急性心肌梗死猝死患者心肌细胞凋亡的研究
作者：马中富 马虹 叶任高 罗斌 朱全胜 吴金浪
单位：
马中富(中山医科大学附属第一医院，广东 广州 510080)；马虹(中山医科大学附属第一医院，广东 广州 510080)；叶任高(中山医科大学附属第一医院，广东 广州 510080)；罗斌(中山医科大学基础学院，广东 广州 510089)；朱全胜(中山医科大学基础学院，广东 广州 510089)；吴金浪(中山医科大学基础学院，广东 广州 510089)
关键词：细胞凋亡；心肌梗死；急性；猝死
中国危重病急救医学000303 摘 要：目的：探讨细胞凋亡在急性心肌梗死时心肌细胞死亡中的意义。方法：用末端原位标记(TUNEL)法、DNA电泳和电镜3种方法检测急性心肌梗死猝死患者和心脏正常的车祸死亡者心肌细胞的凋亡。结果：TUNEL法发现，猝死者梗死区的心肌细胞凋亡数(557.95±144.10)×10-3明显高于正常对照组(34.30±20.68)×10-3(P=0.000 0)；心肌细胞凋亡数在冠脉1支病变者为(506.38±175.88)×10-3<2支病变者为(554.38±92.15)×10-3<3支病变者为(668.25±127.19)×10-3，虽然均明显高于正常对照组(P均<0.05)，但3 组之间比较则无统计学差别(P均>0.05)；冠脉2～3支病变者梗死区的心肌细胞DNA电泳可见相差约180～200 bp的阶梯片段；电镜发现猝死者梗死区内的心肌细胞核膜完整、染色质浓集、电子密度增加的凋亡特征，有的则出现核膜破裂、染色质溶解成碎屑的坏死现象。结论：细胞凋亡在急性心肌梗死猝死者的心肌细胞死亡中起重要作用。
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分类号：Q255;R541.4 文献标识码：A
文章编号：1003-0603(2000)03-0137-05
Study on myocyte apoptosis in sudden death with acute myocardial infarction
MA Zhong-fu,MA Hong,YE Ren-gao
(First Affiliated Hospital,Sun Yatsen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080)
Abstract：Objective：To explore the significance of myocyte apoptosis in acute myocardial infarction (AMI).Methods：Myocyte apoptosis in patients with sudden death caused by AMI and in healthy subjects who died in traffic accident were studied by means of TdT-mediated dUTP Nick End Labeling (TUNEL),DNA laddering on agarose gel electrophoresis and electron microscopy.Results：The permillage of myocyte apoptosis measured by TUNEL in infarct area in patients with sudden death caused by AMI was significantly higher than that in control group [(557.95±144.10)×10-3 vs.(34.30±20.68)×10-3,P=0.000 0].The permillages of myocyte apoptosis in 1-vessel,2-vessel and 3-vessel disease were (506.38±175.88)×10-3,(554.38±92.15)×10-3,and (668.25±127.19)×10-3,respectively,which were significantly higher than those of control group (all P<0.05).No significant difference was found among the three groups.DNA laddering on agarose gel electrophoresis showed that the DNA fragments of about 180-200 bp were found only in those patients with involvement of two and three vessels.The electron microscopy showed that the characteristics of myocyte apoptosis included intact nuclear membrane,condensed chromatin and increased electron denes.However,some myocytes possessed the characteristics of necrosis,i.e.broken cellular membrane,dissolution of chromatin and lysis of nuclei.Conclusions：Myocyte apoptosis may play a key role in the process of myocyte death in infarct area in patients with sudden death caused by AMI.
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Key words：apoptosis;acute myocardial infarction;sudden death▲
研究已经表明，生物体细胞可以通过坏死(necrosis)或凋亡(apoptosis)而导致死亡，这两种细胞死亡的模式在功能、结构、机制和特征上有着明显的不同[1]。细胞凋亡现象早在1951年Glucksmann就已观察到，但直至1972年Kerr等[1]才提出这一概念，细胞凋亡是指局部环境、生理性或病理性刺激引起的一种受基因控制的自身程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。与坏死不同，它是一种主动的细胞死亡形式[1]，其形态特征是细胞变小、变圆、皱缩，胞浆浓集，线粒体功能丧失，细胞骨架断裂；细胞核染色质固缩和裂解，染色质密度增加并聚集在核膜周边呈半月形，染色质DNA裂解成180～200 bp及其倍数的寡核苷酸片段，琼脂糖凝胶电泳中呈梯形带(ladder pattern 或 DNA ladder)；核仁裂解，进而细胞膜内陷，将细胞分割成多个外有包膜、内有完整细胞器的小体，称为凋亡小体(apoptotic bodies)。多数凋亡小体内含有核成分，凋亡小体被邻近组织吞噬，并在其溶酶体中被降解，但无胞膜溶解及溶酶体酶释放，故不出现炎症反应[1]。随着细胞凋亡研究的深入，人们已发现许多心血管系统疾病的发生发展均与细胞凋亡有关[2]。为进一步探讨细胞凋亡在急性心肌梗死(AMI)时心肌细胞死亡中的作用，我们研究了20例AMI猝死者心肌细胞的凋亡现象。
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1 资料与方法
把法医尸解者分为研究组和正常对照组。
1.1 研究组为AMI猝死者20例，男13例，女7例；年龄37～82岁，平均(54.5±18.5)岁。冠状动脉(冠脉)病变部位及支数：左冠前降支病变(1支病变)8例，男5例，女3例，年龄37～82岁，平均(58.8±16.6)岁；左前降支+右冠病变(2支病变)8例，男4例，女4例，年龄38～56岁，平均(47.0±7.6)岁；左前降支+右冠+左冠回旋支病变(3支病变)4例，均为男性，年龄65～80岁，平均(71.0±7.0)岁。20例患者共36支血管受累，病变程度的分布为：冠脉Ⅰ级狭窄(狭窄为25%～50%)2支，Ⅱ级狭窄(狭窄50%～75%)13支，Ⅲ级狭窄(狭窄>75%)16支，Ⅳ级狭窄(冠脉完全闭塞)5支。20例中有9例血栓形成(Ⅵ级狭窄4例，Ⅲ级狭窄5例)。心脏平均重量为(365.0±74.8)g。
1.2 正常对照组10例，男7例，女3例；年龄23～60岁，平均(46.6±11.4)岁，全部死于交通事故，尸解时心肌及冠脉均正常，其中脑出血者7例，肝、脾破裂者2例，肺、胸腔、肝破裂者1例。心脏平均重量(316.3±45.2)g，明显低于研究组(P<0.01)。
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1.3 实验方法：
1.3.1 取材：死亡距尸解时间平均(29.3±13.1)小时(6～50小时)，尸解前尸体均存放于-4 ℃冰柜中，办完法律手续后即行尸解。研究组取1 mm3大小梗死组织4～5块于2.5%戊二醛液中固定以便镜检，一部分梗死块于10%甲醛液中固定以做苏木素伊红(HE)染色及免疫组化，一部分梗死块于-70 ℃下冻存以做分子生物学实验。正常对照组抽样取同样大小心肌组织4～5块，用同法进行研究。
1.3.2 HE染色：10%甲醛液中固定的组织于48～72小时内行石蜡包埋，切片4～5 μm厚，脱蜡后常规HE染色，正常的心肌组织和急性心肌细胞梗死灶内及周围白细胞浸润见图1和图2。
图1 正常心肌细胞(HE×100)
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图2 梗死灶内心肌纤维肌浆溶解，横纹消失(HE×200)
1.3.3 心肌细胞凋亡检测：用原位末端标记检测法(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)，In Site Cell Death Kit,AP(购自德国Bochringer Mannheim)，按药盒说明书操作：①10%甲醛固定的心肌组织固定、包埋、切片；②脱蜡；③消化膜蛋白及核蛋白；④加TUNEL反应混合物；⑤加入抗荧光抗体(Convertev-AP);⑥加入底物混合液；⑦复染封片。
1.3.4 心肌细胞DNA电泳：取梗死心肌块约1 g，用重蒸酚氯仿法抽提DNA，用70%的乙醇冲洗后，真空抽干，干燥后加入0.1～0.2 ml TE液溶解DNA，于2%的琼脂糖凝胶电泳，在10 V/cm电压下电泳，观察其条带。
1.3.5 凋亡的心肌细胞电镜检测：取2.5%戊二醛前固定的标本，1%锇酸固定，环氧树脂渗透后包埋，60 ℃高温聚合，用LKB超薄切片(厚度60～90 nm)，200目铜网捞片，铀铅染液染色，H-60透射电镜观察并摄片。
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1.4 统计学方法：数值用均数±标准差(
±s)表示，SPSS 6.0软件计算，结果之间的比较用单因素方差分析(One-way ANOVA Analyis)中的Student-Newman-Keuls Test,两两比较用q检验，两指标间相关性用简单相关及直线回归，P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 TUNEL法检测AMI猝死者和正常对照组心肌细胞凋亡的结果：
2.1.1 20例AMI猝死者梗死部位的心肌细胞和10例正常对照者的心肌细胞TUNEL法检测，发现凋亡的心肌细胞出现核固缩，染色质浓集，在加入抗荧光抗体后用NBT显色时，凋亡的细胞核呈紫蓝色(图3)。在每张玻片上随机选择10个区域，每个区域计数100个细胞，统计出凋亡的细胞数，再加在一起 ，即为每千个心肌细胞中凋亡的细胞数，结果见表1。AMI猝死者心肌细胞凋亡数明显高于正常对照组(P=0.0000)，提示心肌细胞凋亡在AMI心肌细胞死亡中起一定作用。
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图3 早期凋亡的心肌细胞核被标记，染色成紫蓝色(TUNEL法)
表1 TUNEL法检测AMI患者和正常对照者凋亡的心肌细胞数比较(±s) 组别
例数
(例)
凋亡心肌细胞数
(×10-3)
P值
F值
正常对照组
10
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34.30± 20.68(10～75)
0.000 0
128.476 6
研究组
20
557.95±144.10(215～807)
注：( )内为范围
2.1.2 不同冠脉病变支数猝死者心肌细胞凋亡与正常对照组之间的差异见表2。冠脉病变支数不同的AMI猝死者心肌细胞凋亡数均明显高于正常对照组(P均<0.05)，而不同支数病变的AMI猝死者之间心肌细胞凋亡数，虽然3支病变者>2支病变者>1支病变者，但均无统计学意义(P均>0.05)。
, 百拇医药 表2 不同支数冠脉病变猝死者心肌细胞凋亡数(±s) 组别
例数(例)
凋亡的心肌细胞数(×10-3)
正常对照组
10
34.30±20.68(10～75)
研究组 1支冠脉病变
8
506.38±175.88(215～793)*
2支冠脉病变
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8
554.38±92.15(377～681*
3支冠脉病变
4
668.25±127.19(521～807)*
注：与正常对照组比较：*P<0.05；F=50.098 5；( )内为范围
2.2 AMI猝死者和正常对照组心肌细胞DNA电泳：AMI猝死者心肌细胞凋亡后，核小体在核酸内切酶作用下切成大小不同的片段在电泳胶上可见相差180～200 bp梯形条带。不同支数冠脉病变者其电泳条带不同，3支、2支病变者，可见相差约180～200 bp的DNA梯形条带，而1支病变和正常对照组心肌细胞内未见相差约180～200 bp的DNA片段(图4)，这与TUNEL法观察到的结果一致，提示病变冠脉支数增多，则凋亡特征更明显。
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图4 AMI猝死者梗死区心肌细胞内DNA电泳
2.3 AMI猝死者和正常对照组心肌细胞的电镜观察：心脏正常的意外死亡者的心肌细胞电镜下核膜完整，染色质均匀，核体积约占细胞的1/3，但由于组织块在生理盐水中浸泡较久和尸解距死亡的时间较长，细胞浆有些自溶现象(图5)。而AMI猝死者的心肌细胞则胞核体积缩小，核膜仍然完整，染色质有的呈边聚现象即早期凋亡特征(图6)；有的染色质则更浓密，电子密度明显增加，结构模糊不清，但核膜仍完整，具有中期或晚期的凋亡细胞核特征(图7和图8)；有的心肌细胞可能因缺血时间过长而出现了坏死现象，即核膜破裂，染色质被溶解成坏死碎屑，胞核呈明显的空泡变(图8)。
图5 正常的心肌细胞(EM×6 782)
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图6 AMI猝死者梗死区早期凋亡的心肌细胞，可见核固缩，染色质浓缩，凝聚于核膜下呈边聚现象，核膜完整(EM×6 250)
图7 凋亡晚期的心肌细胞核，见核更加固缩，电子密度增加，染色质凝聚，胞浆内出现空泡(EM×6 244)
图8 继发性坏死的心肌细胞，凋亡晚期的心肌细胞核，见染色质浓缩，凝聚于核膜下，核出现空泡(EM×6 922)
3 讨 论
以往的观念认为AMI时，心肌细胞死亡是坏死，可是近来的研究表明，鼠、兔和人类的心肌细胞在经历长时间的缺血缺氧或缺血再灌注后，出现明显的凋亡特征[1，2]。用TUNEL和DNA电泳法[3，4]检测了AMI死亡者的心肌细胞，发现在梗死区及梗死周边区的心肌细胞中有大量TUNEL阳性的细胞，特异性的DNA电泳可见相差约180～200 bp。作者们认为在AMI时心肌细胞损害有心肌细胞凋亡的参与。Bardales等[5] 亦用 TUNEL法检测了80例心肌细胞，发现AMI发生后6小时内死亡的患者，尸解的心肌细胞凋亡阳性率为 97%，而常规HE染色病理组织检查尚不能做出明确诊断时，TUNEL法就可在37%尸解病例中检出心肌细胞有缺血性凋亡改变。作者认为TUNEL法可检出早到2～4小时的急性缺血性心肌细胞的死亡。
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本研究发现：AMI猝死者，梗死部位心肌细胞电镜下有明显的凋亡特征，TUNEL法检测的阳性心肌细胞数明显高于正常对照组；DNA电泳法示：2～3支冠脉病变的猝死者梗死区心肌细胞亦显示出凋亡特征性的相差约 180～200 bp DNA片段；这与上述作者观察结果相似，提示AMI猝死时心肌细胞有明显的凋亡现象，细胞凋亡可能参与了AMI猝死者心肌细胞的死亡过程。
研究表明，细胞凋亡亦可由能引起细胞坏死的因素引起[1，2]，心肌细胞在急性缺血、缺氧后，氧自由基及氧化剂产生增加、一氧化氮(NO)合成下降、致使细胞内钙增加，胞内致密颗粒排空，激活胞内酶，而启动细胞凋亡的发生[15]。急性心肌缺血导致细胞凋亡还有下述理论依据：引起心肌细胞内磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺产生增加，激活核内酶，致使染色质被切成180～200 bp的片段[6]；引起心肌细胞内神经酰胺含量增加，通过激活神经酰胺激活的蛋白激酶、原癌基因Vav、蛋白磷酸酶、蛋白激酶C及其同工酶和核因子-κB等启动细胞凋亡[7]；通过诱发心肌细胞核内原癌基因c-fos和c-jun的表达，促使热休克蛋白70(HSP70)基因表达，而导致DNA的断裂，诱发心肌细胞凋亡[8]；通过诱发机体内细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1(IL-1)、IL-3、IL-4、IL-10、生长因子β1(TGF-β1)、纤维细胞生长因子、甲状腺素和Ⅱ型胶原的分泌增加，促使心肌细胞的核染色质发生特异性断裂，促使心肌细胞凋亡[9]。
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TUNEL法1992年被Gavrieli等[10]提出并应用于检测凋亡细胞，虽然它不能区分凋亡特异性的DNA降解和坏死非特异性的DNA降解，但它的确能帮助识别细胞死亡及在组织中的分布。目前认为它主要用于原位检测核内染色质的断裂和双链DNA被生物素标记后，特异性地用于检测凋亡细胞。且DNA的裂解出现在形态学改变之前，故TUNEL法现已广泛用于检测细胞凋亡[1，4，5，10]。我们在AMI猝死者及结扎冠脉后兔AMI模型的心肌细胞中，用TUNEL法检测到大量的阳性细胞，提示急性缺血的心肌细胞的确存在DNA特异性裂解，加上DNA梯形电泳及电镜检查结果，说明急性缺血的心肌细胞存在明显凋亡现象。
凋亡的心肌细胞核中染色质DNA的裂解主要归因于唯一的核酸内切酶的作用，它可特异性地将染色质DNA切割成相差约180～200 bp的片段或它的倍数片段，用琼脂糖凝胶电泳可检测到细胞核的抽提物，典型者表现为“DNA梯形或带级”构型，也是目前应用广泛且特异性检测细胞凋亡的方法之一[1，2，4，5，10]。本结果显示，冠脉2支和3支病变的AMI猝死者心肌细胞均可不同程度地见到特异性DNA梯形条带，进一步说明AMI时心肌细胞存在凋亡。
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本研究中电子显微镜下同样观察到了心肌细胞不同程度的核体积缩小、染色体固缩、边聚、电子密度增加和核膜完整的凋亡特征，但未能见凋亡小体，其可能原因为：在AMI的早期凋亡小体仍未能在心肌细胞中形成；在缺血的后期梗死灶激活了炎症细胞，引起分叶核粒细胞或吞噬细胞粘附和吞噬，在清除坏死组织的同时也清除了有凋亡小体的细胞；在AMI时心肌细胞凋亡仅部分激活，不足以形成凋亡小体；另外电镜检测时组织块小，未能切到有凋亡小体的心肌细胞。综上所述：在AMI猝死者的心肌细胞死亡中凋亡起着重要的作用。
基金项目：卫生部科学研究基金资助项目(961116)
作者简介：马中富(1963-)，男(汉族)，湖南省人，博士，硕士生导师，副主任医师。主要从事急性心肌梗死心肌细胞凋亡机制、心肺脑复苏、慢性肺心病凝血机制及多器官衰竭的基础和临床研究；参与编写专著4部，发表学术论文30篇。
参考文献：
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[3]Saraste A,Pulkki K,Kallajoki M,et al.Apoptosis in human acute myocardial infarction.Circulation,1997,95(2):320-323.
[4]Itoh G,Tamura J,Suzuki M,et al.DNA fragmentation of human infarcted my[5]Bardales R H,Hailey S,Xie S S,et al.In situ apoptosis assay for the detection of early acute myocardial infarction.Am J Pathol,1996,149:821-829.
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[9]Pulkki K J.Cytokines and cardiomyocyte death.Ann Med,1997,29(4):339-343.
[10]Gavrieli Y,Sherman Y,Ben-Sasson S A .Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.J Cell Biol,1992,119:493-501.
收稿日期：1999-09-10, 百拇医药
单位：
马中富(中山医科大学附属第一医院，广东 广州 510080)；马虹(中山医科大学附属第一医院，广东 广州 510080)；叶任高(中山医科大学附属第一医院，广东 广州 510080)；罗斌(中山医科大学基础学院，广东 广州 510089)；朱全胜(中山医科大学基础学院，广东 广州 510089)；吴金浪(中山医科大学基础学院，广东 广州 510089)
关键词：细胞凋亡；心肌梗死；急性；猝死
中国危重病急救医学000303 摘 要：目的：探讨细胞凋亡在急性心肌梗死时心肌细胞死亡中的意义。方法：用末端原位标记(TUNEL)法、DNA电泳和电镜3种方法检测急性心肌梗死猝死患者和心脏正常的车祸死亡者心肌细胞的凋亡。结果：TUNEL法发现，猝死者梗死区的心肌细胞凋亡数(557.95±144.10)×10-3明显高于正常对照组(34.30±20.68)×10-3(P=0.000 0)；心肌细胞凋亡数在冠脉1支病变者为(506.38±175.88)×10-3<2支病变者为(554.38±92.15)×10-3<3支病变者为(668.25±127.19)×10-3，虽然均明显高于正常对照组(P均<0.05)，但3 组之间比较则无统计学差别(P均>0.05)；冠脉2～3支病变者梗死区的心肌细胞DNA电泳可见相差约180～200 bp的阶梯片段；电镜发现猝死者梗死区内的心肌细胞核膜完整、染色质浓集、电子密度增加的凋亡特征，有的则出现核膜破裂、染色质溶解成碎屑的坏死现象。结论：细胞凋亡在急性心肌梗死猝死者的心肌细胞死亡中起重要作用。
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分类号：Q255;R541.4 文献标识码：A
文章编号：1003-0603(2000)03-0137-05
Study on myocyte apoptosis in sudden death with acute myocardial infarction
MA Zhong-fu,MA Hong,YE Ren-gao
(First Affiliated Hospital,Sun Yatsen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080)
Abstract：Objective：To explore the significance of myocyte apoptosis in acute myocardial infarction (AMI).Methods：Myocyte apoptosis in patients with sudden death caused by AMI and in healthy subjects who died in traffic accident were studied by means of TdT-mediated dUTP Nick End Labeling (TUNEL),DNA laddering on agarose gel electrophoresis and electron microscopy.Results：The permillage of myocyte apoptosis measured by TUNEL in infarct area in patients with sudden death caused by AMI was significantly higher than that in control group [(557.95±144.10)×10-3 vs.(34.30±20.68)×10-3,P=0.000 0].The permillages of myocyte apoptosis in 1-vessel,2-vessel and 3-vessel disease were (506.38±175.88)×10-3,(554.38±92.15)×10-3,and (668.25±127.19)×10-3,respectively,which were significantly higher than those of control group (all P<0.05).No significant difference was found among the three groups.DNA laddering on agarose gel electrophoresis showed that the DNA fragments of about 180-200 bp were found only in those patients with involvement of two and three vessels.The electron microscopy showed that the characteristics of myocyte apoptosis included intact nuclear membrane,condensed chromatin and increased electron denes.However,some myocytes possessed the characteristics of necrosis,i.e.broken cellular membrane,dissolution of chromatin and lysis of nuclei.Conclusions：Myocyte apoptosis may play a key role in the process of myocyte death in infarct area in patients with sudden death caused by AMI.
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Key words：apoptosis;acute myocardial infarction;sudden death▲
研究已经表明，生物体细胞可以通过坏死(necrosis)或凋亡(apoptosis)而导致死亡，这两种细胞死亡的模式在功能、结构、机制和特征上有着明显的不同[1]。细胞凋亡现象早在1951年Glucksmann就已观察到，但直至1972年Kerr等[1]才提出这一概念，细胞凋亡是指局部环境、生理性或病理性刺激引起的一种受基因控制的自身程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。与坏死不同，它是一种主动的细胞死亡形式[1]，其形态特征是细胞变小、变圆、皱缩，胞浆浓集，线粒体功能丧失，细胞骨架断裂；细胞核染色质固缩和裂解，染色质密度增加并聚集在核膜周边呈半月形，染色质DNA裂解成180～200 bp及其倍数的寡核苷酸片段，琼脂糖凝胶电泳中呈梯形带(ladder pattern 或 DNA ladder)；核仁裂解，进而细胞膜内陷，将细胞分割成多个外有包膜、内有完整细胞器的小体，称为凋亡小体(apoptotic bodies)。多数凋亡小体内含有核成分，凋亡小体被邻近组织吞噬，并在其溶酶体中被降解，但无胞膜溶解及溶酶体酶释放，故不出现炎症反应[1]。随着细胞凋亡研究的深入，人们已发现许多心血管系统疾病的发生发展均与细胞凋亡有关[2]。为进一步探讨细胞凋亡在急性心肌梗死(AMI)时心肌细胞死亡中的作用，我们研究了20例AMI猝死者心肌细胞的凋亡现象。
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1 资料与方法
把法医尸解者分为研究组和正常对照组。
1.1 研究组为AMI猝死者20例，男13例，女7例；年龄37～82岁，平均(54.5±18.5)岁。冠状动脉(冠脉)病变部位及支数：左冠前降支病变(1支病变)8例，男5例，女3例，年龄37～82岁，平均(58.8±16.6)岁；左前降支+右冠病变(2支病变)8例，男4例，女4例，年龄38～56岁，平均(47.0±7.6)岁；左前降支+右冠+左冠回旋支病变(3支病变)4例，均为男性，年龄65～80岁，平均(71.0±7.0)岁。20例患者共36支血管受累，病变程度的分布为：冠脉Ⅰ级狭窄(狭窄为25%～50%)2支，Ⅱ级狭窄(狭窄50%～75%)13支，Ⅲ级狭窄(狭窄>75%)16支，Ⅳ级狭窄(冠脉完全闭塞)5支。20例中有9例血栓形成(Ⅵ级狭窄4例，Ⅲ级狭窄5例)。心脏平均重量为(365.0±74.8)g。
1.2 正常对照组10例，男7例，女3例；年龄23～60岁，平均(46.6±11.4)岁，全部死于交通事故，尸解时心肌及冠脉均正常，其中脑出血者7例，肝、脾破裂者2例，肺、胸腔、肝破裂者1例。心脏平均重量(316.3±45.2)g，明显低于研究组(P<0.01)。
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1.3 实验方法：
1.3.1 取材：死亡距尸解时间平均(29.3±13.1)小时(6～50小时)，尸解前尸体均存放于-4 ℃冰柜中，办完法律手续后即行尸解。研究组取1 mm3大小梗死组织4～5块于2.5%戊二醛液中固定以便镜检，一部分梗死块于10%甲醛液中固定以做苏木素伊红(HE)染色及免疫组化，一部分梗死块于-70 ℃下冻存以做分子生物学实验。正常对照组抽样取同样大小心肌组织4～5块，用同法进行研究。
1.3.2 HE染色：10%甲醛液中固定的组织于48～72小时内行石蜡包埋，切片4～5 μm厚，脱蜡后常规HE染色，正常的心肌组织和急性心肌细胞梗死灶内及周围白细胞浸润见图1和图2。
图1 正常心肌细胞(HE×100)
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图2 梗死灶内心肌纤维肌浆溶解，横纹消失(HE×200)
1.3.3 心肌细胞凋亡检测：用原位末端标记检测法(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)，In Site Cell Death Kit,AP(购自德国Bochringer Mannheim)，按药盒说明书操作：①10%甲醛固定的心肌组织固定、包埋、切片；②脱蜡；③消化膜蛋白及核蛋白；④加TUNEL反应混合物；⑤加入抗荧光抗体(Convertev-AP);⑥加入底物混合液；⑦复染封片。
1.3.4 心肌细胞DNA电泳：取梗死心肌块约1 g，用重蒸酚氯仿法抽提DNA，用70%的乙醇冲洗后，真空抽干，干燥后加入0.1～0.2 ml TE液溶解DNA，于2%的琼脂糖凝胶电泳，在10 V/cm电压下电泳，观察其条带。
1.3.5 凋亡的心肌细胞电镜检测：取2.5%戊二醛前固定的标本，1%锇酸固定，环氧树脂渗透后包埋，60 ℃高温聚合，用LKB超薄切片(厚度60～90 nm)，200目铜网捞片，铀铅染液染色，H-60透射电镜观察并摄片。
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1.4 统计学方法：数值用均数±标准差(
±s)表示，SPSS 6.0软件计算，结果之间的比较用单因素方差分析(One-way ANOVA Analyis)中的Student-Newman-Keuls Test,两两比较用q检验，两指标间相关性用简单相关及直线回归，P<0.05为差异有显著性。2 结 果
2.1 TUNEL法检测AMI猝死者和正常对照组心肌细胞凋亡的结果：
2.1.1 20例AMI猝死者梗死部位的心肌细胞和10例正常对照者的心肌细胞TUNEL法检测，发现凋亡的心肌细胞出现核固缩，染色质浓集，在加入抗荧光抗体后用NBT显色时，凋亡的细胞核呈紫蓝色(图3)。在每张玻片上随机选择10个区域，每个区域计数100个细胞，统计出凋亡的细胞数，再加在一起 ，即为每千个心肌细胞中凋亡的细胞数，结果见表1。AMI猝死者心肌细胞凋亡数明显高于正常对照组(P=0.0000)，提示心肌细胞凋亡在AMI心肌细胞死亡中起一定作用。
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图3 早期凋亡的心肌细胞核被标记，染色成紫蓝色(TUNEL法)
表1 TUNEL法检测AMI患者和正常对照者凋亡的心肌细胞数比较(
±s) 组别例数
(例)
凋亡心肌细胞数
(×10-3)
P值
F值
正常对照组
10
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34.30± 20.68(10～75)
0.000 0
128.476 6
研究组
20
557.95±144.10(215～807)
注：( )内为范围
2.1.2 不同冠脉病变支数猝死者心肌细胞凋亡与正常对照组之间的差异见表2。冠脉病变支数不同的AMI猝死者心肌细胞凋亡数均明显高于正常对照组(P均<0.05)，而不同支数病变的AMI猝死者之间心肌细胞凋亡数，虽然3支病变者>2支病变者>1支病变者，但均无统计学意义(P均>0.05)。
, 百拇医药 表2 不同支数冠脉病变猝死者心肌细胞凋亡数(
±s) 组别例数(例)
凋亡的心肌细胞数(×10-3)
正常对照组
10
34.30±20.68(10～75)
研究组 1支冠脉病变
8
506.38±175.88(215～793)*
2支冠脉病变
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8
554.38±92.15(377～681*
3支冠脉病变
4
668.25±127.19(521～807)*
注：与正常对照组比较：*P<0.05；F=50.098 5；( )内为范围
2.2 AMI猝死者和正常对照组心肌细胞DNA电泳：AMI猝死者心肌细胞凋亡后，核小体在核酸内切酶作用下切成大小不同的片段在电泳胶上可见相差180～200 bp梯形条带。不同支数冠脉病变者其电泳条带不同，3支、2支病变者，可见相差约180～200 bp的DNA梯形条带，而1支病变和正常对照组心肌细胞内未见相差约180～200 bp的DNA片段(图4)，这与TUNEL法观察到的结果一致，提示病变冠脉支数增多，则凋亡特征更明显。
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图4 AMI猝死者梗死区心肌细胞内DNA电泳
2.3 AMI猝死者和正常对照组心肌细胞的电镜观察：心脏正常的意外死亡者的心肌细胞电镜下核膜完整，染色质均匀，核体积约占细胞的1/3，但由于组织块在生理盐水中浸泡较久和尸解距死亡的时间较长，细胞浆有些自溶现象(图5)。而AMI猝死者的心肌细胞则胞核体积缩小，核膜仍然完整，染色质有的呈边聚现象即早期凋亡特征(图6)；有的染色质则更浓密，电子密度明显增加，结构模糊不清，但核膜仍完整，具有中期或晚期的凋亡细胞核特征(图7和图8)；有的心肌细胞可能因缺血时间过长而出现了坏死现象，即核膜破裂，染色质被溶解成坏死碎屑，胞核呈明显的空泡变(图8)。
图5 正常的心肌细胞(EM×6 782)
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图6 AMI猝死者梗死区早期凋亡的心肌细胞，可见核固缩，染色质浓缩，凝聚于核膜下呈边聚现象，核膜完整(EM×6 250)
图7 凋亡晚期的心肌细胞核，见核更加固缩，电子密度增加，染色质凝聚，胞浆内出现空泡(EM×6 244)
图8 继发性坏死的心肌细胞，凋亡晚期的心肌细胞核，见染色质浓缩，凝聚于核膜下，核出现空泡(EM×6 922)
3 讨 论
以往的观念认为AMI时，心肌细胞死亡是坏死，可是近来的研究表明，鼠、兔和人类的心肌细胞在经历长时间的缺血缺氧或缺血再灌注后，出现明显的凋亡特征[1，2]。用TUNEL和DNA电泳法[3，4]检测了AMI死亡者的心肌细胞，发现在梗死区及梗死周边区的心肌细胞中有大量TUNEL阳性的细胞，特异性的DNA电泳可见相差约180～200 bp。作者们认为在AMI时心肌细胞损害有心肌细胞凋亡的参与。Bardales等[5] 亦用 TUNEL法检测了80例心肌细胞，发现AMI发生后6小时内死亡的患者，尸解的心肌细胞凋亡阳性率为 97%，而常规HE染色病理组织检查尚不能做出明确诊断时，TUNEL法就可在37%尸解病例中检出心肌细胞有缺血性凋亡改变。作者认为TUNEL法可检出早到2～4小时的急性缺血性心肌细胞的死亡。
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本研究发现：AMI猝死者，梗死部位心肌细胞电镜下有明显的凋亡特征，TUNEL法检测的阳性心肌细胞数明显高于正常对照组；DNA电泳法示：2～3支冠脉病变的猝死者梗死区心肌细胞亦显示出凋亡特征性的相差约 180～200 bp DNA片段；这与上述作者观察结果相似，提示AMI猝死时心肌细胞有明显的凋亡现象，细胞凋亡可能参与了AMI猝死者心肌细胞的死亡过程。
研究表明，细胞凋亡亦可由能引起细胞坏死的因素引起[1，2]，心肌细胞在急性缺血、缺氧后，氧自由基及氧化剂产生增加、一氧化氮(NO)合成下降、致使细胞内钙增加，胞内致密颗粒排空，激活胞内酶，而启动细胞凋亡的发生[15]。急性心肌缺血导致细胞凋亡还有下述理论依据：引起心肌细胞内磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺产生增加，激活核内酶，致使染色质被切成180～200 bp的片段[6]；引起心肌细胞内神经酰胺含量增加，通过激活神经酰胺激活的蛋白激酶、原癌基因Vav、蛋白磷酸酶、蛋白激酶C及其同工酶和核因子-κB等启动细胞凋亡[7]；通过诱发心肌细胞核内原癌基因c-fos和c-jun的表达，促使热休克蛋白70(HSP70)基因表达，而导致DNA的断裂，诱发心肌细胞凋亡[8]；通过诱发机体内细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1(IL-1)、IL-3、IL-4、IL-10、生长因子β1(TGF-β1)、纤维细胞生长因子、甲状腺素和Ⅱ型胶原的分泌增加，促使心肌细胞的核染色质发生特异性断裂，促使心肌细胞凋亡[9]。
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TUNEL法1992年被Gavrieli等[10]提出并应用于检测凋亡细胞，虽然它不能区分凋亡特异性的DNA降解和坏死非特异性的DNA降解，但它的确能帮助识别细胞死亡及在组织中的分布。目前认为它主要用于原位检测核内染色质的断裂和双链DNA被生物素标记后，特异性地用于检测凋亡细胞。且DNA的裂解出现在形态学改变之前，故TUNEL法现已广泛用于检测细胞凋亡[1，4，5，10]。我们在AMI猝死者及结扎冠脉后兔AMI模型的心肌细胞中，用TUNEL法检测到大量的阳性细胞，提示急性缺血的心肌细胞的确存在DNA特异性裂解，加上DNA梯形电泳及电镜检查结果，说明急性缺血的心肌细胞存在明显凋亡现象。
凋亡的心肌细胞核中染色质DNA的裂解主要归因于唯一的核酸内切酶的作用，它可特异性地将染色质DNA切割成相差约180～200 bp的片段或它的倍数片段，用琼脂糖凝胶电泳可检测到细胞核的抽提物，典型者表现为“DNA梯形或带级”构型，也是目前应用广泛且特异性检测细胞凋亡的方法之一[1，2，4，5，10]。本结果显示，冠脉2支和3支病变的AMI猝死者心肌细胞均可不同程度地见到特异性DNA梯形条带，进一步说明AMI时心肌细胞存在凋亡。
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本研究中电子显微镜下同样观察到了心肌细胞不同程度的核体积缩小、染色体固缩、边聚、电子密度增加和核膜完整的凋亡特征，但未能见凋亡小体，其可能原因为：在AMI的早期凋亡小体仍未能在心肌细胞中形成；在缺血的后期梗死灶激活了炎症细胞，引起分叶核粒细胞或吞噬细胞粘附和吞噬，在清除坏死组织的同时也清除了有凋亡小体的细胞；在AMI时心肌细胞凋亡仅部分激活，不足以形成凋亡小体；另外电镜检测时组织块小，未能切到有凋亡小体的心肌细胞。综上所述：在AMI猝死者的心肌细胞死亡中凋亡起着重要的作用。
基金项目：卫生部科学研究基金资助项目(961116)
作者简介：马中富(1963-)，男(汉族)，湖南省人，博士，硕士生导师，副主任医师。主要从事急性心肌梗死心肌细胞凋亡机制、心肺脑复苏、慢性肺心病凝血机制及多器官衰竭的基础和临床研究；参与编写专著4部，发表学术论文30篇。
参考文献：
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[3]Saraste A,Pulkki K,Kallajoki M,et al.Apoptosis in human acute myocardial infarction.Circulation,1997,95(2):320-323.
[4]Itoh G,Tamura J,Suzuki M,et al.DNA fragmentation of human infarcted my[5]Bardales R H,Hailey S,Xie S S,et al.In situ apoptosis assay for the detection of early acute myocardial infarction.Am J Pathol,1996,149:821-829.
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[10]Gavrieli Y,Sherman Y,Ben-Sasson S A .Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.J Cell Biol,1992,119:493-501.
收稿日期：1999-09-10, 百拇医药