缺血再灌脑血管内皮损伤及GP Ⅲ a表达的研究
作者：刘育英 赵秀梅 刘凤英 郑世荣 田牛
单位：刘育英(100853 北京市,北京解放军总医院微循环室)；赵秀梅(100853 北京市,北京解放军总医院微循环室)；刘凤英(100853 北京市,北京解放军总医院微循环室)；郑世荣(100853 北京市,北京解放军总医院微循环室)；田牛(100853 北京市,北京解放军总医院微循环室)
关键词：脑微血管；血小板粘附；GPⅢa
中国微循环000306
【摘要】目的 研究沙土鼠缺血再灌注后微血管内皮损伤和GPⅢa的表达。方法 用夹闭沙土鼠双侧颈总动脉、30min再通造成灌注模型，由颈动脉注入FITC标记血小板。荧光显微镜下观察活体软脑膜微血管中血小板对内皮细胞的粘附，用CD61抗体经免疫组化方法观察缺血再灌注沙土鼠脑组织血管内血小板和内皮细胞上GPⅢa糖蛋白的表达。结果 再灌注后即刻，软脑膜细静脉内有白细胞和血小板粘附，呈星点状分布；再灌注(30～60)min，可观察到小动脉和细动脉内皮形成的空泡和血栓形成。免疫组化显示缺血再灌注(1～6)h血小板和内皮细胞膜上GPⅢa表达增强。结论 缺血再灌注可引起脑内皮细胞损伤和血小板粘附蛋白表达增强 。
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Studies of Endothelial Injury and GPⅢa Expression at Ischemia-reperfusion Gerbil Brain
Liu Yuying, Zhao Xiumei， Liu Fengying,et al.
(Lab of Microcirculation PLA General Hospital, Beijing 100853)
【Abstract】Objective To study endothelial injury and GPⅢa expression of microvessels at ischemia-reperfusion in gerbil brain. Methods Ischemia-reperfusion model was established by occlusion of common jugular artery and reperfusion in gerbil. The platelets were labeled by FITC injected by jugular artery. Adherence of platelets to endothelial cells in pial vessel was observed by fluorescent microscope. The expression of GPⅢa protein was identified by CD61 histochemistry. Results After onset of reperfusion, the adhesion of platelet to endothelia was observed at veins of pial vessel. they distributed as tiny spots, 30～60 minutes after reperfusion, we observed the vacuole formation in endothelial cells of artery and thrombosis could be seen at the injurious area. Immunohistochemistry examination shows the increased expression of GPⅢa at EC and platelet.Conclusions Ischemia-reperfusion can induce the increased expression of platelets and endothelial GPⅢa and cause the endothelial injury of cerebral microvessel.
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【Key words】Cerebral microvessel Platelet adhesion GPⅢa
缺血再灌后脑微血管内皮细胞损伤、细胞粘附已有研究[1,2],但缺血再灌后脑微血管血小板与内皮细胞之间粘附研究不多，特别在脑缺血再灌的情况下，血小板粘附分子的表达和在体状态下血小板的粘附行为与粘附分子的表达之间的关系是否一致尚不十分明确。因此我们在活体状态下观察脑缺血再灌内皮细胞与血小板之间的粘附变化，结合免疫组化方法研究细胞粘附与粘附分子表达，了解内皮损伤和血小板粘附的关系，为脑梗塞、血栓形成的防治提供理论依据。
材料与方法
1 动物实验 蒙古沙土鼠，体重65～75g，雌雄不拘，由本院实验动物中心提供。
2 缺血再灌模型的制备 蒙古沙土鼠用20%乌拉坦1.2ml/100g体重肌肉注射麻醉，后从颈正中切口分离双侧颈总动脉，用微型小动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉30min，造成单纯脑缺血模型。30min后松开双侧颈总动脉夹，恢复血流制成脑缺血再灌流模型。正常组不夹闭颈总动脉。于失血前及再灌流后30min、1h、6h分别进行脑软膜微循环的观察。
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3 观察及测量方法 沙土鼠麻醉后剪去头顶部毛，剪开皮肤，暴露颅骨，在颅骨的中下部偏左侧用牙科钻钻一直径(3～4)mm的颅窗，暴露脑软膜血管。脑软膜微循环采用OLYMPUS落射荧光显微镜观察，物镜20×和40×，通过CCD彩色摄像机、录像机以记录微循环变化。在重放的录像中观测血小板的流态、形态，以及血小板与白细胞和内皮之间粘附的关系、内皮损伤及血栓形成等变化。为能够看清脑血管内血小板，经颈动脉注入0.2ml 1%的FITC在体内标记血小板，观察血小板与内皮的粘附行为。
4 血小板粘附蛋白的表达 在缺血前及再灌后1h、6h,分别取血经离心后取血小板悬液，然后用荧光标记的CD61抗体(购自Pharmingen公司)标记血小板，在荧光显微镜下观察血小板的荧光强度[3,4]。
用荧光标记的CD61抗体标记冰冻切片上的脑组织微血管，在室温中孵化(2～4)h，再用缓冲液冲洗。然后在荧光显微镜下观察微血管内皮的荧光强度，以显示GPⅢa粘附蛋白的表达，在C1990光量子显微处理器测量荧光强度。
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结 果
在低倍物镜下进行活体脑软膜微循环观察，血流中不易看清血小板的流动。我们使用20～40倍物镜，结合荧光标记的办法，清楚地看到在血管内流动的血小板，呈扁圆形或长梭形，混杂在红细胞和白细胞之间。脑软膜微血管血流非常快，流速为3～5mm/s。白细胞及血小板很少在血管内粘着，毛细血管内也很少见到白细胞的粘附。用FITE标记血小板后，在荧光显微镜下血小板呈发亮的星点状，正常时很少粘附在血管壁上。缺血再灌或一些刺激因子的作用下，血小板贴壁沿血管壁流动，在显微镜下呈小亮点状。
1 缺血再灌后血小板粘附：缺血脑组织的流量减少，血流变慢，再灌时血流量虽有增加，但血流仍较缺血前慢。血管内出现少数白细胞和血小板贴壁流动。缺血再灌30min后脑软膜细静脉内清楚看到FITC标记的血小板成堆地在血管壁上粘附、聚集，也有散在的血小板粘附在血管壁上，在荧光显微镜下呈星点状。再灌1h，血小板粘附数量增多。再灌后3～6h，在小静脉内血小板粘附数量增多。荧光显微镜下血小板成堆地粘附在血管内皮上。
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2 脑血管内皮损伤及空泡的形成 缺血再灌后1h，血管内皮水肿，管壁增厚，血管内壁有圆丘形的隆起，体积比白细胞大，固定不动[5]。圆丘形从血管内皮突入管腔、血细胞绕过圆形的隆起发生明显弯曲线型改变。圆丘形直径(10～30)μm，在小动脉或细动脉内可见到。在一根血管内可同时出现有2～3个空泡，空泡的膜非常薄，内无任何结构，似乎充满液体。空泡的周围可见血小板的粘附。
3 CD61在血小板及脑微血管内的表达
大鼠在缺血前及缺血后30min，用CD61荧光标记的血小板荧光显示不明显。缺血再灌后1h、6h，血小板的荧光强度显示不同程度的增加。
大鼠脑组织内在缺血前及缺血后30min，脑组织冰冻切片上用CD61荧光标记的抗体标记，脑血管内皮细胞上未见荧光显示。缺血再灌后1h、6h，脑血管内皮细胞CD61荧光的强度明显增加。(图1，2)
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图1 缺血再灌后CD61标记脑微血管内皮和血小板荧光强度的变化
图2 缺血再灌后CD61标记的脑微血管内皮细胞
E-内皮细胞 V-血管腔
讨 论
脑软膜微循环观察对研究缺血再灌脑血管损伤、脑血栓形成等疾病的发生发展及药物防治作用具有重要意义。以往脑软膜微循环在4×、10×低倍物镜下观察，难以见到血小板在血管内的流动及其粘附行为。文献中未见活体观察脑微血管血小板粘附的报道。为观察脑缺血再灌后血小板与血管内皮的粘附变化，我们改进观察方法，用20～40倍物镜[2]，结合荧光标记的办法，清楚地看到血小板在血管内的流动及在内皮上的粘附。这种方法对研究脑微血管内血小板粘附及血栓形成具有重要意义。
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脑软膜微血管血流非常快，细动脉的流速为(3～5)mm/s。在这种血流速度下，白细胞及血小板很少在血管内粘着。缺血再灌后血流减慢，由于内皮细胞缺血缺氧，产生血管活性物质及粘附蛋白，细静脉内有白细胞和血小板粘附在血管内皮上，也见血小板与白细胞粘附在一起随血流滚动。缺血再灌流后1～6h血管内皮表面出现较多血小板粘附，光滑的血管内壁表面变得粗糙，血流中的血小板不断在粗造血管内皮上粘着。此时血小板及内皮上CD61的表达也明显增加，这表明CD61的表达与血小板的粘附行为是一致的，也表明CD61不但存在血小板膜上，内皮细胞也有CD61的表达[6,7]。GPⅡb/Ⅲa为血小板膜表面含量最丰富的糖蛋白，大约70%～80%的GPⅡb/Ⅲa分布在血小板表面，活化血小板的GPⅡb/Ⅲa能通过识别粘附蛋白中RGD序列至少可与纤维连接蛋白、纤维蛋白原、体外连接蛋白vWF因子等结合发挥其粘附蛋白受体的功能。因此缺血再灌后血小板及血管内皮都有表达，使血小板在快速的血流中能迅速地粘附在损伤的血管内皮上。我们在肠系膜微血管损伤实验中也见到快速流动的血小板迅速地粘附在损伤内皮上的现象，这与脑缺血再灌后血管内和血小板上的粘附分子的表达增加有关。
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缺血再灌造成血管内皮细胞水肿，管壁增厚。实验中发现内皮细胞损伤的另一现象是缺血再灌后(1～6)h脑微血管内皮的空泡形成，体积比白细胞大，在管壁内固定不动。内皮的空泡突入管腔，血流绕过圆形的空泡而发生弯曲的流线型改变。空泡直径10～30μm，空泡周围常有血小板粘附。我们认为空泡的形成是血管内皮严重损伤的一种表现，更刺激了白细胞、血小板的粘附。但空泡的形成在内皮损伤中的意义尚不清楚，也未见文献有类似报道，将有待进一步研究。
参考文献
1，Okada Y, Copeland BR, Hamann GF, et al. Integrin αvβ3 is expressed in selected microvessels after focal cerebral ischemia. American. J. Pathology.1996,149(1):37
2，刘育英，赵秀梅，姜澜，等多器官衰竭早期微血管内皮细胞与白细胞的相互作用.见田牛著，微循环的临床与基础.北京：原子能出版社.1996，121
, 百拇医药
3，Akopov S,Sercoombe R, Seylaz J. Cerebrovascular reactivity: role of endothelium/platelet/leukocyte interactions. Cerebrovasc Brian Metab Rev.1996,8(1):11
4，Weiss HJ, Turitto VT, Baumgartner HR. Further evidence the glycoprotein Iib-Ⅲa，mediates platelet spreading on subendothelium. Thrombosis and Haemostasis.1991，65(2):202
5，刘育英，赵秀梅，姜澜，等.多器官衰竭血小板粘附与内皮细胞的改变.微循环学杂志.1996，6(4)：13
6，黄桂秋.粘附蛋白与内皮细胞.细胞生物学杂志.1992，14(1)：16
7，Debinski W, Puri RK,Kreitman RJ, et al.A wide range of human cancers express interleukin-4 receptors that can be targeted with chimeric toxin composed of IL-4 and Pscudomonas exotoxin. J Biol Chem.1993,263(19):14065.
(收稿：1999-10-08 修回：2000-02-21), http://www.100md.com
单位：刘育英(100853 北京市,北京解放军总医院微循环室)；赵秀梅(100853 北京市,北京解放军总医院微循环室)；刘凤英(100853 北京市,北京解放军总医院微循环室)；郑世荣(100853 北京市,北京解放军总医院微循环室)；田牛(100853 北京市,北京解放军总医院微循环室)
关键词：脑微血管；血小板粘附；GPⅢa
中国微循环000306
【摘要】目的 研究沙土鼠缺血再灌注后微血管内皮损伤和GPⅢa的表达。方法 用夹闭沙土鼠双侧颈总动脉、30min再通造成灌注模型，由颈动脉注入FITC标记血小板。荧光显微镜下观察活体软脑膜微血管中血小板对内皮细胞的粘附，用CD61抗体经免疫组化方法观察缺血再灌注沙土鼠脑组织血管内血小板和内皮细胞上GPⅢa糖蛋白的表达。结果 再灌注后即刻，软脑膜细静脉内有白细胞和血小板粘附，呈星点状分布；再灌注(30～60)min，可观察到小动脉和细动脉内皮形成的空泡和血栓形成。免疫组化显示缺血再灌注(1～6)h血小板和内皮细胞膜上GPⅢa表达增强。结论 缺血再灌注可引起脑内皮细胞损伤和血小板粘附蛋白表达增强 。
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Studies of Endothelial Injury and GPⅢa Expression at Ischemia-reperfusion Gerbil Brain
Liu Yuying, Zhao Xiumei， Liu Fengying,et al.
(Lab of Microcirculation PLA General Hospital, Beijing 100853)
【Abstract】Objective To study endothelial injury and GPⅢa expression of microvessels at ischemia-reperfusion in gerbil brain. Methods Ischemia-reperfusion model was established by occlusion of common jugular artery and reperfusion in gerbil. The platelets were labeled by FITC injected by jugular artery. Adherence of platelets to endothelial cells in pial vessel was observed by fluorescent microscope. The expression of GPⅢa protein was identified by CD61 histochemistry. Results After onset of reperfusion, the adhesion of platelet to endothelia was observed at veins of pial vessel. they distributed as tiny spots, 30～60 minutes after reperfusion, we observed the vacuole formation in endothelial cells of artery and thrombosis could be seen at the injurious area. Immunohistochemistry examination shows the increased expression of GPⅢa at EC and platelet.Conclusions Ischemia-reperfusion can induce the increased expression of platelets and endothelial GPⅢa and cause the endothelial injury of cerebral microvessel.
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【Key words】Cerebral microvessel Platelet adhesion GPⅢa
缺血再灌后脑微血管内皮细胞损伤、细胞粘附已有研究[1,2],但缺血再灌后脑微血管血小板与内皮细胞之间粘附研究不多，特别在脑缺血再灌的情况下，血小板粘附分子的表达和在体状态下血小板的粘附行为与粘附分子的表达之间的关系是否一致尚不十分明确。因此我们在活体状态下观察脑缺血再灌内皮细胞与血小板之间的粘附变化，结合免疫组化方法研究细胞粘附与粘附分子表达，了解内皮损伤和血小板粘附的关系，为脑梗塞、血栓形成的防治提供理论依据。
材料与方法
1 动物实验 蒙古沙土鼠，体重65～75g，雌雄不拘，由本院实验动物中心提供。
2 缺血再灌模型的制备 蒙古沙土鼠用20%乌拉坦1.2ml/100g体重肌肉注射麻醉，后从颈正中切口分离双侧颈总动脉，用微型小动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉30min，造成单纯脑缺血模型。30min后松开双侧颈总动脉夹，恢复血流制成脑缺血再灌流模型。正常组不夹闭颈总动脉。于失血前及再灌流后30min、1h、6h分别进行脑软膜微循环的观察。
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3 观察及测量方法 沙土鼠麻醉后剪去头顶部毛，剪开皮肤，暴露颅骨，在颅骨的中下部偏左侧用牙科钻钻一直径(3～4)mm的颅窗，暴露脑软膜血管。脑软膜微循环采用OLYMPUS落射荧光显微镜观察，物镜20×和40×，通过CCD彩色摄像机、录像机以记录微循环变化。在重放的录像中观测血小板的流态、形态，以及血小板与白细胞和内皮之间粘附的关系、内皮损伤及血栓形成等变化。为能够看清脑血管内血小板，经颈动脉注入0.2ml 1%的FITC在体内标记血小板，观察血小板与内皮的粘附行为。
4 血小板粘附蛋白的表达 在缺血前及再灌后1h、6h,分别取血经离心后取血小板悬液，然后用荧光标记的CD61抗体(购自Pharmingen公司)标记血小板，在荧光显微镜下观察血小板的荧光强度[3,4]。
用荧光标记的CD61抗体标记冰冻切片上的脑组织微血管，在室温中孵化(2～4)h，再用缓冲液冲洗。然后在荧光显微镜下观察微血管内皮的荧光强度，以显示GPⅢa粘附蛋白的表达，在C1990光量子显微处理器测量荧光强度。
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结 果
在低倍物镜下进行活体脑软膜微循环观察，血流中不易看清血小板的流动。我们使用20～40倍物镜，结合荧光标记的办法，清楚地看到在血管内流动的血小板，呈扁圆形或长梭形，混杂在红细胞和白细胞之间。脑软膜微血管血流非常快，流速为3～5mm/s。白细胞及血小板很少在血管内粘着，毛细血管内也很少见到白细胞的粘附。用FITE标记血小板后，在荧光显微镜下血小板呈发亮的星点状，正常时很少粘附在血管壁上。缺血再灌或一些刺激因子的作用下，血小板贴壁沿血管壁流动，在显微镜下呈小亮点状。
1 缺血再灌后血小板粘附：缺血脑组织的流量减少，血流变慢，再灌时血流量虽有增加，但血流仍较缺血前慢。血管内出现少数白细胞和血小板贴壁流动。缺血再灌30min后脑软膜细静脉内清楚看到FITC标记的血小板成堆地在血管壁上粘附、聚集，也有散在的血小板粘附在血管壁上，在荧光显微镜下呈星点状。再灌1h，血小板粘附数量增多。再灌后3～6h，在小静脉内血小板粘附数量增多。荧光显微镜下血小板成堆地粘附在血管内皮上。
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2 脑血管内皮损伤及空泡的形成 缺血再灌后1h，血管内皮水肿，管壁增厚，血管内壁有圆丘形的隆起，体积比白细胞大，固定不动[5]。圆丘形从血管内皮突入管腔、血细胞绕过圆形的隆起发生明显弯曲线型改变。圆丘形直径(10～30)μm，在小动脉或细动脉内可见到。在一根血管内可同时出现有2～3个空泡，空泡的膜非常薄，内无任何结构，似乎充满液体。空泡的周围可见血小板的粘附。
3 CD61在血小板及脑微血管内的表达
大鼠在缺血前及缺血后30min，用CD61荧光标记的血小板荧光显示不明显。缺血再灌后1h、6h，血小板的荧光强度显示不同程度的增加。
大鼠脑组织内在缺血前及缺血后30min，脑组织冰冻切片上用CD61荧光标记的抗体标记，脑血管内皮细胞上未见荧光显示。缺血再灌后1h、6h，脑血管内皮细胞CD61荧光的强度明显增加。(图1，2)
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图1 缺血再灌后CD61标记脑微血管内皮和血小板荧光强度的变化
图2 缺血再灌后CD61标记的脑微血管内皮细胞
E-内皮细胞 V-血管腔
讨 论
脑软膜微循环观察对研究缺血再灌脑血管损伤、脑血栓形成等疾病的发生发展及药物防治作用具有重要意义。以往脑软膜微循环在4×、10×低倍物镜下观察，难以见到血小板在血管内的流动及其粘附行为。文献中未见活体观察脑微血管血小板粘附的报道。为观察脑缺血再灌后血小板与血管内皮的粘附变化，我们改进观察方法，用20～40倍物镜[2]，结合荧光标记的办法，清楚地看到血小板在血管内的流动及在内皮上的粘附。这种方法对研究脑微血管内血小板粘附及血栓形成具有重要意义。
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脑软膜微血管血流非常快，细动脉的流速为(3～5)mm/s。在这种血流速度下，白细胞及血小板很少在血管内粘着。缺血再灌后血流减慢，由于内皮细胞缺血缺氧，产生血管活性物质及粘附蛋白，细静脉内有白细胞和血小板粘附在血管内皮上，也见血小板与白细胞粘附在一起随血流滚动。缺血再灌流后1～6h血管内皮表面出现较多血小板粘附，光滑的血管内壁表面变得粗糙，血流中的血小板不断在粗造血管内皮上粘着。此时血小板及内皮上CD61的表达也明显增加，这表明CD61的表达与血小板的粘附行为是一致的，也表明CD61不但存在血小板膜上，内皮细胞也有CD61的表达[6,7]。GPⅡb/Ⅲa为血小板膜表面含量最丰富的糖蛋白，大约70%～80%的GPⅡb/Ⅲa分布在血小板表面，活化血小板的GPⅡb/Ⅲa能通过识别粘附蛋白中RGD序列至少可与纤维连接蛋白、纤维蛋白原、体外连接蛋白vWF因子等结合发挥其粘附蛋白受体的功能。因此缺血再灌后血小板及血管内皮都有表达，使血小板在快速的血流中能迅速地粘附在损伤的血管内皮上。我们在肠系膜微血管损伤实验中也见到快速流动的血小板迅速地粘附在损伤内皮上的现象，这与脑缺血再灌后血管内和血小板上的粘附分子的表达增加有关。
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缺血再灌造成血管内皮细胞水肿，管壁增厚。实验中发现内皮细胞损伤的另一现象是缺血再灌后(1～6)h脑微血管内皮的空泡形成，体积比白细胞大，在管壁内固定不动。内皮的空泡突入管腔，血流绕过圆形的空泡而发生弯曲的流线型改变。空泡直径10～30μm，空泡周围常有血小板粘附。我们认为空泡的形成是血管内皮严重损伤的一种表现，更刺激了白细胞、血小板的粘附。但空泡的形成在内皮损伤中的意义尚不清楚，也未见文献有类似报道，将有待进一步研究。
参考文献
1，Okada Y, Copeland BR, Hamann GF, et al. Integrin αvβ3 is expressed in selected microvessels after focal cerebral ischemia. American. J. Pathology.1996,149(1):37
2，刘育英，赵秀梅，姜澜，等多器官衰竭早期微血管内皮细胞与白细胞的相互作用.见田牛著，微循环的临床与基础.北京：原子能出版社.1996，121
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3，Akopov S,Sercoombe R, Seylaz J. Cerebrovascular reactivity: role of endothelium/platelet/leukocyte interactions. Cerebrovasc Brian Metab Rev.1996,8(1):11
4，Weiss HJ, Turitto VT, Baumgartner HR. Further evidence the glycoprotein Iib-Ⅲa，mediates platelet spreading on subendothelium. Thrombosis and Haemostasis.1991，65(2):202
5，刘育英，赵秀梅，姜澜，等.多器官衰竭血小板粘附与内皮细胞的改变.微循环学杂志.1996，6(4)：13
6，黄桂秋.粘附蛋白与内皮细胞.细胞生物学杂志.1992，14(1)：16
7，Debinski W, Puri RK,Kreitman RJ, et al.A wide range of human cancers express interleukin-4 receptors that can be targeted with chimeric toxin composed of IL-4 and Pscudomonas exotoxin. J Biol Chem.1993,263(19):14065.
(收稿：1999-10-08 修回：2000-02-21), http://www.100md.com