肝细胞癌组织和癌周组织中p53基因密码子249突变的比较研究
http://www.100md.com
169
教育网
登录
注册
注销
帮助
首页
动态
, 百拇医药 资料库
药学天地
机构
大众医学
专题
, 百拇医药
商务区
社区
轻松驿站
| 医学新闻 | 医学期刊 | 医学会议 | 医学进展 | 研究论文 | 经验介绍
您的位置：首页>>动态>>医学进展 癌症1999年第18卷第5期
, http://www.100md.com 肝细胞癌组织和癌周组织中p53基因密码子249突变的比较研究
彭晓谋 彭文伟 姚春斓 陈雪娟
摘 要 目的：本研究通过比较研究HCC癌组织和癌周组织中p53基因密码子249特征性突变来进一步阐明该基因在HCC发生机制中的意义。方法：收集9份癌组织中经单链构型多态性分析研究证实存在密码子249突变的HCC标本和11例无此突变的HCC标本，采用等位基因特异性PCR(AS-PCR)方法比较研究癌组织和癌周组织中密码子249突变情况。结果：20例HCC中，癌周组织中密码子249特征性突变检出率为70%。9例SSCP阳性者的癌周组织中的特征性突变检出率达100%。11例阴性患者的癌组织和癌周组织也能检出一定水平的突变。结论：p53基因密码子249突变在非癌肝组织中广泛存在。癌组织中密码了249特征性突变可能发生在肿瘤形成之前。
关键词：肝肿瘤 p53基因 突变
, 百拇医药
45%～60%南部非洲和中国启东肝细胞癌(HCC)的p53基因携带一个特征性突变，即密码子249的第三个碱基发生G→T突变〔1，2〕。这使得p53基因在HCC发生机制中的意义显得特别重要〔3～5〕。然而，一些学者报道这种突变仅见于晚期或分化较差的HCC〔6，7〕，对其是否参与HCC发生机制中的启动过程持有争议。争论的焦点是特征性突变发生的时间。过去，基因突变一般采用单链构象多态性分析(SSCP)或限制酶片长度多态性分析等进行检测。这些方法只能在已形成的肿瘤中检测出p53基因的突变。最近有人应用敏感的等位基因特异性PCR(AS-PCR)技术，可从非癌肝组织中检出密码子249突变〔8〕，提示p53基因的突变可能出现在肿瘤形成之前。本研究收集传统方法证实突变阳性的HCC9例和突变阴性HCC11例，并分成癌组织和癌周组织进行比较研究，进一步探讨癌组织中p53基因特征性突变发生的时间。
1 材料
, 百拇医药
20例HCC患者手术切除标本的癌组织和癌周组织收集于中山医科大学附属肿瘤医院。全部标本分成2份分别进行RNA和DNA提取。RNA提取采用一步酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法进行。基因组DNA采用蛋白酶K消化-酚-氯仿抽提法提取。细胞总RNA和基因组DNA于-70℃保存。20份HCC标本中9例经SSCP分析证实癌组织中存在密码子249特征性突变〔3〕。
2 方法
2.1 AS-PCR在DNA水平检测密码子249特征性突变
以基因组DNA为模板，先采用引物5’-GGCGACAGAGCGAGATTCCA-3’(S2，引物在p53基因上的相对位置见图1)和5’-GATTCTCTTCCTCTGTGCGC-3’(A2)进行初步扩增，再采用另一对引物5’-TGGGCGGCATGAACCGGAGT-3’(S3，等位基因特异引物，其3’端为密码子249，最后一碱基G设计为T)或5’-TGGGCGGCATGAACCGGAGG-3’(S4)和5’-GGGTCAGCGGCAAGCAGAGG-3’(A1)进行第二次扩增。PCR的条件同报道〔3〕。阳性者PCR产物为121bp。
, http://www.100md.com
图1 引物在p53基因上的相对位置和扩增产物覆盖区域
2.2 AS-PCR在RNA水平检测密码子249特征性突变
以细胞总RNA为模板，先用引物5’-GTGCAGCTGTGGGTTGATTC-3’(S1)和5’-GTTGGGCAGTGCTCGCTTAG-3’(A3)在AMV逆转录酶的作用，于42℃进行逆转录，并进行第一次扩增，然后再采用等位基因特异引物(S3)或S4和5’-GATTCTCTTCCTCTGTGCGC-3’(A2)引物进行第二次扩增。阳性者产物为138bp。
3 结果
3.1 DNA水平检测密码子249特征性突变
AS-PCR检测密码子249特征性突变的产物分析见图2。所有标本均被引物S3或S4，或两者同时扩增出条带。且碱基数与设计相符。20例HCC患者中密码子249特征性突变检出情况见表1。与SSCP分析比较见表2。
, 百拇医药
图2 AS-PCR在DNA水平检测密码子249突变时的电泳分析
1为GIBcoBRL公司的100bpIadder;2,4,5为阳性；3为阴性
表1 癌组织和非癌组织中密码子249突变情况
组 别
例数
等位基因特异性PCR
DNA(%)
RNA(%)
癌周组织
20
70
, 百拇医药
70
癌组织
20
65
70
表2 SSCP阳性和阴性患者p53基因密码子249突变的比较
组 别
例 数
组织类型
DNA(%)
RNA(%)
SSCP阳性
, http://www.100md.com 9
癌组织
100**
88.9
癌周组织
100*
88.9
SSCP阴性
11
癌组织
36.4
54.5
癌周组织
, 百拇医药
45.5
54.5
*与SSCP阴性相应组比较，χ2检验，P<0.05,**P< 0.01
3.2 RNA水平检测密码子249特征性突变
采用AS-RT-PCR能成功地扩增所有组织标本中的目的片段。且碱基数与设计相符，见图3。20例HCC患者中密码子249特征性突变检出情况见表1。与SSCP分析比较见表2。
4 讨论
p53基因特征性突变是发生在肿瘤形成前，还是形成后是确定p53基因在HCC发病机制中意义的关键。采用AS-PCR技术初步检测发现，在HCC高发区，6份非癌肝组织中5例能检出密码子249特征性，而9份来自低发区的标本则未能检出突变〔8〕。本研究显示，20例HCC癌周组织中密码子249的突变率达70%，提示在非癌肝组织中密码子249特征性突变是较普遍的现象，HCC癌组织中的这种突变可能发生在肿瘤形成之前。进一步采用比较的方法研究癌组织和癌周组织中密码子249的突变情况发现，9例SSCP证实密码子249突变阳性HCC的癌周组织中100%检出突变，表明癌组织中密码子249突变不是独立事件。进一步支持密码子249特征性突变是发生在肿瘤形成之前的观点。
, http://www.100md.com
图3 AS-PCR在RNA水平检测密码子249
突变时的电泳分析
4为GIBcoBRL公司的100bpIadder;1，2,5为
阳性；3为阴性
RNA水平研究结果与DNA水平高度一致，表明非癌肝组织中突变的p53基因是活跃表达的，提示具有一定的功能。然而，11例SSCP阴性HCC的癌组织和癌周组织中，采用AS-PCR均能检出一定水平的突变，提示在中国南部HCC肿瘤组织和肝组织中p53基因密码了249突变广泛存在。这提出了一个新问题，为什么仅有部分细胞最终发展为肿瘤?弄清这个问题对于全面阐明p53基因在HCC中的意义以及HCC的发病机理至关重要。
基金项目：美国中华医学基金会(CMB)部分资助(Grant No 93-582)
, 百拇医药
作者单位：中山医科大学附属第三医院传染科(广州，510630)
〔参考文献〕
〔1〕 Hsu IC,Metcalf RA,Sun T,et al. Mutational hotspot in the p53 gene in human hepatocellular carcinomas〔J〕.Nature,1991,350：427～428.
〔2〕 Bressac B,Kew M,Wands J,et al.Selective G to T mutations of p53 gene in hepatocellular carcinoma from southern Africa〔J〕. Nature,1991,350：429～ 431.
〔3〕 彭晓谋，彭文伟，周元平.肝细胞癌患者中p53基因的突变研究〔J〕.中山医科大学学报，1997，18：245.
, 百拇医药
〔4〕 Slagle BL. p53 mutations and hepatitis B virus：cofactors in hepatocellular carcinoma〔J〕. Hepatology,1995,21：597～599.
〔5〕 Yap EP,Cooper K,Maharaj B,et al.p53 codon 249ser hot-spot mutation in HBV-negative hepatocellular carcinoma〔J〕.Lancet,1993,341：251.
〔6〕 Murakami Y,Hayashi K,Hirohashi S,et al.Aberrations of the tumor suppressor p53 and retinoblastoma genes in human hepatocellular carcinomas〔J〕.Cancer Res,1991,51：5520～5525.
, 百拇医药
〔7〕 Hayashi H,Sugio K,Matsumata T,et al.The clinical significance of p53 gene mutation in hepatocellular carcinomas from Japan〔J〕. Hepatology,1995,22：1702～1707.
〔8〕 Kirby GM,Batist G,Fotouhi-Ardakani N,et al. Allele-specific PCR analysis of p53 codon 249 AGT transversion in liver tissues from patients with viral hepatitis〔J〕. Int J Cancer,1996,68：21～25.
推荐给朋友
进入论坛讨论
, 百拇医药
相关研究论文
膀胱癌组织中Ki-67/MIB-1、PCNA及nm23表达的意义地高辛标记PCR-SSOP法进行HLA-A.02等位基因检测培养的不同分化程度的人大肠癌细胞内质网结构特点大肠癌细胞凋亡模型的建立及凋亡细胞内质网膜系统的变化喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系常规及高分辨染色体分析植物药生物碱94-95-10L对大鼠CSD模型脑内c-fos基因表达的影响阳离子脂质体对重组腺病毒转染效率的影响TNF-α抑制胶质瘤细胞增殖和诱导凋亡的研究ATP敏感钾通道亚单位在大鼠组织中的表达槲皮素及其水溶性衍生物对HL-60细胞生长影响的比较
医学进展
题 目
关键字
相关医学新闻
治癌新模式：用生物活性因子杀伤癌细胞人类基因图谱证明：人类无种族之分Ⅰ型糖尿病基因被发现中国人类基因研究遭遇尴尬世界器官移植大会与会者认为——细胞克隆人类器官可行
, 百拇医药
相关经验介绍
离子通道在卵母细胞中的表达及电生理实验方法用半套式PCR检测蜱和啮齿动物中查菲埃立克体P物质对脾细胞增生、分泌及T细胞表型的影响大黄素对人肾成纤维细胞增殖的影响E1A 基因对头颈肿瘤淋巴结转移癌细胞化疗敏感性的影响
相关医学录象带
分子生物学多媒体教程病毒的形态与结构
相关医学光盘
细胞生物学生物化学多媒体教程遗传学探索细胞生物学、代谢及遗传人类生命科学的过去和未来
相关医学会议
2000年第15届亚太地区生物化学家与分子生物学家联合会研讨会第十届基因、基因族、同工酶国际研讨会二十一世纪农业生物科学展望研讨会第三届全省肿瘤学术会第二届“应激反应的分子生物学”国际会
关于我们 | 联系方式 | 导航地图 | 广告服务 | 您的建议 | 帮助中心
本站信息仅供参考_不能作为诊断及医疗的依据
本站如有转载或引用文章涉及版权问题_请速与我们联系
版权所有：第四军医大学 & 长城网络科技, 百拇医药
登录
注册
注销
帮助
首页
动态
, 百拇医药 资料库
药学天地
机构
大众医学
专题
, 百拇医药
商务区
社区
轻松驿站
| 医学新闻 | 医学期刊 | 医学会议 | 医学进展 | 研究论文 | 经验介绍
您的位置：首页>>动态>>医学进展 癌症1999年第18卷第5期
, http://www.100md.com 肝细胞癌组织和癌周组织中p53基因密码子249突变的比较研究
彭晓谋 彭文伟 姚春斓 陈雪娟
摘 要 目的：本研究通过比较研究HCC癌组织和癌周组织中p53基因密码子249特征性突变来进一步阐明该基因在HCC发生机制中的意义。方法：收集9份癌组织中经单链构型多态性分析研究证实存在密码子249突变的HCC标本和11例无此突变的HCC标本，采用等位基因特异性PCR(AS-PCR)方法比较研究癌组织和癌周组织中密码子249突变情况。结果：20例HCC中，癌周组织中密码子249特征性突变检出率为70%。9例SSCP阳性者的癌周组织中的特征性突变检出率达100%。11例阴性患者的癌组织和癌周组织也能检出一定水平的突变。结论：p53基因密码子249突变在非癌肝组织中广泛存在。癌组织中密码了249特征性突变可能发生在肿瘤形成之前。
关键词：肝肿瘤 p53基因 突变
, 百拇医药
45%～60%南部非洲和中国启东肝细胞癌(HCC)的p53基因携带一个特征性突变，即密码子249的第三个碱基发生G→T突变〔1，2〕。这使得p53基因在HCC发生机制中的意义显得特别重要〔3～5〕。然而，一些学者报道这种突变仅见于晚期或分化较差的HCC〔6，7〕，对其是否参与HCC发生机制中的启动过程持有争议。争论的焦点是特征性突变发生的时间。过去，基因突变一般采用单链构象多态性分析(SSCP)或限制酶片长度多态性分析等进行检测。这些方法只能在已形成的肿瘤中检测出p53基因的突变。最近有人应用敏感的等位基因特异性PCR(AS-PCR)技术，可从非癌肝组织中检出密码子249突变〔8〕，提示p53基因的突变可能出现在肿瘤形成之前。本研究收集传统方法证实突变阳性的HCC9例和突变阴性HCC11例，并分成癌组织和癌周组织进行比较研究，进一步探讨癌组织中p53基因特征性突变发生的时间。
1 材料
, 百拇医药
20例HCC患者手术切除标本的癌组织和癌周组织收集于中山医科大学附属肿瘤医院。全部标本分成2份分别进行RNA和DNA提取。RNA提取采用一步酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法进行。基因组DNA采用蛋白酶K消化-酚-氯仿抽提法提取。细胞总RNA和基因组DNA于-70℃保存。20份HCC标本中9例经SSCP分析证实癌组织中存在密码子249特征性突变〔3〕。
2 方法
2.1 AS-PCR在DNA水平检测密码子249特征性突变
以基因组DNA为模板，先采用引物5’-GGCGACAGAGCGAGATTCCA-3’(S2，引物在p53基因上的相对位置见图1)和5’-GATTCTCTTCCTCTGTGCGC-3’(A2)进行初步扩增，再采用另一对引物5’-TGGGCGGCATGAACCGGAGT-3’(S3，等位基因特异引物，其3’端为密码子249，最后一碱基G设计为T)或5’-TGGGCGGCATGAACCGGAGG-3’(S4)和5’-GGGTCAGCGGCAAGCAGAGG-3’(A1)进行第二次扩增。PCR的条件同报道〔3〕。阳性者PCR产物为121bp。
, http://www.100md.com
图1 引物在p53基因上的相对位置和扩增产物覆盖区域
2.2 AS-PCR在RNA水平检测密码子249特征性突变
以细胞总RNA为模板，先用引物5’-GTGCAGCTGTGGGTTGATTC-3’(S1)和5’-GTTGGGCAGTGCTCGCTTAG-3’(A3)在AMV逆转录酶的作用，于42℃进行逆转录，并进行第一次扩增，然后再采用等位基因特异引物(S3)或S4和5’-GATTCTCTTCCTCTGTGCGC-3’(A2)引物进行第二次扩增。阳性者产物为138bp。
3 结果
3.1 DNA水平检测密码子249特征性突变
AS-PCR检测密码子249特征性突变的产物分析见图2。所有标本均被引物S3或S4，或两者同时扩增出条带。且碱基数与设计相符。20例HCC患者中密码子249特征性突变检出情况见表1。与SSCP分析比较见表2。
, 百拇医药
图2 AS-PCR在DNA水平检测密码子249突变时的电泳分析
1为GIBcoBRL公司的100bpIadder;2,4,5为阳性；3为阴性
表1 癌组织和非癌组织中密码子249突变情况
组 别
例数
等位基因特异性PCR
DNA(%)
RNA(%)
癌周组织
20
70
, 百拇医药
70
癌组织
20
65
70
表2 SSCP阳性和阴性患者p53基因密码子249突变的比较
组 别
例 数
组织类型
DNA(%)
RNA(%)
SSCP阳性
, http://www.100md.com 9
癌组织
100**
88.9
癌周组织
100*
88.9
SSCP阴性
11
癌组织
36.4
54.5
癌周组织
, 百拇医药
45.5
54.5
*与SSCP阴性相应组比较，χ2检验，P<0.05,**P< 0.01
3.2 RNA水平检测密码子249特征性突变
采用AS-RT-PCR能成功地扩增所有组织标本中的目的片段。且碱基数与设计相符，见图3。20例HCC患者中密码子249特征性突变检出情况见表1。与SSCP分析比较见表2。
4 讨论
p53基因特征性突变是发生在肿瘤形成前，还是形成后是确定p53基因在HCC发病机制中意义的关键。采用AS-PCR技术初步检测发现，在HCC高发区，6份非癌肝组织中5例能检出密码子249特征性，而9份来自低发区的标本则未能检出突变〔8〕。本研究显示，20例HCC癌周组织中密码子249的突变率达70%，提示在非癌肝组织中密码子249特征性突变是较普遍的现象，HCC癌组织中的这种突变可能发生在肿瘤形成之前。进一步采用比较的方法研究癌组织和癌周组织中密码子249的突变情况发现，9例SSCP证实密码子249突变阳性HCC的癌周组织中100%检出突变，表明癌组织中密码子249突变不是独立事件。进一步支持密码子249特征性突变是发生在肿瘤形成之前的观点。
, http://www.100md.com
图3 AS-PCR在RNA水平检测密码子249
突变时的电泳分析
4为GIBcoBRL公司的100bpIadder;1，2,5为
阳性；3为阴性
RNA水平研究结果与DNA水平高度一致，表明非癌肝组织中突变的p53基因是活跃表达的，提示具有一定的功能。然而，11例SSCP阴性HCC的癌组织和癌周组织中，采用AS-PCR均能检出一定水平的突变，提示在中国南部HCC肿瘤组织和肝组织中p53基因密码了249突变广泛存在。这提出了一个新问题，为什么仅有部分细胞最终发展为肿瘤?弄清这个问题对于全面阐明p53基因在HCC中的意义以及HCC的发病机理至关重要。
基金项目：美国中华医学基金会(CMB)部分资助(Grant No 93-582)
, 百拇医药
作者单位：中山医科大学附属第三医院传染科(广州，510630)
〔参考文献〕
〔1〕 Hsu IC,Metcalf RA,Sun T,et al. Mutational hotspot in the p53 gene in human hepatocellular carcinomas〔J〕.Nature,1991,350：427～428.
〔2〕 Bressac B,Kew M,Wands J,et al.Selective G to T mutations of p53 gene in hepatocellular carcinoma from southern Africa〔J〕. Nature,1991,350：429～ 431.
〔3〕 彭晓谋，彭文伟，周元平.肝细胞癌患者中p53基因的突变研究〔J〕.中山医科大学学报，1997，18：245.
, 百拇医药
〔4〕 Slagle BL. p53 mutations and hepatitis B virus：cofactors in hepatocellular carcinoma〔J〕. Hepatology,1995,21：597～599.
〔5〕 Yap EP,Cooper K,Maharaj B,et al.p53 codon 249ser hot-spot mutation in HBV-negative hepatocellular carcinoma〔J〕.Lancet,1993,341：251.
〔6〕 Murakami Y,Hayashi K,Hirohashi S,et al.Aberrations of the tumor suppressor p53 and retinoblastoma genes in human hepatocellular carcinomas〔J〕.Cancer Res,1991,51：5520～5525.
, 百拇医药
〔7〕 Hayashi H,Sugio K,Matsumata T,et al.The clinical significance of p53 gene mutation in hepatocellular carcinomas from Japan〔J〕. Hepatology,1995,22：1702～1707.
〔8〕 Kirby GM,Batist G,Fotouhi-Ardakani N,et al. Allele-specific PCR analysis of p53 codon 249 AGT transversion in liver tissues from patients with viral hepatitis〔J〕. Int J Cancer,1996,68：21～25.
推荐给朋友
进入论坛讨论
, 百拇医药
相关研究论文
膀胱癌组织中Ki-67/MIB-1、PCNA及nm23表达的意义地高辛标记PCR-SSOP法进行HLA-A.02等位基因检测培养的不同分化程度的人大肠癌细胞内质网结构特点大肠癌细胞凋亡模型的建立及凋亡细胞内质网膜系统的变化喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系常规及高分辨染色体分析植物药生物碱94-95-10L对大鼠CSD模型脑内c-fos基因表达的影响阳离子脂质体对重组腺病毒转染效率的影响TNF-α抑制胶质瘤细胞增殖和诱导凋亡的研究ATP敏感钾通道亚单位在大鼠组织中的表达槲皮素及其水溶性衍生物对HL-60细胞生长影响的比较
医学进展
题 目
关键字
相关医学新闻
治癌新模式：用生物活性因子杀伤癌细胞人类基因图谱证明：人类无种族之分Ⅰ型糖尿病基因被发现中国人类基因研究遭遇尴尬世界器官移植大会与会者认为——细胞克隆人类器官可行
, 百拇医药
相关经验介绍
离子通道在卵母细胞中的表达及电生理实验方法用半套式PCR检测蜱和啮齿动物中查菲埃立克体P物质对脾细胞增生、分泌及T细胞表型的影响大黄素对人肾成纤维细胞增殖的影响E1A 基因对头颈肿瘤淋巴结转移癌细胞化疗敏感性的影响
相关医学录象带
分子生物学多媒体教程病毒的形态与结构
相关医学光盘
细胞生物学生物化学多媒体教程遗传学探索细胞生物学、代谢及遗传人类生命科学的过去和未来
相关医学会议
2000年第15届亚太地区生物化学家与分子生物学家联合会研讨会第十届基因、基因族、同工酶国际研讨会二十一世纪农业生物科学展望研讨会第三届全省肿瘤学术会第二届“应激反应的分子生物学”国际会
关于我们 | 联系方式 | 导航地图 | 广告服务 | 您的建议 | 帮助中心
本站信息仅供参考_不能作为诊断及医疗的依据
本站如有转载或引用文章涉及版权问题_请速与我们联系
版权所有：第四军医大学 & 长城网络科技, 百拇医药