DMD/BMD基因诊断及其临床分析*(附33例报告)
作者：吕佩源 郝玉宾 赵宝华 胡爱祥 郭文潮 朱俊真
单位：吕佩源(050051 河北省人民医院神经内科)；赵宝华(050051 河北省人民医院神经内科)；胡爱祥(050051 河北省人民医院神经内科)；郝玉宾(三优中心)；郭文潮(三优中心)；朱俊真(三优中心)
关键词：进行性肌营养不良；抗肌营养不良蛋白；聚合酶链反应；外显子缺失
脑与神经疾病杂志000306 摘 要 目的：研究Duchenne/Becker型肌营养不良症(DMD/BMD)患者致病基因外显子缺失的分布特点及其与临床表现的关系。 方法： 利用9对引物以多重PCR技术对33例DMD/BMD患者进行致病基因诊断。 结果： 9对引物外显子缺失总检出率为45.5%， 主要分布在中央缺失热区和5′端缺失热区， 其中以45、48号外显子缺失最多见， 且缺失片段长度各异。 结论： (1)该病病情轻重可能与基因缺失的外显子数量及片段大小不呈平行关系， 而与某些外显子缺失有关。 (2)致病基因的表达也受到个体差异的影响， 呈高度的遗传异质性。
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Gene Deletion Analysis in 33 Patients with Duchenne/Becker Muscular Dystrophy
Lu Peiyuan Hao Yubin Zhao Baohua
(Department of Neurology, Hebei Provincial People's Hospital, Shijiazhuang 050071)
Abstract Objective： To study the distributive characteristics of dystrophin gence deletion and the relationship between the number of deletion and clinical symptoms in Duchenne/Becker muscular dystrophin (DMD/BMD). Methods: 33 patients were detected by 9 primers mPCR and the distribution of the exon deletion of dystropin gene was analyzed. Results:9 primers mPCR could detect 45.5% of all the cases of DMD/BMD. The deletion of exon were mainly distributed in central and 5′-extreme "hot spot", especially fell in exon 45 and 48. Conclusion: It might be possible that some correlation existed between the certain exon and the degree of severity of the disease. DMD/BMD were highly heterogeneous in clinical manifestation and in inheritance pattern.
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Key words DMD/BMD dystrophin PCR exon deletion▲
Duchenne型肌营养不良症(DMD)和Becker型肌营养不良症(BMD)是神经肌肉较常见的一种X连锁隐形遗传病。分子生物学研究表明，抗肌营养不良蛋白(dystrophin)基因的异常导致其所编码的肌细胞膜骨架蛋白-dystrophin的合成障碍，进而引起肌细胞变性和坏死。以往传统检查手段及家系分析均缺乏特异性。近年来，随着分子遗传学技术在临床的广泛应用，直接检测致病基因为临床确诊DMD/BMD提供了可靠的依据。本文利用PCR技术对33例该病患者进行基因诊断，从而对突变高发区及其与临床病情的关系加以分析。
材料与方法
一、病例选择：
33例患者临床诊断为DMD/BMD，全部为汉族，男性，均来自我院神经内科，其中DMD31例，BMD2例；有家族史者4例，余均为散发；全部患者均有典型的临床表现，并经肌电图、血清肌酶酶谱检查证实。
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二、试剂来源
DMD/BMD9对引物多重PCR试剂盒购自北京中国医学科学院基础研究所，5对引物单-PCR试剂盒购自湖南医科大学国家重点医学遗传实验室。
三、方法
1.人基因组DNA制备：抽取抗凝(2%无菌EDTA)静脉血5ml，加入破膜液，37℃20分钟，离心3000转/分，15分钟，弃上清，加入3ml破核液和蛋白酶K，55℃消化4小时或37℃过夜，加入等体积饱和酚抽提，取上清在加入等体积1∶1=酚∶氯仿抽提，吸取上清加入2～3倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA，DNA用75%乙醇洗2遍，干燥后溶于TE buffer。用751紫外分光光度计测OD值，计算浓度与纯度。
2.PCR扩增：9对引物分成5对引物和4对引物两组，在50μl反应体系中加入：模板200～500ng，10×buffer5μl，dNTP(25mM，each)4μl，TMAC5μl，BSA(10μg/μl)，5对/4对引物混合物8.5μl(25pmol,each),最后加水至50μl，混合后离心数秒；至97℃预变性7分钟，离心15秒，迅速置冰上，加入Tag酶2.5U，混匀后加30μl液体石蜡，放入PCR仪中进行扩增。扩增条件为：94℃30秒，56℃30秒，70℃2分钟30个循环，最后70℃延伸5分钟。
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3.结果判断：取15μl扩增产物加入溴酚蓝载样缓冲液2μl，电泳60v～80v2小时，以正常男性模板扩增产物为对照，5条/4条扩增带都存在为正常。缺失任何一条带，经重复扩增后结果相同，诊断为基因缺失型DMD/BMD。
结 果
33例患者中，共发现15例外显子缺失，见表(1)，其中13例仅存在一个外显子缺失，2例存在2个外显子(分别为44，45和44，49)缺失，致病基因总检出率45.5%。缺失的外显子片段最长者为45号(547bp)，最短者为4号外显子(191bp)。
缺失的外显子分布情况见表(2)，其中以45，48号外显子缺失最多，各占4例；4，44和51号各2例。累及中央缺失热区(44～53号外显子)者检出率76.5%，5′端缺失热区(3～19号外显子)为23.5%。
表1 15例DMD/BMD基因缺失结果 例数
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发病年龄
DMD/BMD
缺失外显子
片段长度(bp)
1
5
D
45
547
2
23
B
27
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271
3
4
D
48
506
4
7
D
8
360
5
8
D
, 百拇医药
4
191
6
10
D
44，45
268，547
7
30
B
48
506
8
7
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D
51
388
9
8
D
45
547
10
6
D
45
547
11
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5
D
44，49
268，439
12
2
D
48
506
13
7
D
51
388
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14
9
D
4
191
15
7
D
48
506
表2 15例检出者外显子缺失分布
5′端缺失热区
中央缺失热区
, 百拇医药
外显子号
4
8
17
44
45
48
49
51
缺失例数
2
1
1
2
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4
4
1
2
百分比(%)
23.5
76.5
讨 论
Dystrophin基因是迄今为止人类分离到的最大的基因，它在X染色体上的编码跨度为2300kb，共包含79个外显子，正是由于此基因如此巨大，才使其具有高度的突变率，突变中55～65%为缺失，5～10%为重复，8%左右为插入，点突变占25%左右[1]。其中基因缺失主要分布在两个区域，即：中央缺失热区位于44～53号外显子区，约占70%，5′端缺失热区位于3～19号外显子区，约占20%。本研究结果分别为76.5%和23.5%，缺失分布符合上述病变特点。此外，9对引物检测致病基因的总检出率为45.5%，与国内外研究结果47～51%相近[2～3]。
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值得注意的是：表(1)中例6和例11分别为2个外显子缺失，即44，45(268bp,547bp)和44，49(268bp,439bp)，他们的临床病情并非严重，但另有两例仅4号外显子(191bp)缺失的DMD患儿却表现出了较重的病情，这说明该病病情轻重与基因缺失的数量及片段大小不呈平行关系，而与某些外显子缺失有关；Malhotra等报道经1、3、4、5、6、7号外显子缺失常导致重度的DMD表现[4]。本文资料观察的结果与之相符合，分析其原因，Monaco[5]认为可能取决于基因缺失对阅读框的影响，也就是说，若基因缺失打断阅读框或造成阅读框移码，致使dystrophin表达严重障碍，则产生典型的DMD；若基因缺失时，邻近的外显子能保持阅读框不变，而尚有部分dystrophin表达，则临床症状较轻表现为BMD。有些学者利用免疫组织化学技术特异性标记dystrophin后证实，该蛋白表达越少，临床病情则越重[6，7]。
另外，本研究15例外显子缺失者中，共有4例为48号外显子缺失，但临床表型不尽相同，其中3例为DMD，1例为BMD，与此相类似，谭庆荣[8]等也报告了一对孪生兄弟患儿同为8号外显子缺失，先证者2岁发病，但其兄弟数年后仍无临床症状，说明致病基因的表达也受到个体差异的影响。
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综上所述，不同的外显子缺失可在临床上表现出相同的症状，而同一外显子缺失却又可在不同的患者中表现出各异的临床症状，呈高度的遗传异质性。
河北省自然科学基金资助课题(编号：397402)
参 考 文 献
1，Roberts RG, Gardner RJ, Bobrow M. Searching for the 1 in 2 400 000: a review of dystrophin gene point mutations. Hum Mutat, 1994,4∶1～11.
2，潘速跃，张成，盛文利，等. 中国人抗肌营养不良蛋白基因缺失的分布特点. 中华神经科杂志， 1999；32(1)∶22～24.
3，Danieli GA, Mioni F,Muller CR, et al. Patterns of deletions of the dystrophin gene in different European populations. Hum Genet, 1993,91∶342～346.
, 百拇医药
4，Malhotra SB, Hart KA, Klamut HJ, et al. Frame-shift deletions in patients with Duchenne and Becker muscular dystrophy. Science, 1988,242∶755.
5，Monaco AP, Bertelson CJ, Liechti-Gallati S,et al. An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics, 1988,2∶90.
6，王伟文， 吴保仁， 颜真，等. 肌营养不良蛋白在假肥大肌营养不良症肌组织中的表达研究. 中华神经科杂志， 1998；31(1)∶34～36.
7，Maido M, et al. Musche histology in Becker muscular dystrophy. Muscle Nerve, 1991,14∶1067～1073.
8，谭庆荣，吴保仁， 王连刚，等. 两步多重聚合酶链反应对假肥大型肌营养不良的基因诊断. 中华神经精神杂志， 1994；27(4)∶223～225.
(1999-12-25 收稿), http://www.100md.com
单位：吕佩源(050051 河北省人民医院神经内科)；赵宝华(050051 河北省人民医院神经内科)；胡爱祥(050051 河北省人民医院神经内科)；郝玉宾(三优中心)；郭文潮(三优中心)；朱俊真(三优中心)
关键词：进行性肌营养不良；抗肌营养不良蛋白；聚合酶链反应；外显子缺失
脑与神经疾病杂志000306 摘 要 目的：研究Duchenne/Becker型肌营养不良症(DMD/BMD)患者致病基因外显子缺失的分布特点及其与临床表现的关系。 方法： 利用9对引物以多重PCR技术对33例DMD/BMD患者进行致病基因诊断。 结果： 9对引物外显子缺失总检出率为45.5%， 主要分布在中央缺失热区和5′端缺失热区， 其中以45、48号外显子缺失最多见， 且缺失片段长度各异。 结论： (1)该病病情轻重可能与基因缺失的外显子数量及片段大小不呈平行关系， 而与某些外显子缺失有关。 (2)致病基因的表达也受到个体差异的影响， 呈高度的遗传异质性。
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Gene Deletion Analysis in 33 Patients with Duchenne/Becker Muscular Dystrophy
Lu Peiyuan Hao Yubin Zhao Baohua
(Department of Neurology, Hebei Provincial People's Hospital, Shijiazhuang 050071)
Abstract Objective： To study the distributive characteristics of dystrophin gence deletion and the relationship between the number of deletion and clinical symptoms in Duchenne/Becker muscular dystrophin (DMD/BMD). Methods: 33 patients were detected by 9 primers mPCR and the distribution of the exon deletion of dystropin gene was analyzed. Results:9 primers mPCR could detect 45.5% of all the cases of DMD/BMD. The deletion of exon were mainly distributed in central and 5′-extreme "hot spot", especially fell in exon 45 and 48. Conclusion: It might be possible that some correlation existed between the certain exon and the degree of severity of the disease. DMD/BMD were highly heterogeneous in clinical manifestation and in inheritance pattern.
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Key words DMD/BMD dystrophin PCR exon deletion▲
Duchenne型肌营养不良症(DMD)和Becker型肌营养不良症(BMD)是神经肌肉较常见的一种X连锁隐形遗传病。分子生物学研究表明，抗肌营养不良蛋白(dystrophin)基因的异常导致其所编码的肌细胞膜骨架蛋白-dystrophin的合成障碍，进而引起肌细胞变性和坏死。以往传统检查手段及家系分析均缺乏特异性。近年来，随着分子遗传学技术在临床的广泛应用，直接检测致病基因为临床确诊DMD/BMD提供了可靠的依据。本文利用PCR技术对33例该病患者进行基因诊断，从而对突变高发区及其与临床病情的关系加以分析。
材料与方法
一、病例选择：
33例患者临床诊断为DMD/BMD，全部为汉族，男性，均来自我院神经内科，其中DMD31例，BMD2例；有家族史者4例，余均为散发；全部患者均有典型的临床表现，并经肌电图、血清肌酶酶谱检查证实。
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二、试剂来源
DMD/BMD9对引物多重PCR试剂盒购自北京中国医学科学院基础研究所，5对引物单-PCR试剂盒购自湖南医科大学国家重点医学遗传实验室。
三、方法
1.人基因组DNA制备：抽取抗凝(2%无菌EDTA)静脉血5ml，加入破膜液，37℃20分钟，离心3000转/分，15分钟，弃上清，加入3ml破核液和蛋白酶K，55℃消化4小时或37℃过夜，加入等体积饱和酚抽提，取上清在加入等体积1∶1=酚∶氯仿抽提，吸取上清加入2～3倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA，DNA用75%乙醇洗2遍，干燥后溶于TE buffer。用751紫外分光光度计测OD值，计算浓度与纯度。
2.PCR扩增：9对引物分成5对引物和4对引物两组，在50μl反应体系中加入：模板200～500ng，10×buffer5μl，dNTP(25mM，each)4μl，TMAC5μl，BSA(10μg/μl)，5对/4对引物混合物8.5μl(25pmol,each),最后加水至50μl，混合后离心数秒；至97℃预变性7分钟，离心15秒，迅速置冰上，加入Tag酶2.5U，混匀后加30μl液体石蜡，放入PCR仪中进行扩增。扩增条件为：94℃30秒，56℃30秒，70℃2分钟30个循环，最后70℃延伸5分钟。
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3.结果判断：取15μl扩增产物加入溴酚蓝载样缓冲液2μl，电泳60v～80v2小时，以正常男性模板扩增产物为对照，5条/4条扩增带都存在为正常。缺失任何一条带，经重复扩增后结果相同，诊断为基因缺失型DMD/BMD。
结 果
33例患者中，共发现15例外显子缺失，见表(1)，其中13例仅存在一个外显子缺失，2例存在2个外显子(分别为44，45和44，49)缺失，致病基因总检出率45.5%。缺失的外显子片段最长者为45号(547bp)，最短者为4号外显子(191bp)。
缺失的外显子分布情况见表(2)，其中以45，48号外显子缺失最多，各占4例；4，44和51号各2例。累及中央缺失热区(44～53号外显子)者检出率76.5%，5′端缺失热区(3～19号外显子)为23.5%。
表1 15例DMD/BMD基因缺失结果 例数
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发病年龄
DMD/BMD
缺失外显子
片段长度(bp)
1
5
D
45
547
2
23
B
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271
3
4
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48
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4
7
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8
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4
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B
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14
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表2 15例检出者外显子缺失分布
5′端缺失热区
中央缺失热区
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外显子号
4
8
17
44
45
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51
缺失例数
2
1
1
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, 百拇医药
4
4
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百分比(%)
23.5
76.5
讨 论
Dystrophin基因是迄今为止人类分离到的最大的基因，它在X染色体上的编码跨度为2300kb，共包含79个外显子，正是由于此基因如此巨大，才使其具有高度的突变率，突变中55～65%为缺失，5～10%为重复，8%左右为插入，点突变占25%左右[1]。其中基因缺失主要分布在两个区域，即：中央缺失热区位于44～53号外显子区，约占70%，5′端缺失热区位于3～19号外显子区，约占20%。本研究结果分别为76.5%和23.5%，缺失分布符合上述病变特点。此外，9对引物检测致病基因的总检出率为45.5%，与国内外研究结果47～51%相近[2～3]。
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值得注意的是：表(1)中例6和例11分别为2个外显子缺失，即44，45(268bp,547bp)和44，49(268bp,439bp)，他们的临床病情并非严重，但另有两例仅4号外显子(191bp)缺失的DMD患儿却表现出了较重的病情，这说明该病病情轻重与基因缺失的数量及片段大小不呈平行关系，而与某些外显子缺失有关；Malhotra等报道经1、3、4、5、6、7号外显子缺失常导致重度的DMD表现[4]。本文资料观察的结果与之相符合，分析其原因，Monaco[5]认为可能取决于基因缺失对阅读框的影响，也就是说，若基因缺失打断阅读框或造成阅读框移码，致使dystrophin表达严重障碍，则产生典型的DMD；若基因缺失时，邻近的外显子能保持阅读框不变，而尚有部分dystrophin表达，则临床症状较轻表现为BMD。有些学者利用免疫组织化学技术特异性标记dystrophin后证实，该蛋白表达越少，临床病情则越重[6，7]。
另外，本研究15例外显子缺失者中，共有4例为48号外显子缺失，但临床表型不尽相同，其中3例为DMD，1例为BMD，与此相类似，谭庆荣[8]等也报告了一对孪生兄弟患儿同为8号外显子缺失，先证者2岁发病，但其兄弟数年后仍无临床症状，说明致病基因的表达也受到个体差异的影响。
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河北省自然科学基金资助课题(编号：397402)
参 考 文 献
1，Roberts RG, Gardner RJ, Bobrow M. Searching for the 1 in 2 400 000: a review of dystrophin gene point mutations. Hum Mutat, 1994,4∶1～11.
2，潘速跃，张成，盛文利，等. 中国人抗肌营养不良蛋白基因缺失的分布特点. 中华神经科杂志， 1999；32(1)∶22～24.
3，Danieli GA, Mioni F,Muller CR, et al. Patterns of deletions of the dystrophin gene in different European populations. Hum Genet, 1993,91∶342～346.
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5，Monaco AP, Bertelson CJ, Liechti-Gallati S,et al. An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics, 1988,2∶90.
6，王伟文， 吴保仁， 颜真，等. 肌营养不良蛋白在假肥大肌营养不良症肌组织中的表达研究. 中华神经科杂志， 1998；31(1)∶34～36.
7，Maido M, et al. Musche histology in Becker muscular dystrophy. Muscle Nerve, 1991,14∶1067～1073.
8，谭庆荣，吴保仁， 王连刚，等. 两步多重聚合酶链反应对假肥大型肌营养不良的基因诊断. 中华神经精神杂志， 1994；27(4)∶223～225.
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