急性一氧化碳中毒大鼠小脑组织一氧化氮及一氧化氮合酶活性的变化
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《急诊医学》
作者：王燕 刘郁
单位：王燕(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院急诊科)；刘郁(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院急诊科)
关键词：急性一氧化碳中毒；一氧化氮；一氧化氮合酶；小脑
急诊医学000305
【摘要】 目的：研究急性一氧化碳(CO)中毒大鼠小脑组织中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)活性的变化，以探讨NO、NOS与急性CO中毒脑损伤的关系。方法：实验用Wistar大鼠26只，随机分为两组：正常对照组(C组)，CO染毒组(CO组)。采用改良的Griess法、分光光度法分别测定小脑组织中NO、NOS活性。结果：CO中毒后小脑组织中NO明显增高(P<0.05)，NOS活性明显降低(P<0.01)。结论：急性CO中毒脑组织损伤与小脑组织中NOS活性受抑制、NO含量增高有关。
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Changes in levels of nitric oxide and activities of nitric oxide synthase in cerebellum after carbon monoxide poisoning in rat
Wang Yan，Liu Yu.
(Department of Emergency Medicine，First Hospital Affiliated.China Medical University，Shenyang，110001)
【Abstract】 Objective：Carbon monoxide(CO) continues to be a common cause of poisoning mortality and morbidity worldwide.The purpose of this study was to evaluate levels of nitric oxide(NO) and nitric oxide synthase(NOS) in the rat brain after exposure to carbon monoxide.Methods：Twenty-six male Wistar rats were randomly divided into 2 groups：Group 1，control group；Group 2，CO exposure.NO levels were measured by Griess’ method，and NOS activity was measured by spectrophotometry.NO，NOS levels were compared between the 2 groups.Results were analyzed using t-test.Results：In the rat cerebellum，that of NO increased and that of NOS decreased after CO exposure.Conclusion：Activity of NOS was inhibited in the rat cerebellum after CO exposure.The production of NO increased in the rat cerebellum after CO exposure.The demonstrated changes in levels of NO and NOS may play an important role in the neurologic damage resulting from CO poisoning.
, 百拇医药
【Key words】CO poisoning Nitric oxide Nitric oxide synthase cerebellum
近年来对一氧化氮(nitric oxide，NO)的研究发现，NO作为非经典神经递质、细胞功能调节因子 ，具有舒张血管、抑制血管平滑肌增殖等重要的生理功能。但NO过量产生和释放时具有神经毒性[1]。催化NO生物合成的酶称为一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)。CO中毒致脑损伤的机制至今未明[2]。CO中毒致脑损伤的机制与NO的关系尚不清楚，急性CO中毒对大鼠脑组织中NO、NOS活性的影响国内外尚未有研究报道，本实验应用动物模型，分别测定CO染毒大鼠小脑组织中NO、NOS活性，以探讨CO中毒对NO及NOS活性的影响。
1 材料和方法
1.1仪器和试剂
, 百拇医药
CO气，纯度为99.99%，由北京氦普北分气体工业有限公司提供。CO快速检测管，由北京市朝阳区北苑检测分析仪器厂提供。DU-640型紫外可见分光光度计为美国Beckman公司产品。NO试剂盒及NOS试剂盒由北京东亚免疫技术研究所提供。其余试剂均为国产分析纯。
1.2 动物和分组
健康雄性Wistar大鼠26只，体重280～320g，由中国医科大学实验动物部提供。随机分成2组，C组和CO组，每组13只。
1.3 CO中毒模型建立
参照Ishiropoulos.H[3]的方法。把鼠放入自制染毒瓶中，充入CO气，以CO快速检测管测定染毒瓶中CO浓度，使CO浓度维持在3500～4000ppm，使鼠静式吸入CO气40～60min致大鼠昏迷。
, 百拇医药
1.4 动物处理
C组不染毒，随机分入C组后即进行处理；CO组大鼠在染毒后10min处理。处理方法：10%水合氯醛按300mg/kg对大鼠行腹腔注射麻醉，断头处死，解剖取脑，分离出小脑在深低温(-70℃)冰箱中保存。
1.5 NOS活性、NO测定
在有氧和辅助因子的情况下，NOS催化L-精氨酸生成L-胍氨酸和NO，由于氧和血红蛋白可与NO迅速而不可逆地生成高铁血红蛋白(MG)，因而，通过分光光度法(双波长法)检测形成的MG，可反映由NOS催化生成的NO量，从而间接测定NOS的活性。小脑组织样品按20%(重量/体积)比例加入pH7.2的磷酸钾缓冲液，离心，取上清加入L-Arg，NADPH(还原型辅酶Ⅱ)等，立即计时，用DU-640型分光光度计在401nm和421nm波长同时测定每一样本的OD值，每隔30s记录一次至3min。用Lowery法测定上清液中的蛋白含量。最后据公式计算出每克蛋白每分钟产生NO量，即NOS活性，单位为nmol.min-1.gprot-1。应用改良的Griess法[4]。通过测定NO代谢产物亚硝酸盐(NO2-)和硝酸盐(NO3-)的浓度作为衡量NO含量的指标。具体操作参照NO试剂盒说明书。用lowery法测定上清液中蛋白含量，NO含量的单位是(μnmol.gprot-1)。
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1.6 统计学处理
各项指标均以平均值加减标准差(
±s)表示，结果分析用t检验。以P<0.05表示在统计学上有显著性差异，P<0.01表示有非常显著差异。
2 结 果
小脑中：CO组较C组NO明显增高(P<0.05)，CO组较C组NOS活性明显降低(P<0.01)。见表1。
表1 各组NO及NOS活性的变化 组别
NO(μnmol.gprot-1)
NOS(μnmol.min-1.gprot-1)
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C
1.02±0.23(13)
5.85±0.60(13)
CO
1.36±0.34(13)
3.76±0.62(10)
注：代表与C组比差异显著(P<0.05)，代表与C组比差异显著(P<0.01)3 讨 论
我们的实验结果显示在小脑中CO染毒后NO增高，NOS活性在CO染毒后降低。NOS活性下降有以下几种可能：①CO在脑组织中与NOS的辅助因子铁原卟啉IX结合，使之失去传递电子的作用，抑制了NOS的活性[5]。②CO中毒引起脑缺氧，大量神经元受损，NOS神经元减少，从而使NOS合成减少，NOS活性下降。③NOS活性的下降与快速升高的NO有关，因为NO可使NOS中的巯基亚硝基化，导致NOS失活。CO中毒后小脑内NO的升高可能与以下几种因素有关：①CO中毒致脑缺氧时，谷氨酸释放增加，使NMDA受体依赖的Ca2+通道过度激活，大量Ca2+内流并与钙调蛋白(CaM)结合，因此受到Ca2+-CaM直接调节的NOS被大量激活，导致合成过量的NO[6]。②据报道，昏迷与脑的低灌流有关，与对照组相比，CO致鼠昏迷后的血流量降至50%，并认为脑组织中的NO浓度的增高是对血压降低的一种反应。③据报道[7]，低氧可引起血管内皮细胞、单核细胞分泌一些细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-8(IL-8)等，它们可诱导血管平滑肌细胞、神经胶质细胞产生iNOS。所以CO中毒后小脑中NO的升高可能为低氧诱导的一些细胞因子诱导了神经胶质细胞产生iNOS，使NO含量升高[8]。但NO与NOS活性变化的不一致尚有待于进一步探讨。在大脑组织中NO与NOS活性均降低，变化与小脑组织不同，已另文发表。
, 百拇医药
参考文献
1，白欣立.一氧化氮在神经系统中的作用.医学综述，1996，2：655.
2，何凤生.一氧化碳中毒研究动态.工业卫生与职业病，1984，10：259.
3，H Ischiropoulos，MF Beers，ST Ohnishi， et al.Nitric oxide production and perivascular tyrosine nitration in brain after carbon monoxide poisoning in the rat.J Clin Invest，1996，97：2260.
4，Green LC，Wagner DA，Glogowski J，et al.Analysis of nitrate，and [15N] nitrite in biological fluids.Anal Biochem，1982，126：131.
, http://www.100md.com
5，Nathan C.Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells.FASEBJ，1992，6：3051.
6，Fujisawa H，Dawson D，Browe SE，et al.Pharmacological madification of glutamate neurotoxicity in vivo.Brain Res，1993，629：73.
7，Karakum M，Shreeiwas R，Chen J，et al.Hypoxia induction of interleukin-8 gene expression in human endothelium cells.J Clin Invest，1994，3：1564.
8，GHezzi P，Dinarello CA，Bianchi S，et al.Hypoxia increase production of interleukin-l and tumor necrosis factor by human mononuclear cells.Cytokines，1991，3：189.
收稿：1998-12-29，修回：2000-02-16, http://www.100md.com
单位：王燕(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院急诊科)；刘郁(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院急诊科)
关键词：急性一氧化碳中毒；一氧化氮；一氧化氮合酶；小脑
急诊医学000305
【摘要】 目的：研究急性一氧化碳(CO)中毒大鼠小脑组织中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)活性的变化，以探讨NO、NOS与急性CO中毒脑损伤的关系。方法：实验用Wistar大鼠26只，随机分为两组：正常对照组(C组)，CO染毒组(CO组)。采用改良的Griess法、分光光度法分别测定小脑组织中NO、NOS活性。结果：CO中毒后小脑组织中NO明显增高(P<0.05)，NOS活性明显降低(P<0.01)。结论：急性CO中毒脑组织损伤与小脑组织中NOS活性受抑制、NO含量增高有关。
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Changes in levels of nitric oxide and activities of nitric oxide synthase in cerebellum after carbon monoxide poisoning in rat
Wang Yan，Liu Yu.
(Department of Emergency Medicine，First Hospital Affiliated.China Medical University，Shenyang，110001)
【Abstract】 Objective：Carbon monoxide(CO) continues to be a common cause of poisoning mortality and morbidity worldwide.The purpose of this study was to evaluate levels of nitric oxide(NO) and nitric oxide synthase(NOS) in the rat brain after exposure to carbon monoxide.Methods：Twenty-six male Wistar rats were randomly divided into 2 groups：Group 1，control group；Group 2，CO exposure.NO levels were measured by Griess’ method，and NOS activity was measured by spectrophotometry.NO，NOS levels were compared between the 2 groups.Results were analyzed using t-test.Results：In the rat cerebellum，that of NO increased and that of NOS decreased after CO exposure.Conclusion：Activity of NOS was inhibited in the rat cerebellum after CO exposure.The production of NO increased in the rat cerebellum after CO exposure.The demonstrated changes in levels of NO and NOS may play an important role in the neurologic damage resulting from CO poisoning.
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【Key words】CO poisoning Nitric oxide Nitric oxide synthase cerebellum
近年来对一氧化氮(nitric oxide，NO)的研究发现，NO作为非经典神经递质、细胞功能调节因子 ，具有舒张血管、抑制血管平滑肌增殖等重要的生理功能。但NO过量产生和释放时具有神经毒性[1]。催化NO生物合成的酶称为一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)。CO中毒致脑损伤的机制至今未明[2]。CO中毒致脑损伤的机制与NO的关系尚不清楚，急性CO中毒对大鼠脑组织中NO、NOS活性的影响国内外尚未有研究报道，本实验应用动物模型，分别测定CO染毒大鼠小脑组织中NO、NOS活性，以探讨CO中毒对NO及NOS活性的影响。
1 材料和方法
1.1仪器和试剂
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CO气，纯度为99.99%，由北京氦普北分气体工业有限公司提供。CO快速检测管，由北京市朝阳区北苑检测分析仪器厂提供。DU-640型紫外可见分光光度计为美国Beckman公司产品。NO试剂盒及NOS试剂盒由北京东亚免疫技术研究所提供。其余试剂均为国产分析纯。
1.2 动物和分组
健康雄性Wistar大鼠26只，体重280～320g，由中国医科大学实验动物部提供。随机分成2组，C组和CO组，每组13只。
1.3 CO中毒模型建立
参照Ishiropoulos.H[3]的方法。把鼠放入自制染毒瓶中，充入CO气，以CO快速检测管测定染毒瓶中CO浓度，使CO浓度维持在3500～4000ppm，使鼠静式吸入CO气40～60min致大鼠昏迷。
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1.4 动物处理
C组不染毒，随机分入C组后即进行处理；CO组大鼠在染毒后10min处理。处理方法：10%水合氯醛按300mg/kg对大鼠行腹腔注射麻醉，断头处死，解剖取脑，分离出小脑在深低温(-70℃)冰箱中保存。
1.5 NOS活性、NO测定
在有氧和辅助因子的情况下，NOS催化L-精氨酸生成L-胍氨酸和NO，由于氧和血红蛋白可与NO迅速而不可逆地生成高铁血红蛋白(MG)，因而，通过分光光度法(双波长法)检测形成的MG，可反映由NOS催化生成的NO量，从而间接测定NOS的活性。小脑组织样品按20%(重量/体积)比例加入pH7.2的磷酸钾缓冲液，离心，取上清加入L-Arg，NADPH(还原型辅酶Ⅱ)等，立即计时，用DU-640型分光光度计在401nm和421nm波长同时测定每一样本的OD值，每隔30s记录一次至3min。用Lowery法测定上清液中的蛋白含量。最后据公式计算出每克蛋白每分钟产生NO量，即NOS活性，单位为nmol.min-1.gprot-1。应用改良的Griess法[4]。通过测定NO代谢产物亚硝酸盐(NO2-)和硝酸盐(NO3-)的浓度作为衡量NO含量的指标。具体操作参照NO试剂盒说明书。用lowery法测定上清液中蛋白含量，NO含量的单位是(μnmol.gprot-1)。
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1.6 统计学处理
各项指标均以平均值加减标准差(
±s)表示，结果分析用t检验。以P<0.05表示在统计学上有显著性差异，P<0.01表示有非常显著差异。2 结 果
小脑中：CO组较C组NO明显增高(P<0.05)，CO组较C组NOS活性明显降低(P<0.01)。见表1。
表1 各组NO及NOS活性的变化 组别
NO(μnmol.gprot-1)
NOS(μnmol.min-1.gprot-1)
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C
1.02±0.23(13)
5.85±0.60(13)
CO
1.36±0.34(13)
3.76±0.62(10)
注：代表与C组比差异显著(P<0.05)，代表与C组比差异显著(P<0.01)3 讨 论
我们的实验结果显示在小脑中CO染毒后NO增高，NOS活性在CO染毒后降低。NOS活性下降有以下几种可能：①CO在脑组织中与NOS的辅助因子铁原卟啉IX结合，使之失去传递电子的作用，抑制了NOS的活性[5]。②CO中毒引起脑缺氧，大量神经元受损，NOS神经元减少，从而使NOS合成减少，NOS活性下降。③NOS活性的下降与快速升高的NO有关，因为NO可使NOS中的巯基亚硝基化，导致NOS失活。CO中毒后小脑内NO的升高可能与以下几种因素有关：①CO中毒致脑缺氧时，谷氨酸释放增加，使NMDA受体依赖的Ca2+通道过度激活，大量Ca2+内流并与钙调蛋白(CaM)结合，因此受到Ca2+-CaM直接调节的NOS被大量激活，导致合成过量的NO[6]。②据报道，昏迷与脑的低灌流有关，与对照组相比，CO致鼠昏迷后的血流量降至50%，并认为脑组织中的NO浓度的增高是对血压降低的一种反应。③据报道[7]，低氧可引起血管内皮细胞、单核细胞分泌一些细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-8(IL-8)等，它们可诱导血管平滑肌细胞、神经胶质细胞产生iNOS。所以CO中毒后小脑中NO的升高可能为低氧诱导的一些细胞因子诱导了神经胶质细胞产生iNOS，使NO含量升高[8]。但NO与NOS活性变化的不一致尚有待于进一步探讨。在大脑组织中NO与NOS活性均降低，变化与小脑组织不同，已另文发表。
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参考文献
1，白欣立.一氧化氮在神经系统中的作用.医学综述，1996，2：655.
2，何凤生.一氧化碳中毒研究动态.工业卫生与职业病，1984，10：259.
3，H Ischiropoulos，MF Beers，ST Ohnishi， et al.Nitric oxide production and perivascular tyrosine nitration in brain after carbon monoxide poisoning in the rat.J Clin Invest，1996，97：2260.
4，Green LC，Wagner DA，Glogowski J，et al.Analysis of nitrate，and [15N] nitrite in biological fluids.Anal Biochem，1982，126：131.
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5，Nathan C.Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells.FASEBJ，1992，6：3051.
6，Fujisawa H，Dawson D，Browe SE，et al.Pharmacological madification of glutamate neurotoxicity in vivo.Brain Res，1993，629：73.
7，Karakum M，Shreeiwas R，Chen J，et al.Hypoxia induction of interleukin-8 gene expression in human endothelium cells.J Clin Invest，1994，3：1564.
8，GHezzi P，Dinarello CA，Bianchi S，et al.Hypoxia increase production of interleukin-l and tumor necrosis factor by human mononuclear cells.Cytokines，1991，3：189.
收稿：1998-12-29，修回：2000-02-16, http://www.100md.com