早期应用免疫调节剂对防治烧伤动物感染的作用
作者：卓安山 陈金江 黄强 陈爱娟
单位：卓安山 陈金江 黄强(第四军医大学吉林军医学院附属医院 132013 吉林市)；陈爱娟(吉林军医学院)
关键词：
中华医学杂志000330 近年来研究证明，烧伤感染与伤后引起的免疫抑制有关。最近文献报道，黄芪多糖[1]和β1,3多聚葡萄糖(葡聚糖)[2]对纠正烧伤后免疫功能失常有一定作用，但尚处于实验阶段。为此，本研究以烧伤感染中最常见的3种致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌)为抗原，制备特异性免疫核糖核酸(iRNA)，利用烫伤大鼠实验模型，观察了其对烫伤大鼠感染的防治作用，并与黄芪多糖和葡聚糖作对照。
一、材料和方法
1.实验材料：(1) 动物 Wistar健康大鼠202只，鼠龄3个月，体重180 g～220 g，雌雄各半，由白求恩医科大学动物所提供，实验前先在实验室习服7～10 d；(2)免疫调节剂：黄芪注射液成都地奥九泓制药厂生产，以生理盐水配成50 mg/ml。葡聚糖由Meades博士惠赠，用生理盐水配成60 mg/ml。特异性iRNA制备参见文献[3]；(3)菌悬液制备：将从烧伤病人感染创面中分离获得的菌种(金葡菌、大肠杆菌和绿脓杆菌)分别接种于100 ml肉汤培养基中，37℃孵育16 d后离心去上清，用比浊法调整细菌浓度至1×109/ml，用于创面涂菌；(4)烫伤模型制备：实验前1 d，鼠背一定面积用8%硫化钠脱毛，实验当天，在非麻醉状态下将其背部浸入100℃恒温沸水中12 s，致25%体表面积的Ⅲ度烫伤(病理切片证实)，伤后立即腹腔内注射生理盐水6 ml以抗休克。10 min后创面涂上述3种细菌的混悬液，每只1 ml，然后分笼饲养，自由进食水。
, 百拇医药
2.动物分组：将192只烫伤大鼠随机分成4组，每组48只。(1)iRNA组：注射特异性iRNA 1 ml(含1 mg，其中3种iRNA各取1/3量)；(2)黄芪组：注射黄芪注射液1 ml(相当于每日给生药量为250 mg/kg)；(3)葡聚糖组：注射葡聚糖1 ml(含60 mg)；(4)对照组：注射生理盐水1 ml。以上各组均自伤后当天(6 d内)开始腹腔注射，每天1次，连用3 d；(5)另设正常组10只，注射生理盐水1 ml，方法同上。标本采集：每组动物分别于伤后第10 d各取24只活杀，采集相应标本待测。
3.观察指标：(1)心脏血细菌培养：无菌取心脏血2 ml放入装有4.5 ml肉汤的培养基内，混匀后置37℃培养7 d，取少许接种于普通琼脂培养基上，培养24 d后进行菌落计数及菌种鉴定；(2)痂下组织细菌定量培养：参照文献[4]；(3)肠道细菌易位率测定和内源性感染发生率测定：参照文献[5]；(4)存活率和死亡率测定：每组各取24只观察10 d，累计死亡率和存活率；(5)淋巴细胞超微结构观察：伤后10 d取各组大鼠血淋巴细胞，用25%戊二醛固定，0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗，1%锇酸常规固定，乙醇、丙酮逐级脱水，常规浸透、包埋、切片、电子染色，然后在CM10型透射电镜下观察结果。
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二、结果
1.各组菌血症及创面脓毒症发生率比较：见表1。从中可以看出，应用免疫调节剂治疗后各组大鼠菌血症和创面脓毒症发生率明显低于未用药的对照组。
表1 各组菌血症及创面脓毒症发生率比较 组别
鼠数
菌血症
创面脓毒症
阳性
(只)
百分率
(%)
χ2值
, 百拇医药
阳性
(只)
百分率
(%)
χ2值
对照组
24
17
70.8
18
75.0
iRNA组
24
, 百拇医药
5
20.8△
12.1
6
25.0△
12.0
黄芪组
24
7
29.2△
8.3
9
, 百拇医药 37.5△
6.8
葡聚糖组
24
8
33.3*
5.4
11
45.8*
4.3
注：与对照组比较△P<0.01，*P<0.05
, 百拇医药 2.各组肠道细菌易位及内源性感染发生率比较：对各组烫伤大鼠进行了细菌学和病理学检测，结果发现，应用免疫调节剂治疗后各组大鼠肠道细菌易位和内源性感染的发生率明显低于未治疗的对照组(表2)。
表2 各组肠道细菌易位及内源性感染发生率比较
组别
鼠数
肠道细菌易位
内源性感染
阳性
(只)
百分率
(%)
χ2值
, 百拇医药
阳性
(只)
百分率
(%)
χ2值
对照组
24
17
70.8
16
66.7
iRNA组
24
, 百拇医药
5
20.8△
12.1
4
16.7△
12.3
黄芪组
24
7
29.2△
8.3
6
, 百拇医药 25.0△
8.4
葡聚糖组
24
9
37.5*
5.4
9
37.5*
4.1
注：与对照组比较，△P<0.01，*P<0.05
, http://www.100md.com 3.各组伤后10d内存活率和死亡率比较：烧伤后早期应用免疫调节剂治疗可明显提高烫伤大鼠的存活率，降低其死亡率。对照组存活率6/24，iRNA组为19/24，黄芪组为16/24，葡聚糖组15/24。后3组与对照组比较差异有显著意义。
4.透射电镜观察结果：显示正常组大鼠淋巴细胞呈圆形，核内游离核糖体丰富，胞质内可见大小不等的线粒体和粗面内质网，细胞表面有长短不一的微绒毛；对照组(烫伤后未用药)大鼠大部分淋巴细胞呈空泡状，核结构不清，发生裂解，呈变性坏死改变，粗面内质网减少；葡聚糖组大鼠淋巴细胞结构存在，核异染色质增多，胞质内具有较多的线粒体，有少量空泡；黄芪组淋巴细胞呈圆形，核圆，异染色质丰富，胞质内有较多线粒体，局部有灶状空泡变性；iRNA组淋巴细胞核大呈圆形，核内异染色质多，胞质少，有少数线粒体，无空泡，细胞表面有较多微绒毛。
三、讨论
本研究结果发现，免疫调节剂治疗后各组大鼠菌血症、创面脓毒症、肠道细菌易位和内源性感染发生率均明显低于未用药的对照组，两者比较，差异有非常显著意义(P<0.01)。这一结果说明，烧伤后早期(6 d，此时感染尚未发生，或仅局限于局部尚未发展成创面脓毒症或菌血症时)应用免疫调节剂可明显降低烧伤大鼠肠道细菌易位和内源性感染的发生率，保护烫伤大鼠免受和/或减轻病原微生物的致死性攻击，以提高存活率，结果与我们实验室测得的免疫功能改善情况相一致[6]。
, 百拇医药
本文同时对各组烫伤大鼠血淋巴细胞超微结构进行了观察。结果发现，烫伤后未用药的对照组大鼠血淋巴细胞超微结构严重受损，核呈空泡变性，结构不清，甚至发生核裂解。烫伤后早期应用免疫调节剂治疗的各组大鼠血淋巴细胞超微结构均有不同程度的改善，表现为核结构明显可见，核内异染色质增多，胞质内线粒体多见，空泡减少，细胞表面微绒毛增加。说明烫伤后早期应用免疫调节剂可明显减轻烧伤对大鼠淋巴细胞超微结构的损害，并可促进其受损淋巴细胞超微结构的修复。
对实验指标进行分析后还发现，在所用3种免疫调节剂中，以特异性iRNA作用较明显，能使伤鼠菌血症发生率从70.8%降至20.8%，创面脓毒症从75.0%降至25.0%，肠道细菌易位率从70.8%降至20.8%，内源性感染发生率由66.7%降至16.7%，伤后10d内存活率由25.0%提高至79.2%，因感染而引起的死亡率从75.0%下降至20.8%。进一步说明烧伤后早期应用免疫调节剂对防治烧伤动物感染具有重要的作用。关于特异性iRNA防治烧伤感染的作用机理，我们正在深入探讨之中。
, 百拇医药
基金项目：全军“八五”医药卫生青年基金资助项目；空军“九五”医药卫生科研重点课题基金资助项目
参考文献：
1 梁华平，张艳，耿波.黄芪多糖对烧伤小鼠细胞免疫功能的影响.中华整形烧伤外科杂志，1994，10:138-140.
2 Felippe JD, Silva MR, Maciel FM, et al. infection preuention in patients with severe multiple trauma with the immunomodulator beta1-3 polyglucose. Surg Gynecol Obstet, 1993，177:383.
3 卓安山，罗丽玲，陈爱娟，等.特异性iRNA对烧伤患者外周血T细胞亚群作用的研究.中国实验临床免疫学杂志，1995，7:30-31.
4 李利平，马恩庆.细菌定量、组织活检、血培养对烧伤侵袭性感染检测意义的实验研究.中国烧伤创疡杂志， 1995，1:10-11.
5 施志国，于勇，兰复生，等.烧伤后免疫抑制引起肠道细菌迁移和内源性感染的实验研究.中华整形烧伤外科杂志，1990，6:167-169.
6 卓安山，陈爱娟，申繁星，等.特异性iRNA改善伤后受损免疫功能的作用研究.解放军医学杂志，1997，22:68-70.
收稿日期：1999-05-06, 百拇医药
单位：卓安山 陈金江 黄强(第四军医大学吉林军医学院附属医院 132013 吉林市)；陈爱娟(吉林军医学院)
关键词：
中华医学杂志000330 近年来研究证明，烧伤感染与伤后引起的免疫抑制有关。最近文献报道，黄芪多糖[1]和β1,3多聚葡萄糖(葡聚糖)[2]对纠正烧伤后免疫功能失常有一定作用，但尚处于实验阶段。为此，本研究以烧伤感染中最常见的3种致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌)为抗原，制备特异性免疫核糖核酸(iRNA)，利用烫伤大鼠实验模型，观察了其对烫伤大鼠感染的防治作用，并与黄芪多糖和葡聚糖作对照。
一、材料和方法
1.实验材料：(1) 动物 Wistar健康大鼠202只，鼠龄3个月，体重180 g～220 g，雌雄各半，由白求恩医科大学动物所提供，实验前先在实验室习服7～10 d；(2)免疫调节剂：黄芪注射液成都地奥九泓制药厂生产，以生理盐水配成50 mg/ml。葡聚糖由Meades博士惠赠，用生理盐水配成60 mg/ml。特异性iRNA制备参见文献[3]；(3)菌悬液制备：将从烧伤病人感染创面中分离获得的菌种(金葡菌、大肠杆菌和绿脓杆菌)分别接种于100 ml肉汤培养基中，37℃孵育16 d后离心去上清，用比浊法调整细菌浓度至1×109/ml，用于创面涂菌；(4)烫伤模型制备：实验前1 d，鼠背一定面积用8%硫化钠脱毛，实验当天，在非麻醉状态下将其背部浸入100℃恒温沸水中12 s，致25%体表面积的Ⅲ度烫伤(病理切片证实)，伤后立即腹腔内注射生理盐水6 ml以抗休克。10 min后创面涂上述3种细菌的混悬液，每只1 ml，然后分笼饲养，自由进食水。
, 百拇医药
2.动物分组：将192只烫伤大鼠随机分成4组，每组48只。(1)iRNA组：注射特异性iRNA 1 ml(含1 mg，其中3种iRNA各取1/3量)；(2)黄芪组：注射黄芪注射液1 ml(相当于每日给生药量为250 mg/kg)；(3)葡聚糖组：注射葡聚糖1 ml(含60 mg)；(4)对照组：注射生理盐水1 ml。以上各组均自伤后当天(6 d内)开始腹腔注射，每天1次，连用3 d；(5)另设正常组10只，注射生理盐水1 ml，方法同上。标本采集：每组动物分别于伤后第10 d各取24只活杀，采集相应标本待测。
3.观察指标：(1)心脏血细菌培养：无菌取心脏血2 ml放入装有4.5 ml肉汤的培养基内，混匀后置37℃培养7 d，取少许接种于普通琼脂培养基上，培养24 d后进行菌落计数及菌种鉴定；(2)痂下组织细菌定量培养：参照文献[4]；(3)肠道细菌易位率测定和内源性感染发生率测定：参照文献[5]；(4)存活率和死亡率测定：每组各取24只观察10 d，累计死亡率和存活率；(5)淋巴细胞超微结构观察：伤后10 d取各组大鼠血淋巴细胞，用25%戊二醛固定，0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗，1%锇酸常规固定，乙醇、丙酮逐级脱水，常规浸透、包埋、切片、电子染色，然后在CM10型透射电镜下观察结果。
, http://www.100md.com
二、结果
1.各组菌血症及创面脓毒症发生率比较：见表1。从中可以看出，应用免疫调节剂治疗后各组大鼠菌血症和创面脓毒症发生率明显低于未用药的对照组。
表1 各组菌血症及创面脓毒症发生率比较 组别
鼠数
菌血症
创面脓毒症
阳性
(只)
百分率
(%)
χ2值
, 百拇医药
阳性
(只)
百分率
(%)
χ2值
对照组
24
17
70.8
18
75.0
iRNA组
24
, 百拇医药
5
20.8△
12.1
6
25.0△
12.0
黄芪组
24
7
29.2△
8.3
9
, 百拇医药 37.5△
6.8
葡聚糖组
24
8
33.3*
5.4
11
45.8*
4.3
注：与对照组比较△P<0.01，*P<0.05
, 百拇医药 2.各组肠道细菌易位及内源性感染发生率比较：对各组烫伤大鼠进行了细菌学和病理学检测，结果发现，应用免疫调节剂治疗后各组大鼠肠道细菌易位和内源性感染的发生率明显低于未治疗的对照组(表2)。
表2 各组肠道细菌易位及内源性感染发生率比较
组别
鼠数
肠道细菌易位
内源性感染
阳性
(只)
百分率
(%)
χ2值
, 百拇医药
阳性
(只)
百分率
(%)
χ2值
对照组
24
17
70.8
16
66.7
iRNA组
24
, 百拇医药
5
20.8△
12.1
4
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12.3
黄芪组
24
7
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8.3
6
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8.4
葡聚糖组
24
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5.4
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注：与对照组比较，△P<0.01，*P<0.05
, http://www.100md.com 3.各组伤后10d内存活率和死亡率比较：烧伤后早期应用免疫调节剂治疗可明显提高烫伤大鼠的存活率，降低其死亡率。对照组存活率6/24，iRNA组为19/24，黄芪组为16/24，葡聚糖组15/24。后3组与对照组比较差异有显著意义。
4.透射电镜观察结果：显示正常组大鼠淋巴细胞呈圆形，核内游离核糖体丰富，胞质内可见大小不等的线粒体和粗面内质网，细胞表面有长短不一的微绒毛；对照组(烫伤后未用药)大鼠大部分淋巴细胞呈空泡状，核结构不清，发生裂解，呈变性坏死改变，粗面内质网减少；葡聚糖组大鼠淋巴细胞结构存在，核异染色质增多，胞质内具有较多的线粒体，有少量空泡；黄芪组淋巴细胞呈圆形，核圆，异染色质丰富，胞质内有较多线粒体，局部有灶状空泡变性；iRNA组淋巴细胞核大呈圆形，核内异染色质多，胞质少，有少数线粒体，无空泡，细胞表面有较多微绒毛。
三、讨论
本研究结果发现，免疫调节剂治疗后各组大鼠菌血症、创面脓毒症、肠道细菌易位和内源性感染发生率均明显低于未用药的对照组，两者比较，差异有非常显著意义(P<0.01)。这一结果说明，烧伤后早期(6 d，此时感染尚未发生，或仅局限于局部尚未发展成创面脓毒症或菌血症时)应用免疫调节剂可明显降低烧伤大鼠肠道细菌易位和内源性感染的发生率，保护烫伤大鼠免受和/或减轻病原微生物的致死性攻击，以提高存活率，结果与我们实验室测得的免疫功能改善情况相一致[6]。
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本文同时对各组烫伤大鼠血淋巴细胞超微结构进行了观察。结果发现，烫伤后未用药的对照组大鼠血淋巴细胞超微结构严重受损，核呈空泡变性，结构不清，甚至发生核裂解。烫伤后早期应用免疫调节剂治疗的各组大鼠血淋巴细胞超微结构均有不同程度的改善，表现为核结构明显可见，核内异染色质增多，胞质内线粒体多见，空泡减少，细胞表面微绒毛增加。说明烫伤后早期应用免疫调节剂可明显减轻烧伤对大鼠淋巴细胞超微结构的损害，并可促进其受损淋巴细胞超微结构的修复。
对实验指标进行分析后还发现，在所用3种免疫调节剂中，以特异性iRNA作用较明显，能使伤鼠菌血症发生率从70.8%降至20.8%，创面脓毒症从75.0%降至25.0%，肠道细菌易位率从70.8%降至20.8%，内源性感染发生率由66.7%降至16.7%，伤后10d内存活率由25.0%提高至79.2%，因感染而引起的死亡率从75.0%下降至20.8%。进一步说明烧伤后早期应用免疫调节剂对防治烧伤动物感染具有重要的作用。关于特异性iRNA防治烧伤感染的作用机理，我们正在深入探讨之中。
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基金项目：全军“八五”医药卫生青年基金资助项目；空军“九五”医药卫生科研重点课题基金资助项目
参考文献：
1 梁华平，张艳，耿波.黄芪多糖对烧伤小鼠细胞免疫功能的影响.中华整形烧伤外科杂志，1994，10:138-140.
2 Felippe JD, Silva MR, Maciel FM, et al. infection preuention in patients with severe multiple trauma with the immunomodulator beta1-3 polyglucose. Surg Gynecol Obstet, 1993，177:383.
3 卓安山，罗丽玲，陈爱娟，等.特异性iRNA对烧伤患者外周血T细胞亚群作用的研究.中国实验临床免疫学杂志，1995，7:30-31.
4 李利平，马恩庆.细菌定量、组织活检、血培养对烧伤侵袭性感染检测意义的实验研究.中国烧伤创疡杂志， 1995，1:10-11.
5 施志国，于勇，兰复生，等.烧伤后免疫抑制引起肠道细菌迁移和内源性感染的实验研究.中华整形烧伤外科杂志，1990，6:167-169.
6 卓安山，陈爱娟，申繁星，等.特异性iRNA改善伤后受损免疫功能的作用研究.解放军医学杂志，1997，22:68-70.
收稿日期：1999-05-06, 百拇医药