代，分别进行体外钙化实验和狗自体牙周骨缺损移植。
1.2 MCS体外钙化实验
96孔培养板，每孔接种细胞5×103, 共接种40孔，用含有β-磷酸甘油(10mmol/ L)，实验用地塞米松(10-8mol/L)，抗坏血酸(50mg/L)(Sigma公司)的DMEM 培养液进行培养，3d换液1次，28d时中止培养，饱和茜红素(pH 4.3)染色，观察细胞体 外钙化情况。
, 百拇医药
1.3 MSC移植
将胶原膜(中科院医学生物研究所提供)置于24孔培养板中，细胞接种浓度2×104/cm 2，培养24h。
成年雄性狗2只，以双侧下颌4、5、6牙为实验用牙，共12个，随机分为实验组和对 照 组，每组各6个牙。实验组：骨缺损内放置附着有MSC细胞的胶原膜并覆盖聚四氟乙烯膜；对 照组：仅覆盖聚四氟乙烯膜。手术方法：翻开龈瓣，暴露牙槽骨，用圆钻去除部分根分叉的 牙槽骨和颊侧部分牙槽骨，其骨缺损范围：骨缺损上端距根分叉底部约5mm左右，根分叉的 颊 舌向深度相当于临床Ⅱ度根分叉骨缺损。彻底刮除根面牙周膜，根面刻痕。附着有MSC的胶 原膜置于骨缺损处，聚四氟乙烯膜(上海塑料研究所提供)覆盖骨缺损区域，膜边缘超出骨 缺损边缘2～3mm，龈瓣复位，缝合。术后3d肌注庆大霉素8万单位，每天1次，共3d。30 d后处死动物，标本分切，脱钙，组织切片，Mallory染色。
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2 结果
体外培养28d后，40孔MSC细胞均有不同程度的钙化，说明用于移植的细胞有 向骨样细胞分化的能力。
动物实验的结果表明，实验组除1个牙的聚四氟乙烯膜脱落，造成上皮和结缔组织长 入外，其它均达到了骨缺损的完全修复(图1)。对照组均未达到骨缺损的完全修复，根分 叉与 新 生骨之间未修复区域长度平均有(1.5士0.21)mm，其间有牙龈结缔组织和牙龈上皮组织覆盖 (图2)。两组中与骨再生相邻的根面均有明显的新生牙骨质(图3)。实验组未见根面吸收 现 象。统计(t检验)结果显示，两组的骨缺损高度无显著性差异，而骨再生高度和二 组的比值均有显著性差异(P<0.01)(表1)。
表1 两组骨缺损与骨再生的比例[骨再生高度(mm)/原骨缺损高度(mm),BR/BD] 牙数
1
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2
3
4
5
6
实验组
5.5/5.5
6.1/6.1
5.8/5.8
6.4/6.4
5.4/5.4
5.8±0.41/5. 8±0.41
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对照组
4.2/5.3
4.5/6.2
4.5/6.0
4.2/5.5
4.6/5.8
3.8/5.1
4.3±0.30/5.7±0.42
图1 MSC移植组的根分叉骨缺损已完全修复(Mallor染色，×4)
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图2 对照组的根分叉骨缺损未完全修复，有上皮组织和结缔组织长入(Mallor染色，×4)
图3 两组均有较明显的新生牙骨质(Mallor染色，×40)
3 讨论
牙周病治疗的最终目的是恢复正常牙周组织的结构关系和功能。现有的牙周治疗方法包 括引导牙周组织再生技术，尚无法使大部分病例，尤其是老年人和牙周病晚期病例的牙槽骨 得到完全或理想的恢复，其主要原因之一是由于牙周缺损内参与牙周组织再生细胞的数量 和来源不足。牙周组织的再生是一个十分复杂的过程，包括软组织、上皮、硬组织的再生和 功 能重建，其中牙骨质和牙槽骨的再生是恢复牙周正常附着和功能的关键。 MSC细胞具有多 向分化的能力，在不同的环镜和相应的细胞因子的作用下可分别分化成骨细胞、肌细胞、软 骨细胞、脂肪细胞等[1,2]。 Wakitanil等[3]应用分离的兔MSC进行膝软 骨缺损的自体移植，取得了缺损修复的理想效果。Caplan[4]也指出了MSC移植用于 某些组织 修复的优越性和可行性。我们根据MSC多向分化的特点，假设MSC可成为牙周组织再生的细胞 来源，对其进行牙周组织缺损细胞移植的初步研究，以探讨其可行性，为进一步的深入研究 奠定基础。
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引导组织再生技术在牙周组织缺损的部分病例中(包括本实验骨缺损形式的根分叉Ⅱ度 病变)有较好的疗效，其重要因素之一在于应用材料的好坏。在我们以往的实验中发现，国 产聚四氟乙烯膜由于在结构上与国外的同类产品有较大的差别，其虽有一 定的引导组织再生的作用，但由于领口结构和膜本身的缺陷，在阻挡上皮细胞根移和非骨性 结缔组织长入方面有很大的不足，进而影响了骨组织的再生[5]。本实验中实验组 细胞移植后30d，缺损处的骨组织已达到了完全再生，除1例膜脱落外，未发现上皮和非骨 性结缔组织长入的现象。在同样的时间内，对照组虽也有骨组织的再生，但均未达到骨缺损 的完全修复，在新生牙槽骨的上方有较多的非骨性结缔组织和上皮细胞覆盖，说明MSC的移 植加快了骨组织的再生速度，骨细胞和骨性结缔组织的较早形成，抑制和阻滞了 上皮组织和非骨性结缔组织向骨缺损内的长入。值得注意的是，MSC的移植未导致根面的吸 收，有较多的新生牙骨质形成，可能与根分叉骨缺损的牙周膜细胞来源较丰富，以及成牙骨 质与成骨细胞的同源性有关。MSC在牙周特定的环境下是否能分化为成牙骨质细胞，值得进 一步研究。
, 百拇医药
本实验的结果表明，MSC的牙周移植可加快牙槽骨的再生，有望成为牙周再生细胞的来 源，为今后牙周组织再生治疗提供新的研究方向和可能的治疗方法，关于MSC移植在牙周 组织中的作用和机制，以及细胞的来源、保存和临床应用等诸方面问题，有待进一步研究。
国家自然科学基金资助项目(39770798)和国家教委留学回国人员科研启动基金(教外 司留[1997]436号)资助课题
【参考文献】
[1] Dexster TM，Testar GM. Differentiation and proliferation of h aemopoietic cells in culture. In: Prescott DM ed. Methods in Cell Biolo gy, Vol 14.New York：Academic Press， 1976
, 百拇医药
[2] Ab I， Ashton BA， Gazii D， et al. Kinetics and di fferentiation of marrow stromal cells in diffusion chambers in vivo， Clin Orthop Rel Res， l983， 15l：294
[3] Wakiiani S， Gogo T， Pineda SJ，et al. Mesenchymal ce ll based repair of large full，thickness defects of articular cartilae. J Bone Joint Surgery,l994， 76-A(4):579
[4] Caplan AI. The mesengenic process. Clin Plast Surg, l 994，2l:429
[5] 欧龙，刘宏伟，袁志萍,等. 牙周组织再生的动物实验研究. 军医进修学院 学报,1999， 15(l)：15
收稿日期：1999-08-17, http://www.100md.com
单位：刘宏伟(第一军医大学南方医院，广东 广州 510515)；欧龙(解放军总医院，北京 100853)；庞劲凡(解放军总医院，北京 100853)；袁志萍(解放军总医院，北京 100853)
关键词：牙周病； 细胞移植； 骨再生
牙体牙髓牙周病学杂志000301 【摘 要】 目的：应用分离的骨髓干细胞(MSC) 进行牙周骨缺损的自体移植动物实验，观察MSC用于牙周再生治疗的可行性。方 法：体外分离狗髂骨的MSC，体外培养，移植前进行MSC的体外钙化实验，以胶 原膜为移植载体，将MSC移植到狗下颌后牙的根分叉骨缺损中，覆盖国产聚四氟乙烯膜，30 d后进行组织学观察。结果：分离的MSC在体外均出现了不同程度的 钙化；动物实验结果发现， MSC移植组达到了骨缺损的完全修复，无根面吸收；对照组骨 再生高度明显低于实验组(P<0.01)，并有上皮结缔组织长入。两组均有明显的新生牙 骨质的形成。结论：MSC移植可加快牙槽骨的再生，治疗牙周骨缺损的研究和应用是可行的。MSC 有望成为牙周再生细胞的体外来源。
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【中图号】 R781.4 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)03-0117-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，2000，10(3)：117]
The study of bone marrow stem cells transplantation on
alveolar bone defect in dogs
LIU Hong-wei, OU Long, PANG Jin-fan，et al
Nanfang Hospital, The First Military Me dical Univesity, Guangzhou, 510515
, 百拇医药
【Abstract】 AIM： To evaluate the effect of transplantation of bone marrow stem cells on regen eration of periodontal bone defect. METHODS: MSC was i solated from iliac marrow of two dogs. Cells were cultured and mineralized in vitro treated with dexamethasone， -Glycerophosphate and ascorbic acid .In the mean time， cells were transplanted into the furcation bone defec ts using collegen carrier and e-pTFE membrane were covered. The histological obs ervation was carried out after 30 days. RESULTS: MSC show e d the mineralized character in vitro. The bone defects transplanted w ith MSC were fully restored, and the defects in control group only covered with e -pTFE membrane were partially restored. Epithelium and connective tissue betwe en furcation and top of new bone were observed in control group. New cementum wa s formed in both groups. CONCLUSION: The periodo ntal bone defect of furcation can be fully repaired with MSC transplantation wit hout epithelium and connective growed into. The results indicated that MSC was h opeful cell source of transplantation for periodontal bone defect.
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【Key words】 periodontics； cell transplantation; bone regeneration
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2000,10(3):117]
牙周新附着和牙周组织的再生关键取决于牙周膜细胞(periodontal ligament cell, PDLC )，在老年人牙周缺损和较大面积的牙周缺损病例中，尽管采取某些方法，如引导组织再 生和生物因子等方法，但由于PDLC来源受到限制，因此影响到组织修复的速度和量。骨髓中 的干细胞(bone marrow stem cell，MSC)具有多方向的分化能力，已有应用该细胞的 移植修复骨组织和软骨组织缺损的报道[1]。本实验将分离的狗髂骨MSC用于狗自体 牙周缺损的修复，观察该细胞在牙周组织修复中的作用。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 骨髓间充质细胞的分离
成年雄性狗2只，各抽取髂骨骨髓20ml，放于含有20ml DMEM (低糖)培养液(内含 肝素3000U/ml)的50ml离心管内，1000r/min离心5min，去上清液。细胞沉淀用700ml/L Percol(Sigma公司)梯度离心， 460×g，15min。该梯度离心将细胞分为3层，其中最 上一层为低密度层，富含MSC，将该层吸出，培养液洗，放入含有100ml/L小牛血清和抗菌素 的低糖DMEM中静置培养5d后换液，3d换液1次；骨髓分离细胞约8d后形成单独的细胞群 ，每个细胞群称为细胞克隆；2个个体共有细胞群9个(4个+5个)。细胞呈梭形。15d后 胰酶消化，收集细胞传代，分别进行体外钙化实验和狗自体牙周骨缺损移植。
1.2 MCS体外钙化实验
96孔培养板，每孔接种细胞5×103, 共接种40孔，用含有β-磷酸甘油(10mmol/ L)，实验用地塞米松(10-8mol/L)，抗坏血酸(50mg/L)(Sigma公司)的DMEM 培养液进行培养，3d换液1次，28d时中止培养，饱和茜红素(pH 4.3)染色，观察细胞体 外钙化情况。
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1.3 MSC移植
将胶原膜(中科院医学生物研究所提供)置于24孔培养板中，细胞接种浓度2×104/cm 2，培养24h。
成年雄性狗2只，以双侧下颌4、5、6牙为实验用牙，共12个，随机分为实验组和对 照 组，每组各6个牙。实验组：骨缺损内放置附着有MSC细胞的胶原膜并覆盖聚四氟乙烯膜；对 照组：仅覆盖聚四氟乙烯膜。手术方法：翻开龈瓣，暴露牙槽骨，用圆钻去除部分根分叉的 牙槽骨和颊侧部分牙槽骨，其骨缺损范围：骨缺损上端距根分叉底部约5mm左右，根分叉的 颊 舌向深度相当于临床Ⅱ度根分叉骨缺损。彻底刮除根面牙周膜，根面刻痕。附着有MSC的胶 原膜置于骨缺损处，聚四氟乙烯膜(上海塑料研究所提供)覆盖骨缺损区域，膜边缘超出骨 缺损边缘2～3mm，龈瓣复位，缝合。术后3d肌注庆大霉素8万单位，每天1次，共3d。30 d后处死动物，标本分切，脱钙，组织切片，Mallory染色。
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2 结果
体外培养28d后，40孔MSC细胞均有不同程度的钙化，说明用于移植的细胞有 向骨样细胞分化的能力。
动物实验的结果表明，实验组除1个牙的聚四氟乙烯膜脱落，造成上皮和结缔组织长 入外，其它均达到了骨缺损的完全修复(图1)。对照组均未达到骨缺损的完全修复，根分 叉与 新 生骨之间未修复区域长度平均有(1.5士0.21)mm，其间有牙龈结缔组织和牙龈上皮组织覆盖 (图2)。两组中与骨再生相邻的根面均有明显的新生牙骨质(图3)。实验组未见根面吸收 现 象。统计(t检验)结果显示，两组的骨缺损高度无显著性差异，而骨再生高度和二 组的比值均有显著性差异(P<0.01)(表1)。
表1 两组骨缺损与骨再生的比例[骨再生高度(mm)/原骨缺损高度(mm),BR/BD] 牙数
1
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实验组
5.5/5.5
6.1/6.1
5.8/5.8
6.4/6.4
5.4/5.4
5.8±0.41/5. 8±0.41
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对照组
4.2/5.3
4.5/6.2
4.5/6.0
4.2/5.5
4.6/5.8
3.8/5.1
4.3±0.30/5.7±0.42
图1 MSC移植组的根分叉骨缺损已完全修复(Mallor染色，×4)
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图2 对照组的根分叉骨缺损未完全修复，有上皮组织和结缔组织长入(Mallor染色，×4)
图3 两组均有较明显的新生牙骨质(Mallor染色，×40)
3 讨论
牙周病治疗的最终目的是恢复正常牙周组织的结构关系和功能。现有的牙周治疗方法包 括引导牙周组织再生技术，尚无法使大部分病例，尤其是老年人和牙周病晚期病例的牙槽骨 得到完全或理想的恢复，其主要原因之一是由于牙周缺损内参与牙周组织再生细胞的数量 和来源不足。牙周组织的再生是一个十分复杂的过程，包括软组织、上皮、硬组织的再生和 功 能重建，其中牙骨质和牙槽骨的再生是恢复牙周正常附着和功能的关键。 MSC细胞具有多 向分化的能力，在不同的环镜和相应的细胞因子的作用下可分别分化成骨细胞、肌细胞、软 骨细胞、脂肪细胞等[1,2]。 Wakitanil等[3]应用分离的兔MSC进行膝软 骨缺损的自体移植，取得了缺损修复的理想效果。Caplan[4]也指出了MSC移植用于 某些组织 修复的优越性和可行性。我们根据MSC多向分化的特点，假设MSC可成为牙周组织再生的细胞 来源，对其进行牙周组织缺损细胞移植的初步研究，以探讨其可行性，为进一步的深入研究 奠定基础。
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引导组织再生技术在牙周组织缺损的部分病例中(包括本实验骨缺损形式的根分叉Ⅱ度 病变)有较好的疗效，其重要因素之一在于应用材料的好坏。在我们以往的实验中发现，国 产聚四氟乙烯膜由于在结构上与国外的同类产品有较大的差别，其虽有一 定的引导组织再生的作用，但由于领口结构和膜本身的缺陷，在阻挡上皮细胞根移和非骨性 结缔组织长入方面有很大的不足，进而影响了骨组织的再生[5]。本实验中实验组 细胞移植后30d，缺损处的骨组织已达到了完全再生，除1例膜脱落外，未发现上皮和非骨 性结缔组织长入的现象。在同样的时间内，对照组虽也有骨组织的再生，但均未达到骨缺损 的完全修复，在新生牙槽骨的上方有较多的非骨性结缔组织和上皮细胞覆盖，说明MSC的移 植加快了骨组织的再生速度，骨细胞和骨性结缔组织的较早形成，抑制和阻滞了 上皮组织和非骨性结缔组织向骨缺损内的长入。值得注意的是，MSC的移植未导致根面的吸 收，有较多的新生牙骨质形成，可能与根分叉骨缺损的牙周膜细胞来源较丰富，以及成牙骨 质与成骨细胞的同源性有关。MSC在牙周特定的环境下是否能分化为成牙骨质细胞，值得进 一步研究。
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本实验的结果表明，MSC的牙周移植可加快牙槽骨的再生，有望成为牙周再生细胞的来 源，为今后牙周组织再生治疗提供新的研究方向和可能的治疗方法，关于MSC移植在牙周 组织中的作用和机制，以及细胞的来源、保存和临床应用等诸方面问题，有待进一步研究。
国家自然科学基金资助项目(39770798)和国家教委留学回国人员科研启动基金(教外 司留[1997]436号)资助课题
【参考文献】
[1] Dexster TM，Testar GM. Differentiation and proliferation of h aemopoietic cells in culture. In: Prescott DM ed. Methods in Cell Biolo gy, Vol 14.New York：Academic Press， 1976
, 百拇医药
[2] Ab I， Ashton BA， Gazii D， et al. Kinetics and di fferentiation of marrow stromal cells in diffusion chambers in vivo， Clin Orthop Rel Res， l983， 15l：294
[3] Wakiiani S， Gogo T， Pineda SJ，et al. Mesenchymal ce ll based repair of large full，thickness defects of articular cartilae. J Bone Joint Surgery,l994， 76-A(4):579
[4] Caplan AI. The mesengenic process. Clin Plast Surg, l 994，2l:429
[5] 欧龙，刘宏伟，袁志萍,等. 牙周组织再生的动物实验研究. 军医进修学院 学报,1999， 15(l)：15
收稿日期：1999-08-17, http://www.100md.com