老年期痴呆患者脑脊液微管相关蛋白tau的检测
作者：王琨 丁新生 程虹 沈霞 姚娟 邓晓萱
单位：王琨 沈霞(徐州医学院附属医院 221002)；丁新生 程虹 姚娟 邓晓萱(南京医科大学第一附属医院)
关键词：老年期痴呆；脑脊液；ELISA；tau蛋白
临床神经病学杂志000321 【摘要】 目的 探讨老年期痴呆(SD)患者脑脊液(CSF)中微管相关蛋白tau(以下简称tau)的检测方法。方法 采用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法检测26例SD患者和30例非神经系统疾病患者的CSF-tau。结果 两者浓度分别为473±279、151±60 pg/ml，有极显著差异(P<0.001)；本法灵敏度为53.8%,特异性为83.3%，检出限60 pg/ml，组内变异1.2%～5.9%,组间变异1.7%～6.0%。结论 采用双抗体夹心ELISA法检测SD患者CSF-tau的浓度可为诊断SD提供有价值的参考依据。
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老年期痴呆(SD)主要包括老年性痴呆(AD)和血管性痴呆(VD)。在欧美以前者多见，东方国家则以后者多见，我国尚无定论[1,2]。二者不同程度地存在有较多的神经元纤维缠结(NFTs),电镜下的NFTs由双股螺旋细丝(PHFs)组成，过度磷酸化的tau蛋白是PHFs的主要成份[3]。这种tau释放到脑脊液(CSF)中可以用ELISA法检测到。国外近年来已开展这方面的研究并有不少报道[4～8]。为探讨SD的实验诊断方法，我们于1998年6月起开展了ELISA法检测SD患者CSF-tau的研究。现将其检测方法及结果介绍如下。
1 对象与方法
1.1 对象 SD组26例(其中AD14例,VD12例),年龄49～78岁,平均63±10岁;对照组30例,年龄49～76岁,平均62±10岁。AD诊断全部符合美国NINCDC-ADRDA的“很可能是AD”的诊断标准[9]，哈金斯基缺血量表(HIS)得分≤5分，简易智能筛查表(MMSE)得分≤21分;VD诊断全部符合国际上的ICD-10-F01诊断标准，HIS≥7分，MMSE≤21分；对照组30例均为非神经系统疾病手术行腰麻者，MMSE≥27分，头颅CT证实无脑萎缩和脑梗死者。
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1.2 方法
1.2.1 试剂 (1)96孔用小鼠抗人tau单抗(AT120)包被的酶标微量滴定板；(2)冻干重组人tau蛋白标准品，用前以500 μl标本稀释液稀释；(3)偶联剂I：含两种生物素化的单克隆抗人tau抗体(HT7和BT2)，用前稀释100倍；(4)偶联剂Ⅱ：抗生物素偶联的过氧化物酶，用前稀释100倍；(5)其它：标本稀释液、偶联剂稀释液、TMB显色液、底物缓冲液、洗涤液等，分别用于不同试剂的稀释、显色和洗板；(6)Clini-Bio 128 C全自动酶标仪。
1.2.2 CSF标本 上述56例被检者均经腰穿采集CSF 2 ml，置-80℃冰箱保存待测。
1.2.3 检测方法 双抗体夹心ELISA法，固相抗体AT120,液相抗体HT7和BT2，抗原为人tau蛋白。操作程序：所有试剂和标本在用前置室温平衡30 min；各种试剂按要求倍数稀释；每份CSF各取0.2 ml按1∶2用标本稀释液稀释备用；在每一滴定孔内加入偶联剂Ⅰ75 μl,随后加入标准品tau(标准管)、标本稀释液(空白对照管)、稀释好的标本(待测管)各25 μl，使每孔反应体积均为100 μl；混匀，parafilm密封，置25℃孵育过夜；抛干孔后洗板4次；加入偶联剂Ⅱ100 μl，混匀，密封，25℃孵育40分钟；抛干洗板4次；加入TMB显色液100 μl，25℃孵育30分钟；加入终止液100 μl，置酶标仪450 nm，空白孔调零后读取2次A值，取其均数为结果。依标准tau浓度梯度和相应A值求
=a+bX 的回归方程，依方程求标本tau值。
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1.2.4 统计学处理 用SPSS统计学软件计算各组tau值，采用均数±标准差(
±s)表示，组间比较F检验。
2 结 果
2.1 CSF tau回归方程 标准孔tau和A值见表1。将表1数据代入=a+bX，得出tau的回归方程为tau=3507.88×A-40.135。
表1 标准管tau和A值 管号
1
2
3
4
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5
6
tau(pg/ml)
1200
600
300
150
75
0
A 值
0.360
0.168
0.810
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0.530
0.500
0
2.2 各组CSF tau浓度见表2。表2 各痴呆组与对照组CSF-tau比较(±s) 组 别
CSF-tau含量(pg/ml)
AD(n=14)
483.3±285.7**
VD(n=12)
461.0±288.7**
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SD(n=26)
473.0±279.5*
对照组(n=30)
151.3±60.4
与对照组比较*P<0.01,**P<0.001
2.3 本检测的实验技术参数 (1)灵敏度和特异性：以对照组tau±2s(151.3+2×60.4=272.1 pg/ml)为界值，判断本法灵敏度和特异性分别为53.84%、83.33%。(2)检出限与回收率：以12次测试标本稀释液的平均A值+4s为检出限下限，59.9 pg/ml,回收率 92.16%。(3)实验变异：组内1.2%～5.9%，组间1.7%～6.0%。
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3 讨 论
本实验采用双抗体夹心(AT120与HT7/BT2)ELISA法检测CSF-tau抗原，所测tau为CSF总tau,包括正常微管相关蛋白tau和过度磷酸化的tau。正常情况下tau存在于神经元内，尤以轴索中丰富，其生理功能主要与胞浆或轴浆运输有关，可能的机理是通过提高微管的稳定性来实现的，而微管的一个主要作用是胞浆或轴浆运输[3]。正常tau与AD病人的tau(PHFs-tau)在聚合、磷酸化、微管结合和装配能力以及糖基化等方面有很大差异，后者为过度磷酸化和糖基化的tau，由于其微管结合区的自我结合导致了其对微管稳定性作用的丧失，微管稳定性的丧失则导致了其运输功能的障碍，进而造成了神经纤维及神经元的变性和坏死。当神经元崩解后，tau释放到CSF中。因此，检测CSF-tau可以间接反映神经元变性、坏死和轴索崩解情况。但目前只能检测CSF总tau，尚无法单独检测过度磷酸化tau。
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在1998年，日本的Kanai等[7]人用同一种试剂盒检测了276例病人和对照者CSF，其结果为AD 489±298，VD 267±146，NC 217±128，灵敏度 40%，特异性86.0%。从Kanai资料与本资料的结果看，两组结果相近，可见本法有较好的可重复性和可靠性。
尽管痴呆的人口比例不断上升，人们对痴呆的认识也不断深化，但痴呆的生前诊断仍停留在临床量表水平，早期依靠客观的检测手段诊断仍很困难。我们采用双抗体夹心ELISA法检测SD患者CSF-tau可以为生前诊断SD提供一个有价值的生物学参考指标。
参 考 文 献
1，高素荣主编. 痴呆诊疗学. 第1版. 北京: 北京科学技术出版社,1998.2
2，Kokmen E,Beard CM,O'Brein PC,et al. Is the incidence of dementing illness changing? Neurology，1994，43:1887
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3，盛树力主编. 老年性痴呆.从分子生物学到临床诊治. 第1版.北京: 科学技术文献出版社，1998.188
4，Vandermeeren M，Mercken M,Vanmeche E,et al.Delection of tau proteins in normal and Alzheimer's disease cerebrospinal fluid with a sensitive sandwich enzyme-linked immunosorbant assay.J Neurol Chem，1993,61:1828
5，Arai H，Terajima M,Miura M，et al. Tau in cerebrospinal fluid:A potential diagnostic maker of Alzheimer's disease. Ann Neurol，1995,38:649
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6，Blennow K，Wallin A，Agren H，et al. Tau protein in cerebrospinal fluid: A biochemical marker of axonal degeneration in Alzheimer's disease. Mole Chem Neuropathol，1995,26:231
7，Kanai M，Matsubara E，Isoe K，et al. Longitudial study of cerebrospinal fluid levels of tau、Aβ1-40 and Aβ1-42(43) in Alzheimer's disease: A study in Japan. Ann Neurology，1998,44:17
8，John Q，Trojanowski A，Christopher M，et al. Elevated levels of tau in cerebrospinal fluid:implications for the antemortem diagnosis of Alzheimer's disease.Alzheimer's Disease Review，1996,1:77
9，Mckham G，Drachman D，Folstein M,et al. Clinical diagnosis of Alzheimer's disease: Report of the NINCDS-ADRDA work group under auspices of department of health and human services task force on Alzheimer's disease. Neurology,1984,34:939
收稿1999-07-02
修回1999-11-15, 百拇医药
单位：王琨 沈霞(徐州医学院附属医院 221002)；丁新生 程虹 姚娟 邓晓萱(南京医科大学第一附属医院)
关键词：老年期痴呆；脑脊液；ELISA；tau蛋白
临床神经病学杂志000321 【摘要】 目的 探讨老年期痴呆(SD)患者脑脊液(CSF)中微管相关蛋白tau(以下简称tau)的检测方法。方法 采用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法检测26例SD患者和30例非神经系统疾病患者的CSF-tau。结果 两者浓度分别为473±279、151±60 pg/ml，有极显著差异(P<0.001)；本法灵敏度为53.8%,特异性为83.3%，检出限60 pg/ml，组内变异1.2%～5.9%,组间变异1.7%～6.0%。结论 采用双抗体夹心ELISA法检测SD患者CSF-tau的浓度可为诊断SD提供有价值的参考依据。
, 百拇医药
老年期痴呆(SD)主要包括老年性痴呆(AD)和血管性痴呆(VD)。在欧美以前者多见，东方国家则以后者多见，我国尚无定论[1,2]。二者不同程度地存在有较多的神经元纤维缠结(NFTs),电镜下的NFTs由双股螺旋细丝(PHFs)组成，过度磷酸化的tau蛋白是PHFs的主要成份[3]。这种tau释放到脑脊液(CSF)中可以用ELISA法检测到。国外近年来已开展这方面的研究并有不少报道[4～8]。为探讨SD的实验诊断方法，我们于1998年6月起开展了ELISA法检测SD患者CSF-tau的研究。现将其检测方法及结果介绍如下。
1 对象与方法
1.1 对象 SD组26例(其中AD14例,VD12例),年龄49～78岁,平均63±10岁;对照组30例,年龄49～76岁,平均62±10岁。AD诊断全部符合美国NINCDC-ADRDA的“很可能是AD”的诊断标准[9]，哈金斯基缺血量表(HIS)得分≤5分，简易智能筛查表(MMSE)得分≤21分;VD诊断全部符合国际上的ICD-10-F01诊断标准，HIS≥7分，MMSE≤21分；对照组30例均为非神经系统疾病手术行腰麻者，MMSE≥27分，头颅CT证实无脑萎缩和脑梗死者。
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1.2 方法
1.2.1 试剂 (1)96孔用小鼠抗人tau单抗(AT120)包被的酶标微量滴定板；(2)冻干重组人tau蛋白标准品，用前以500 μl标本稀释液稀释；(3)偶联剂I：含两种生物素化的单克隆抗人tau抗体(HT7和BT2)，用前稀释100倍；(4)偶联剂Ⅱ：抗生物素偶联的过氧化物酶，用前稀释100倍；(5)其它：标本稀释液、偶联剂稀释液、TMB显色液、底物缓冲液、洗涤液等，分别用于不同试剂的稀释、显色和洗板；(6)Clini-Bio 128 C全自动酶标仪。
1.2.2 CSF标本 上述56例被检者均经腰穿采集CSF 2 ml，置-80℃冰箱保存待测。
1.2.3 检测方法 双抗体夹心ELISA法，固相抗体AT120,液相抗体HT7和BT2，抗原为人tau蛋白。操作程序：所有试剂和标本在用前置室温平衡30 min；各种试剂按要求倍数稀释；每份CSF各取0.2 ml按1∶2用标本稀释液稀释备用；在每一滴定孔内加入偶联剂Ⅰ75 μl,随后加入标准品tau(标准管)、标本稀释液(空白对照管)、稀释好的标本(待测管)各25 μl，使每孔反应体积均为100 μl；混匀，parafilm密封，置25℃孵育过夜；抛干孔后洗板4次；加入偶联剂Ⅱ100 μl，混匀，密封，25℃孵育40分钟；抛干洗板4次；加入TMB显色液100 μl，25℃孵育30分钟；加入终止液100 μl，置酶标仪450 nm，空白孔调零后读取2次A值，取其均数为结果。依标准tau浓度梯度和相应A值求
=a+bX 的回归方程，依方程求标本tau值。, http://www.100md.com
1.2.4 统计学处理 用SPSS统计学软件计算各组tau值，采用均数±标准差(
±s)表示，组间比较F检验。2 结 果
2.1 CSF tau回归方程 标准孔tau和A值见表1。将表1数据代入
=a+bX，得出tau的回归方程为tau=3507.88×A-40.135。表1 标准管tau和A值 管号
1
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tau(pg/ml)
1200
600
300
150
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A 值
0.360
0.168
0.810
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0.530
0.500
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2.2 各组CSF tau浓度见表2。表2 各痴呆组与对照组CSF-tau比较(
±s) 组 别CSF-tau含量(pg/ml)
AD(n=14)
483.3±285.7**
VD(n=12)
461.0±288.7**
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SD(n=26)
473.0±279.5*
对照组(n=30)
151.3±60.4
与对照组比较*P<0.01,**P<0.001
2.3 本检测的实验技术参数 (1)灵敏度和特异性：以对照组tau
±2s(151.3+2×60.4=272.1 pg/ml)为界值，判断本法灵敏度和特异性分别为53.84%、83.33%。(2)检出限与回收率：以12次测试标本稀释液的平均A值+4s为检出限下限，59.9 pg/ml,回收率 92.16%。(3)实验变异：组内1.2%～5.9%，组间1.7%～6.0%。, 百拇医药
3 讨 论
本实验采用双抗体夹心(AT120与HT7/BT2)ELISA法检测CSF-tau抗原，所测tau为CSF总tau,包括正常微管相关蛋白tau和过度磷酸化的tau。正常情况下tau存在于神经元内，尤以轴索中丰富，其生理功能主要与胞浆或轴浆运输有关，可能的机理是通过提高微管的稳定性来实现的，而微管的一个主要作用是胞浆或轴浆运输[3]。正常tau与AD病人的tau(PHFs-tau)在聚合、磷酸化、微管结合和装配能力以及糖基化等方面有很大差异，后者为过度磷酸化和糖基化的tau，由于其微管结合区的自我结合导致了其对微管稳定性作用的丧失，微管稳定性的丧失则导致了其运输功能的障碍，进而造成了神经纤维及神经元的变性和坏死。当神经元崩解后，tau释放到CSF中。因此，检测CSF-tau可以间接反映神经元变性、坏死和轴索崩解情况。但目前只能检测CSF总tau，尚无法单独检测过度磷酸化tau。
, http://www.100md.com
在1998年，日本的Kanai等[7]人用同一种试剂盒检测了276例病人和对照者CSF，其结果为AD 489±298，VD 267±146，NC 217±128，灵敏度 40%，特异性86.0%。从Kanai资料与本资料的结果看，两组结果相近，可见本法有较好的可重复性和可靠性。
尽管痴呆的人口比例不断上升，人们对痴呆的认识也不断深化，但痴呆的生前诊断仍停留在临床量表水平，早期依靠客观的检测手段诊断仍很困难。我们采用双抗体夹心ELISA法检测SD患者CSF-tau可以为生前诊断SD提供一个有价值的生物学参考指标。
参 考 文 献
1，高素荣主编. 痴呆诊疗学. 第1版. 北京: 北京科学技术出版社,1998.2
2，Kokmen E,Beard CM,O'Brein PC,et al. Is the incidence of dementing illness changing? Neurology，1994，43:1887
, 百拇医药
3，盛树力主编. 老年性痴呆.从分子生物学到临床诊治. 第1版.北京: 科学技术文献出版社，1998.188
4，Vandermeeren M，Mercken M,Vanmeche E,et al.Delection of tau proteins in normal and Alzheimer's disease cerebrospinal fluid with a sensitive sandwich enzyme-linked immunosorbant assay.J Neurol Chem，1993,61:1828
5，Arai H，Terajima M,Miura M，et al. Tau in cerebrospinal fluid:A potential diagnostic maker of Alzheimer's disease. Ann Neurol，1995,38:649
, 百拇医药
6，Blennow K，Wallin A，Agren H，et al. Tau protein in cerebrospinal fluid: A biochemical marker of axonal degeneration in Alzheimer's disease. Mole Chem Neuropathol，1995,26:231
7，Kanai M，Matsubara E，Isoe K，et al. Longitudial study of cerebrospinal fluid levels of tau、Aβ1-40 and Aβ1-42(43) in Alzheimer's disease: A study in Japan. Ann Neurology，1998,44:17
8，John Q，Trojanowski A，Christopher M，et al. Elevated levels of tau in cerebrospinal fluid:implications for the antemortem diagnosis of Alzheimer's disease.Alzheimer's Disease Review，1996,1:77
9，Mckham G，Drachman D，Folstein M,et al. Clinical diagnosis of Alzheimer's disease: Report of the NINCDS-ADRDA work group under auspices of department of health and human services task force on Alzheimer's disease. Neurology,1984,34:939
收稿1999-07-02
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