冠心病患者载脂蛋白E基因多态性特点分析
作者：杨志健 朱铁兵 杨兵 贾永平 马根山 孔祥清 曹克将 张馥敏 马文珠
单位：杨志健， 朱铁兵， 杨兵， 贾永平(210029 南京医科大学第一附属医院心内科)； 马根山(210029 南京医科大学第一附属医院心内科)； 孔祥清(210029 南京医科大学第一附属医院心内科)； 曹克将(210029 南京医科大学第一附属医院心内科)； 张馥敏(210029 南京医科大学第一附属医院心内科)； 马文珠(210029 南京医科大学第一附属医院心内科)
关键词：载脂蛋白E多态性；冠心病
江苏医药000408 要：目的 探讨载脂蛋白E(apoE)基因型和冠心病(CHD)之间的关系。方法 采用聚合酶链反应(PCR)法分析142例CHD患者和131例健康对照者的apoE基因型。结果 发现无论是在对照组还是CHD组，E3/3型发生频率最高，占整个样本的67.8%，含apoE3的杂合子居中，E4/4的发生频率较低，E2/2和4/2很少。病例组E3/4和E4/4的发生频率较对照组明显要高，统计学检验差别具显著性(P<0.001)。且在对心肌梗死(心梗)亚组的基因型分析中，进一步发现E4携带者心梗的年龄较为提前。结论 E4携带是CHD的危险因子，值得进一步研究。
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载脂蛋白E(apoE)在脂质代谢特别是导致动脉粥样硬化(AS)的脂蛋白的代谢中起着重要作用。apoE结构基因位点存在多态性，3种常见等位基因为：E2、E3、E4，分别编码3种主要apoE的异构体E2、E3、和E4，3种等位基因表达产生E2/2、E3/3、E4/4、E2/3、E2/4和E3/46种表型。研究表明在世界人群中，E4等位基因频率分布可能与世界各地CHD发病率不同有密切的关系。我们应用PCR技术，检测CHD患者和正常对照两组不同人群的apoE基因的多态性，观察它们在两组人群中的不同分布，探讨apoE基因型和CHD之间的关系。
对象和方法
一、对象
1992～1997年我院住院存活的本市心梗病人(符合1981年制订的全国诊断标准)和经冠脉造影证实的CHD病人142例，年龄42～72岁，平均62.1±18.4岁。并按1∶1与本市某企业及同期来本院体检的性别相同，年龄相差不超过2岁，无慢性肝、肾、肿瘤及CHD等相关疾病的健康人131例作对照。
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二、方法
1.全部受检者均禁食12小时后采外周血10 ml，用EDTA抗凝，2 000转/分离心10分钟后，取上层血浆送检血脂，剩余血细胞-20℃保存。
2.apoE基因型的鉴定(1)外周血DNA提取酚-氯法；(2)扩增引物1∶5′—TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA—3′，引物2∶5′—ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC—3′，中科院上海细胞生物研究所合成。4种脱氧核苷酸dNTPS及TaqDNA多聚酶购自上海复华公司，内切酶HhaⅠ购自华美生物工程公司。PCR：总体积50μl，含基因组DNA 1μg引物1、引物2各50 pmol，dNTPS 0.2 mmol/L(含dATP、dTTP、dCTP、dGTP)，10×buffer 5μlTaqDNA多聚酶2单位，按下列条件扩增：95℃变性5分钟，95℃×1分钟，55℃×1分钟，72℃×1分30秒，循环30个，72℃×10分钟延伸，PCR产物用1%琼脂糖电泳分离，若378bp处荧光条带，则PCR特异产物。
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3.酶切及聚丙烯酰胺 电泳，取PCR产物15 μl加15单位的HhaⅠ在37℃消化大于3小时，凝胶8%，以PUC18/HhaⅡ酶解片断为DNA片断为对照，于50 mA恒流下电泳2～2.5小时至溴酚蓝接近电泳玻璃板底部约2 cm处(玻璃板长30 cm，宽20 cm，胶厚1.5 mm)。停止电泳后，凝胶浸泡于0.5 μg/L的溴乙锭30分钟，紫外线透射灯下观察结果。在紫外线灯下，各条带清晰易辨，纯合子E2/2有91、83pb片断，E4/4出现72、48pb片断，E3/3出现91、48pb片断，E3/2出现91、83、48pb片断，E4/3出现91、72、48pb片断，E4/2出现91、83、72、48pb片断，根据长度不同而加以鉴别。
三、统计
各类数据均采用SPSS软件统计处理。
结 果
apoE基因型分析结果E3/3型发生频率最高，占整个样本的67.8%，含apoE3的杂合子居中，E4/4的发生频率较低，E2/2和E4/2很少。110例心梗患者的情况也是如此，见表1，表2。
, 百拇医药
病例组E3/4和E4/4的发生频率较对照组明显要高，统计学检验差别具显著性(P<0.001)。E4携带者的心梗发病年龄较为提前，纯合子更为明显(P<0.01)。
表1 APOE基因型分布
基因型
合计
2/2
3/2
3/3
3/4
4/4
4/2
对照组
, 百拇医药
1
15
98
13
3
1
131
病例组
1
12
87
30
11
1
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142
合计
2
27
185
43
14
2
273
百分比
0.7
9.9
67.8
, http://www.100md.com 15.8
5.1
0.7
100.0
表2 110例心肌梗死患者基因型和发病年龄 基因型
例数
发生心梗年龄(岁)
E3/3
71
67.4±5.6
E3/2
10
69.3±2.5
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E4/3
21
61.2±3.4
E4/4
8
52.6±2.6
讨 论
动脉粥样硬化在早期就已经发生，中老年发生临床CHD而达到高峰。基因变异通过影响脂蛋白水平也影响粥样硬化，如低密度脂蛋白(LDL)受体缺乏[1]，最常见的变异是apoE，系人类19号染色体一个基因位点的三个等位基因所编码，对应三种异构体E2、E3、E4。E3是母体形式，E2、E4是点突变的结果[2，3]。大多数人群研究结果表明，与母体E3相比，E4升高LDL胆固醇(LDL-C)、apo水平，而E2恰好相反，具有降低LDL-C和apoB(apoB)水平的作用。对于甘油三酯(TG)的效应则是E2、E4均具升高作用。目前尚未发现其它等位基因对人群血脂有如此影响[4]。三种等位基因携带者血脂水平有如此差异，导致机体在同一环境中易患高脂血症和冠状动脉病变程度不同。
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我们的结果表明无论是病例组还是对照组，apoE3/3都是占主导的基因型，但E4携带者在病例组较对照组明显增加，差别具显著性。复习文献，其结果大都倾向于E4携带者具有CHD的危险性，一份对Framingham人群的后代进行横断面研究，发现与apoE3/3相比，apoE4携带者LDL-C升高，apoE2和apoE4携带者TG升高[5]。不论男性和女性，apoE携带者患CHD的危险性均上升。在校正高血压、吸烟、肥胖、糖尿病后，这种关系依然存在。因而作者认为：apoE4是脂质代谢紊乱和CHD的重要遗传标记，与已知的能致脂蛋白代谢紊乱基因相比，apoE4携带者患CHD的危险度更大。在Framingham人群的后代，有15%CHD患者是apoE4携带者[6]。
Van Bockxmeer等[6]报告E4是早发CHD的独立危险因子，纯合子E4/4更是导致CHD发病年龄提前的危险因素。
我们的结果也表明在病例组，apoE等位基因的频率较对照组高得多，而且在心梗病人的亚组分析中初步发现E4携带者心梗的年龄较为提前，这一点很值得进一步研究。
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参考文献：
1，Hixson JE，Vernier DT，Zannis VL，et al.Apolipoprotein polymorphisms affect atherosclerosis in young males.Arterioscler Thromb，1991，11：1237-1244.
2，Zannis VL，Breslow JL，Utermann，et al. Proposed nomenclature of apoE isoprotein apoE genotypes and phenotypes.J Lipid Res，1982，23：911-914.
3，Weisgraber KH，Innerarity TL，Mahley RW，et al. Human E
apolipoprotein heterogeneity.Cysteinearginine interchanges in the amino acid sequence of the apoE isoforms.J Biol Chem，1981，256：9077-9083.
, 百拇医药
4，Klausen IC，Gerdes LU，Sihm I，et al. Apolipoprotein E polymorphism in a Danish population compared to findings in 45 other study populations around the world.Genet epidemiol，1992，9：155-167.
5，Peter WF，Paik YK，Dawson PA，et al.Apolipoprotein E alleles，dyslipidemia and coronary heart disease.JAMA，1994，272：1666-1671.
6，Van Bockxmeer FM，Ehnholm C，Lukka M，et al.Apolipoproteine epsilon 4 homozygousity in young men with coronary heart disease.Lanct，1992，340：879-880.
收稿日期：1999-04-06
修回日期：1999-09-03, 百拇医药
单位：杨志健， 朱铁兵， 杨兵， 贾永平(210029 南京医科大学第一附属医院心内科)； 马根山(210029 南京医科大学第一附属医院心内科)； 孔祥清(210029 南京医科大学第一附属医院心内科)； 曹克将(210029 南京医科大学第一附属医院心内科)； 张馥敏(210029 南京医科大学第一附属医院心内科)； 马文珠(210029 南京医科大学第一附属医院心内科)
关键词：载脂蛋白E多态性；冠心病
江苏医药000408 要：目的 探讨载脂蛋白E(apoE)基因型和冠心病(CHD)之间的关系。方法 采用聚合酶链反应(PCR)法分析142例CHD患者和131例健康对照者的apoE基因型。结果 发现无论是在对照组还是CHD组，E3/3型发生频率最高，占整个样本的67.8%，含apoE3的杂合子居中，E4/4的发生频率较低，E2/2和4/2很少。病例组E3/4和E4/4的发生频率较对照组明显要高，统计学检验差别具显著性(P<0.001)。且在对心肌梗死(心梗)亚组的基因型分析中，进一步发现E4携带者心梗的年龄较为提前。结论 E4携带是CHD的危险因子，值得进一步研究。
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载脂蛋白E(apoE)在脂质代谢特别是导致动脉粥样硬化(AS)的脂蛋白的代谢中起着重要作用。apoE结构基因位点存在多态性，3种常见等位基因为：E2、E3、E4，分别编码3种主要apoE的异构体E2、E3、和E4，3种等位基因表达产生E2/2、E3/3、E4/4、E2/3、E2/4和E3/46种表型。研究表明在世界人群中，E4等位基因频率分布可能与世界各地CHD发病率不同有密切的关系。我们应用PCR技术，检测CHD患者和正常对照两组不同人群的apoE基因的多态性，观察它们在两组人群中的不同分布，探讨apoE基因型和CHD之间的关系。
对象和方法
一、对象
1992～1997年我院住院存活的本市心梗病人(符合1981年制订的全国诊断标准)和经冠脉造影证实的CHD病人142例，年龄42～72岁，平均62.1±18.4岁。并按1∶1与本市某企业及同期来本院体检的性别相同，年龄相差不超过2岁，无慢性肝、肾、肿瘤及CHD等相关疾病的健康人131例作对照。
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二、方法
1.全部受检者均禁食12小时后采外周血10 ml，用EDTA抗凝，2 000转/分离心10分钟后，取上层血浆送检血脂，剩余血细胞-20℃保存。
2.apoE基因型的鉴定(1)外周血DNA提取酚-氯法；(2)扩增引物1∶5′—TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA—3′，引物2∶5′—ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC—3′，中科院上海细胞生物研究所合成。4种脱氧核苷酸dNTPS及TaqDNA多聚酶购自上海复华公司，内切酶HhaⅠ购自华美生物工程公司。PCR：总体积50μl，含基因组DNA 1μg引物1、引物2各50 pmol，dNTPS 0.2 mmol/L(含dATP、dTTP、dCTP、dGTP)，10×buffer 5μlTaqDNA多聚酶2单位，按下列条件扩增：95℃变性5分钟，95℃×1分钟，55℃×1分钟，72℃×1分30秒，循环30个，72℃×10分钟延伸，PCR产物用1%琼脂糖电泳分离，若378bp处荧光条带，则PCR特异产物。
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3.酶切及聚丙烯酰胺 电泳，取PCR产物15 μl加15单位的HhaⅠ在37℃消化大于3小时，凝胶8%，以PUC18/HhaⅡ酶解片断为DNA片断为对照，于50 mA恒流下电泳2～2.5小时至溴酚蓝接近电泳玻璃板底部约2 cm处(玻璃板长30 cm，宽20 cm，胶厚1.5 mm)。停止电泳后，凝胶浸泡于0.5 μg/L的溴乙锭30分钟，紫外线透射灯下观察结果。在紫外线灯下，各条带清晰易辨，纯合子E2/2有91、83pb片断，E4/4出现72、48pb片断，E3/3出现91、48pb片断，E3/2出现91、83、48pb片断，E4/3出现91、72、48pb片断，E4/2出现91、83、72、48pb片断，根据长度不同而加以鉴别。
三、统计
各类数据均采用SPSS软件统计处理。
结 果
apoE基因型分析结果E3/3型发生频率最高，占整个样本的67.8%，含apoE3的杂合子居中，E4/4的发生频率较低，E2/2和E4/2很少。110例心梗患者的情况也是如此，见表1，表2。
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病例组E3/4和E4/4的发生频率较对照组明显要高，统计学检验差别具显著性(P<0.001)。E4携带者的心梗发病年龄较为提前，纯合子更为明显(P<0.01)。
表1 APOE基因型分布
基因型
合计
2/2
3/2
3/3
3/4
4/4
4/2
对照组
, 百拇医药
1
15
98
13
3
1
131
病例组
1
12
87
30
11
1
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142
合计
2
27
185
43
14
2
273
百分比
0.7
9.9
67.8
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5.1
0.7
100.0
表2 110例心肌梗死患者基因型和发病年龄 基因型
例数
发生心梗年龄(岁)
E3/3
71
67.4±5.6
E3/2
10
69.3±2.5
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E4/3
21
61.2±3.4
E4/4
8
52.6±2.6
讨 论
动脉粥样硬化在早期就已经发生，中老年发生临床CHD而达到高峰。基因变异通过影响脂蛋白水平也影响粥样硬化，如低密度脂蛋白(LDL)受体缺乏[1]，最常见的变异是apoE，系人类19号染色体一个基因位点的三个等位基因所编码，对应三种异构体E2、E3、E4。E3是母体形式，E2、E4是点突变的结果[2，3]。大多数人群研究结果表明，与母体E3相比，E4升高LDL胆固醇(LDL-C)、apo水平，而E2恰好相反，具有降低LDL-C和apoB(apoB)水平的作用。对于甘油三酯(TG)的效应则是E2、E4均具升高作用。目前尚未发现其它等位基因对人群血脂有如此影响[4]。三种等位基因携带者血脂水平有如此差异，导致机体在同一环境中易患高脂血症和冠状动脉病变程度不同。
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我们的结果表明无论是病例组还是对照组，apoE3/3都是占主导的基因型，但E4携带者在病例组较对照组明显增加，差别具显著性。复习文献，其结果大都倾向于E4携带者具有CHD的危险性，一份对Framingham人群的后代进行横断面研究，发现与apoE3/3相比，apoE4携带者LDL-C升高，apoE2和apoE4携带者TG升高[5]。不论男性和女性，apoE携带者患CHD的危险性均上升。在校正高血压、吸烟、肥胖、糖尿病后，这种关系依然存在。因而作者认为：apoE4是脂质代谢紊乱和CHD的重要遗传标记，与已知的能致脂蛋白代谢紊乱基因相比，apoE4携带者患CHD的危险度更大。在Framingham人群的后代，有15%CHD患者是apoE4携带者[6]。
Van Bockxmeer等[6]报告E4是早发CHD的独立危险因子，纯合子E4/4更是导致CHD发病年龄提前的危险因素。
我们的结果也表明在病例组，apoE等位基因的频率较对照组高得多，而且在心梗病人的亚组分析中初步发现E4携带者心梗的年龄较为提前，这一点很值得进一步研究。
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参考文献：
1，Hixson JE，Vernier DT，Zannis VL，et al.Apolipoprotein polymorphisms affect atherosclerosis in young males.Arterioscler Thromb，1991，11：1237-1244.
2，Zannis VL，Breslow JL，Utermann，et al. Proposed nomenclature of apoE isoprotein apoE genotypes and phenotypes.J Lipid Res，1982，23：911-914.
3，Weisgraber KH，Innerarity TL，Mahley RW，et al. Human E
apolipoprotein heterogeneity.Cysteinearginine interchanges in the amino acid sequence of the apoE isoforms.J Biol Chem，1981，256：9077-9083.
, 百拇医药
4，Klausen IC，Gerdes LU，Sihm I，et al. Apolipoprotein E polymorphism in a Danish population compared to findings in 45 other study populations around the world.Genet epidemiol，1992，9：155-167.
5，Peter WF，Paik YK，Dawson PA，et al.Apolipoprotein E alleles，dyslipidemia and coronary heart disease.JAMA，1994，272：1666-1671.
6，Van Bockxmeer FM，Ehnholm C，Lukka M，et al.Apolipoproteine epsilon 4 homozygousity in young men with coronary heart disease.Lanct，1992，340：879-880.
收稿日期：1999-04-06
修回日期：1999-09-03, 百拇医药