导入多药耐药基因提高脐血单个核细胞对柔红霉素的抗性
作者：杨旭伟 陈元仲 林振兴 胡建达 吕联煌 梁敏 吴勇
单位：杨旭伟 陈元仲 林振兴 胡建达 吕联煌 梁敏 吴勇(福建医科大学附属协和医院福建省血液病研究所 福州 350001)
关键词：逆转录病毒；基因；mdr1； 造血细胞
中国肿瘤生物治疗杂志000317
《中国图书资料分类法》分类号 R730.5
多药耐药基因1(mdr1)编码的P170是能量依赖的药物外排泵，是导致肿瘤细胞产生多药耐药的重要机制之一。本文将mdr1基因导入脐血单个核细胞，以期能提高其对化疗药物的抗性。
1 材料与方法
1.1 制备逆转录病毒上清
, 百拇医药
用lipofectAMINE介导pHamdr1/A导入PA317细胞(pHamdr1/A质粒由美国国立癌症研究所Dr Ira Pastan 惠赠)。经60 ng/ml秋水仙素筛选出抗性克隆。用3T3细胞检测出病毒滴度为1.3×104 CFU/ml[1]。
1.2 病毒感染脐血单个核细胞
用比重为1.063的Ficoll-Hypaque分离脐血中单个核细胞,在含rhSCF,rhIL-3,rhIL-6的DMEM体系培养48 h以后，换用含polybrene及同样细胞因子的病毒上清。2.5 h后加3倍体积完全培养基，培养2～3 d，备用。
1.3 用流式细胞仪检测转基因脐血单个核细胞P170表达。
1.4 转基因脐血单个核细胞的CFU-GM培养
, 百拇医药
在含rhIL-3，rhIL-6，rhSCF，rhGM-CSF的0.9%甲基纤维素IMDM体系中加入转基因单个核细胞2×105/孔，在含不同浓度柔红霉素环境中培养2周，计数含50个细胞以上的集落数[2]。
1.5 MTT法检测转基因脐血单个核细胞IC50
96孔板中每孔接种2×105转基因单个核细胞，在含柔红霉素的DMEM中培养72 h后加MTT,4 h后加DMSO，在酶标仪上测OD492值，用SPSS软件分析结果。
1.6 Rhodamine123(Rho)外排实验
转基因脐血单个核细胞在含0.02%Rho的DMEM体系中培养20 min后，用冰冷PBS洗2次，再将细胞置于无Rho环境，用流式细胞仪测此后0，15，30，60及120 min细胞内绿荧光强度[3]。
, http://www.100md.com
2 结果与讨论
转基因细胞P170阳性率为7.8%，而对照细胞为1.34%。Rho外排实验结果如下：在脱离Rho环境后0，15，30，60及120 min，转基因细胞Rho阳性率依次为68.7%，41.1%，40.3%，38.9%，29.8%，而对照细胞则依次为64.9%，61.7%，59.8%，57.4%，40.4%。上述结果表明，导入细胞内的mdr1基因能在细胞膜上表达，并且表达的P170能将细胞内的Rho泵出到细胞外。MTT法测定的柔红霉素对转基因细胞的IC50为21.12 μg/ml，而柔红霉素对对照细胞的IC50为13.48 μg/ml，转基因细胞对柔红霉素的抗性是对照细胞的1.57倍。
转基因脐血单个核细胞在含柔红霉素的半固体培养基中形成CFU-GM的结果表明，转基因细胞在含柔红霉素环境中形成CFU-GM能力高于对照细胞(经配对t检验,P<0.05)。
, http://www.100md.com
表1 转mdr1基因脐血单个核细胞在含柔红霉素
的培养体系形成CFU-GM的能力(
±s，n=6) 柔红霉素浓度
(ng/ml)
CFU-GM(克隆/2×105单个核细胞)
转基因细胞
对照细胞
0
112±20
123±10
10
, http://www.100md.com
78±18
47±6
30
60±8
38±4
90
18±2
0
人mdr1基因编码的P170能将亲脂性药物从细胞内泵出到细胞外，从而使细胞产生耐药。正常造血干/祖细胞中mdr1基因表达丰度低或基本不表达。如果将mdr1基因导入造血细胞就可在肿瘤化疗中保护正常造血细胞。脐血中富含造血细胞，且来源丰富，引起了人们的重视。我们分离的脐血单个核细胞除含CD34+细胞(占1.35%)外，还含粒细胞系、红细胞系及巨核细胞系的早期细胞。虽然，转基因细胞在无柔红霉素环境中形成CFU-GM的能力与对照细胞相近，转基因细胞对柔红霉素的抗性比对照细胞强，但是一旦转基因细胞移植入活体后是否能重建造血及有较强的化疗抗性，值得进一步探索。
, 百拇医药
逆转录病毒不能感染处于G0期的细胞，而造血干/祖细胞多数处于G0期。因此，我们用数种细胞因子激活造血细胞，便之进入增殖周期，但是，转染效率仍不理想。这种低转染效率可能与逆转录病毒滴度较低 有关。已经有文献报道可将转基因后的包装细胞置于32℃培养，并用2种包装细胞相互感染，以便提高病毒滴度。因此，提高转染效率是今后工作中努力的方向。
参 考 文 献
1，Pastan I, Gottesman MG, Ueda K, et al. A retrovirus carrying an MDR1 cDNA confers multidrug resistance and polarized expression of P-glycoprotein in MDCK cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85: 4486
2，徐有恒, 王绮如. 造血生理学和造血细胞检测技术. 长沙: 湖南科学技术出版社, 1997. 257
3，Lampidis TJ, Manck JN, Krishan A, et al. Reversal of resistance to rhodamine123 in adriamycin-resistant friend leukemia cells. Cancer Res, 1985, 45: 2626
(1999-06-15收稿； 1999-09-26修回), 百拇医药
单位：杨旭伟 陈元仲 林振兴 胡建达 吕联煌 梁敏 吴勇(福建医科大学附属协和医院福建省血液病研究所 福州 350001)
关键词：逆转录病毒；基因；mdr1； 造血细胞
中国肿瘤生物治疗杂志000317
《中国图书资料分类法》分类号 R730.5
多药耐药基因1(mdr1)编码的P170是能量依赖的药物外排泵，是导致肿瘤细胞产生多药耐药的重要机制之一。本文将mdr1基因导入脐血单个核细胞，以期能提高其对化疗药物的抗性。
1 材料与方法
1.1 制备逆转录病毒上清
, 百拇医药
用lipofectAMINE介导pHamdr1/A导入PA317细胞(pHamdr1/A质粒由美国国立癌症研究所Dr Ira Pastan 惠赠)。经60 ng/ml秋水仙素筛选出抗性克隆。用3T3细胞检测出病毒滴度为1.3×104 CFU/ml[1]。
1.2 病毒感染脐血单个核细胞
用比重为1.063的Ficoll-Hypaque分离脐血中单个核细胞,在含rhSCF,rhIL-3,rhIL-6的DMEM体系培养48 h以后，换用含polybrene及同样细胞因子的病毒上清。2.5 h后加3倍体积完全培养基，培养2～3 d，备用。
1.3 用流式细胞仪检测转基因脐血单个核细胞P170表达。
1.4 转基因脐血单个核细胞的CFU-GM培养
, 百拇医药
在含rhIL-3，rhIL-6，rhSCF，rhGM-CSF的0.9%甲基纤维素IMDM体系中加入转基因单个核细胞2×105/孔，在含不同浓度柔红霉素环境中培养2周，计数含50个细胞以上的集落数[2]。
1.5 MTT法检测转基因脐血单个核细胞IC50
96孔板中每孔接种2×105转基因单个核细胞，在含柔红霉素的DMEM中培养72 h后加MTT,4 h后加DMSO，在酶标仪上测OD492值，用SPSS软件分析结果。
1.6 Rhodamine123(Rho)外排实验
转基因脐血单个核细胞在含0.02%Rho的DMEM体系中培养20 min后，用冰冷PBS洗2次，再将细胞置于无Rho环境，用流式细胞仪测此后0，15，30，60及120 min细胞内绿荧光强度[3]。
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2 结果与讨论
转基因细胞P170阳性率为7.8%，而对照细胞为1.34%。Rho外排实验结果如下：在脱离Rho环境后0，15，30，60及120 min，转基因细胞Rho阳性率依次为68.7%，41.1%，40.3%，38.9%，29.8%，而对照细胞则依次为64.9%，61.7%，59.8%，57.4%，40.4%。上述结果表明，导入细胞内的mdr1基因能在细胞膜上表达，并且表达的P170能将细胞内的Rho泵出到细胞外。MTT法测定的柔红霉素对转基因细胞的IC50为21.12 μg/ml，而柔红霉素对对照细胞的IC50为13.48 μg/ml，转基因细胞对柔红霉素的抗性是对照细胞的1.57倍。
转基因脐血单个核细胞在含柔红霉素的半固体培养基中形成CFU-GM的结果表明，转基因细胞在含柔红霉素环境中形成CFU-GM能力高于对照细胞(经配对t检验,P<0.05)。
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表1 转mdr1基因脐血单个核细胞在含柔红霉素
的培养体系形成CFU-GM的能力(
±s，n=6) 柔红霉素浓度(ng/ml)
CFU-GM(克隆/2×105单个核细胞)
转基因细胞
对照细胞
0
112±20
123±10
10
, http://www.100md.com
78±18
47±6
30
60±8
38±4
90
18±2
0
人mdr1基因编码的P170能将亲脂性药物从细胞内泵出到细胞外，从而使细胞产生耐药。正常造血干/祖细胞中mdr1基因表达丰度低或基本不表达。如果将mdr1基因导入造血细胞就可在肿瘤化疗中保护正常造血细胞。脐血中富含造血细胞，且来源丰富，引起了人们的重视。我们分离的脐血单个核细胞除含CD34+细胞(占1.35%)外，还含粒细胞系、红细胞系及巨核细胞系的早期细胞。虽然，转基因细胞在无柔红霉素环境中形成CFU-GM的能力与对照细胞相近，转基因细胞对柔红霉素的抗性比对照细胞强，但是一旦转基因细胞移植入活体后是否能重建造血及有较强的化疗抗性，值得进一步探索。
, 百拇医药
逆转录病毒不能感染处于G0期的细胞，而造血干/祖细胞多数处于G0期。因此，我们用数种细胞因子激活造血细胞，便之进入增殖周期，但是，转染效率仍不理想。这种低转染效率可能与逆转录病毒滴度较低 有关。已经有文献报道可将转基因后的包装细胞置于32℃培养，并用2种包装细胞相互感染，以便提高病毒滴度。因此，提高转染效率是今后工作中努力的方向。
参 考 文 献
1，Pastan I, Gottesman MG, Ueda K, et al. A retrovirus carrying an MDR1 cDNA confers multidrug resistance and polarized expression of P-glycoprotein in MDCK cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85: 4486
2，徐有恒, 王绮如. 造血生理学和造血细胞检测技术. 长沙: 湖南科学技术出版社, 1997. 257
3，Lampidis TJ, Manck JN, Krishan A, et al. Reversal of resistance to rhodamine123 in adriamycin-resistant friend leukemia cells. Cancer Res, 1985, 45: 2626
(1999-06-15收稿； 1999-09-26修回), 百拇医药