哮喘中外周血单个核细胞白细胞介素5表达及意义研究
作者：罗百灵 吴鄂生 丘万服 海镇环
单位：湖南医科大学附属湘雅医院呼吸科 长沙 410008
关键词：哮喘；外周血单个核细胞；白细胞介素5；嗜酸性粒细胞
中国现代医学杂志000404 该文研究了哮喘豚鼠嗜酸性粒细胞(EOS)在外周血及支气管肺泡灌洗液(BALF)中的变化，用RT-PCR半定量测定了外周血单个核细胞(PBMC)及支气管组织白细胞介素5(IL-5)mRNA表达量。结果显示哮喘豚鼠EOS及IL-5mRNA表达量均较对照组及地塞米松干预组显著升高，PBMC中IL-5 mRNA表达量与支气管组织IL-5表达及外周血EOS计数成正相关。提示哮喘豚鼠PBMC、IL-5 mRNA表达增强，能敏感反映哮喘气道局部炎症及程度。
分类号 R562.2+5
, 百拇医药
THE EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF PERIPHERAL BLOOD
MONONUCLEAR CELL INTERLEUKIN-5mRNA IN ASTHMA
Luo Bailing Wu Esheng Qiu Wanfu et al.
(Department of Respiratory Medicine, the Affiliated Xiangya Hospital
of Hunan Medical University, Changsha, 410008)
Objective: To investigate the state and significance of IL-5mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of asthmatic guinea pigs. Methods: 31 guinea pigs were randomly allocated into 3 experimental groups, viz. The blank control group (C group n=10), the asthmatic group (A group n=11), and the dexamethasone (DXM) treatment group (D group n=10). The A and D groups were challenged by ovalbumin (OVA) to produce asthmatic models. Whereas the D group were received intraperitoneal DXM before each OVA aerosol challenge. Peripheral white blood cell and differential count were compared with that of the BALF of the experimental animals. PBMC and bronchial tissue IL-5mRNA expression level was measured semiquantitatively by reverse transcriptional polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: The eosinophil count in blood and BALF of A group were significantly higher than the C group (P<0.01) and D group (P<0.005 and P<0.01 respectively). The PBMC IL-5mRNA expression level of A group (84.10+26.75%) was significantly higher than that of the C group (40.80+13.90%) and the D group (59.50+9.22%), P<0.05, P<0.001 respectively. The PBMC IL-5mRNA expression level was positively correlated with that of the bronchial tissue and blood eosinophils of the asthmatic guinea pigs, r=0.705, P<0.01; r=0.558, P<0.01. Conclusions: The PBMC IL-5mRNA expression can reflect the state of eosinophils infiltration and IL-5mRNA expression increased inflammatory pathology in the airway of asthmatic guinea pig models. Measurement of IL-5mRNA expression by PBMC may become a new clinical test that is useful in understanding the severity of asthma and the reaction to corticostoroid therapy.
, http://www.100md.com
Key words: Bronchial asthma; Peripheral blood mononuclear cells; Interleakin-5; Eosinophil.
为了解哮喘者外周血单个核细胞(PBMC)IL-5表达能否敏感反映哮喘气道炎症，我们利用哮喘豚鼠模型，观察其外周血与肺泡灌洗液(BALF)细胞成份改变一致性；研究其PBMC、IL-5 mRNA表达变化及与支气管组织IL-5 mRNA表达的相关性。
1 材料与方法
1.1 研究对象
健康豚鼠31只，雌雄不拘，体重250～350 g。随机分成哮喘模型组(A组)11只，地塞米松治疗组(D组)10只，对照组(C组)10只。
1.2 建立哮喘模型
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A、D组鼠均腹腔内注入10% OVA(卵蛋白Sigma产品)1 ml(致敏)，C组鼠腹腔内注入0.9%生理盐水1 ml。A组鼠致敏后第14天吸入雾化的1%OVA诱喘，诱喘时间视豚鼠出现明确的哮喘表现而终止(诱喘潜伏期)。诱喘1次/d，连续5 d。D组豚鼠每诱喘前2 h腹腔内注入地塞米松(DXM) 0.5 mg/kg(生理盐水稀释)，余同A组。C组鼠腹腔内注入生理盐水后第14天，每天给予生理盐水雾化吸入1次。
1.3 制备标本
1.3.1 PBMC：诱喘5次后心脏采血5 ml置肝素抗凝管，利用Ficall分离液密度梯度离心法分离PBMC(PBMC 数为≥2×106/ml，活细胞比例>95%)。
1.3.2 支气管组织：各组留取2例左肺上叶支气管肺组织供电镜病检，分离左肺支气管，立即冻存-80 ℃冰箱备用。
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1.3.3 支气管肺泡灌洗及细胞计数：从气管插入输液用塑料细管至右主支气管，行右肺支气管肺泡灌洗(BLA)。每次注入2 ml生理盐水(37 ℃)，留置2 min后回抽支气管肺泡灌洗液，重复3次。取回收BALF分量高倍镜下行白细胞计数，取1 ml 离心5 min，细胞沉淀涂片，吹干，用Wright-Giemsa染色，油镜下计数200个细胞作分类。
1.3.4 取耳垂血，常规显微镜下行白细胞计数及分类，嗜酸性细胞(EOS)计数。
1.4 PBMC、支气管组织IL-5 mRNA表达及半定量
按RNA分离试剂Trizal(Life Technology产品)说明，抽提PBMC及支气管组织总RNA。根据豚鼠IL-5[1]及选作内对照的三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)[2]cDNA序列设计引物(上海Sangon公司合成)。扩增片断长段分别为340 bp (IL-5)及227 bp(GAPDH)。按《分子克隆》[3]及RT-PCR试剂盒(promega产品)说明操作IL-5、GAPDH mRNA RT-PCR。RT-PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳。根据标准DNA参照，确定IL-5为340 bp及GAPDH为227 bp，然后经电脑图像分析系统，测定两者光密度比值，确定IL-5 mRNA表达半定量值。
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1.5 统计处理
实验数据用
±s表示。方差齐性下两两比较用方差分析(Tukey检验)，相关性统计用直线相关分析。
2 结果
2.1 各组病理形态学变化:电镜病理学检查,A组豚鼠细支气管病变符合哮喘气道炎症病理学改变[4]。哮喘组豚鼠细支气管病理改变显示管腔内、上皮粘膜层大量EOS浸润,脱颗粒。DXM治疗组改变轻微,无明显EOS浸润。对照组细支气管结构正常。
2.2 BALF细胞计数与分类：A组BALF中总细胞数、EOS百分率均显著高于C组(均P<0.001)及D组(P<0.005，P<0.01)。D组与C组间上述三者均无显著差别。A组淋巴细胞较C、D组升高，但无统计学意义。
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2.3 外周血白细胞计数及分类：A组WBC、淋巴细胞及EOS百分率显著高于C组，(P<0.001,P<0.05及P<0.001)显著高于D组(P<0.005,P<0.05,P<0.005)。
2.4 PBMC、支气管组织IL-5 mRNA RT-PCR产物电泳结果。两不同来源的IL-5 mRNA表达对照组、DXM干预组、哮喘组豚鼠依次增强，PBMC IL-5 mRNA表达均弱于支气管组织IL-5 mRNA表达，见附图，IL-5 mRNA定量表达见附表。
附表 PBMC及支气管组织IL-5 mRNA表达半定量变化 分组
例数
(例)
PBMC IL-5
表达量(%)
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支气管组织
IL-5表达量(%)
A组
11
84.10±26.751)3)
106.91±20.091)2)
D组
10
59.60±9.21
75.30±10.70
C组
10
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40.80±13.90
62.60±13.84
注：1)与C组比较P<0.001；
2)与D组比较P<0.001；
3)与D组比较P<0.05
2.5 哮喘发作豚鼠(含A、D组豚鼠)支气管组织IL-5 mRNA与BALF及外周血EOS计数以及PBMC与支气管组织IL-5 mRNA表达水平相关性分析。支气管组织IL-5 mRNA表达量与BALF中EOS百分比为正相关(r＝0.924，P<0.01)，PBMC IL-5 mRNA与支气管组织IL-5 mRNA表达量呈正相关(r＝0.705，P<0.01)。
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附图 PBMC IL-5 mRNA RT-PCR电泳
1、3、5为哮喘组，DXM组及对照组豚鼠支气管组织IL-5 mRNA表达，2、4、6则分别为上述组PBMC IL-5 mRNA表达,M为标本分子量DNA
3 讨论
哮喘患者支气管粘膜、BALF细胞均有IL-5 mRNA表达，表达强度与EOS细胞浸润及气道损伤程度呈正相关[5]。但哮喘气道炎症局部IL-5 表达变化能否通过PBMC IL-5 mRNA表达来反映尚未见报道。
据本课题各组鼠发病程度、细支气管病理改变、BALF细胞成份、支气管组织IL-5 mRNA表达以及IL-5与EOS间关系，证实EOS是哮喘气道炎症病理中主要细胞事件，IL-5与EOS在哮喘气道炎症中均增加，二者以正相关参与哮喘发病。激素在哮喘中能下调IL-5 mRNA表达，对EOS浸润有明显抑制作用。
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Douglas[6]发现过敏性哮喘患者BALF细胞中IL-5 mRNA表达阳性细胞中91%是淋巴细胞。PBMC主要组成细胞即是淋巴细胞，Till报道[7]哮喘者吸入抗原后，其BALF及外周血中淋巴细胞以及其细胞培养液中IL-5均增加，且BALF淋巴细胞产生了更多的IL-5，本课题结果正与此相符。外周血淋巴细胞数及PBMC IL-5 mRNA表达在哮喘组显著增高，而DXM治疗组则增加不明显，并且PBMC IL-5 mRNA与支气管组织IL-5 mRNA表达水平及与外周血EOS数量呈正相关。说明PBMC IL-5 mRNA表达量敏感反应了哮喘气道炎症程度，提示我们可以通过简单的采静脉血测PBMC IL-5 mRNA表达水平来了解哮喘气道炎症及指导激素运用。
参 考 文 献
1，Mahmoud M,Micheal K,Steven J,et al.Production and characterization of guinea pig IL-5 by baculovirus-infected insect cells.Am J Physiol,1996；270:1002～1007
, 百拇医药
2，Aguan K,Weiner CP.Direct submission submitted(30-oct-1996)obstetrics and gynecology.Univ.of maryland,655 west Baltimore st,Baltimore,MD，21201,USA
3，J.萨姆布鲁克等著(U.S.A).分子克隆实验指南.北京：科学出版社，1995：129
4，李明华，李进.支气管哮喘病理学改变.李明华，殷凯生主编.哮喘病学.北京：人民卫生出版社，1998：76～82
5，Marc H,Christopher JC,Patrick K,et al.Relationship between IL-4 and IL-5 mRNA expression and disease severity in atopic asthma.Am J Respir Crit Care Med,1997；156:704～708
, 百拇医药
6，Douglas SR,Qutayba H,Sun Y,et al.Predominant TH2-Like bronchoalveolar T-lymphocytes population in atopic asthma.N Engl J Med,1992；326:298～304
7，Till SJ,Durham S R,Rajakuladingam MK,et al.Allergen-induced proliferation and interleukin-5 production by bronchoalverolar lavage and blood T cells after segmented allergen challenge.AM J Respir Crit Care Med,1998；158:404～411
收稿1999-12-03, 百拇医药
单位：湖南医科大学附属湘雅医院呼吸科 长沙 410008
关键词：哮喘；外周血单个核细胞；白细胞介素5；嗜酸性粒细胞
中国现代医学杂志000404 该文研究了哮喘豚鼠嗜酸性粒细胞(EOS)在外周血及支气管肺泡灌洗液(BALF)中的变化，用RT-PCR半定量测定了外周血单个核细胞(PBMC)及支气管组织白细胞介素5(IL-5)mRNA表达量。结果显示哮喘豚鼠EOS及IL-5mRNA表达量均较对照组及地塞米松干预组显著升高，PBMC中IL-5 mRNA表达量与支气管组织IL-5表达及外周血EOS计数成正相关。提示哮喘豚鼠PBMC、IL-5 mRNA表达增强，能敏感反映哮喘气道局部炎症及程度。
分类号 R562.2+5
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THE EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF PERIPHERAL BLOOD
MONONUCLEAR CELL INTERLEUKIN-5mRNA IN ASTHMA
Luo Bailing Wu Esheng Qiu Wanfu et al.
(Department of Respiratory Medicine, the Affiliated Xiangya Hospital
of Hunan Medical University, Changsha, 410008)
Objective: To investigate the state and significance of IL-5mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of asthmatic guinea pigs. Methods: 31 guinea pigs were randomly allocated into 3 experimental groups, viz. The blank control group (C group n=10), the asthmatic group (A group n=11), and the dexamethasone (DXM) treatment group (D group n=10). The A and D groups were challenged by ovalbumin (OVA) to produce asthmatic models. Whereas the D group were received intraperitoneal DXM before each OVA aerosol challenge. Peripheral white blood cell and differential count were compared with that of the BALF of the experimental animals. PBMC and bronchial tissue IL-5mRNA expression level was measured semiquantitatively by reverse transcriptional polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: The eosinophil count in blood and BALF of A group were significantly higher than the C group (P<0.01) and D group (P<0.005 and P<0.01 respectively). The PBMC IL-5mRNA expression level of A group (84.10+26.75%) was significantly higher than that of the C group (40.80+13.90%) and the D group (59.50+9.22%), P<0.05, P<0.001 respectively. The PBMC IL-5mRNA expression level was positively correlated with that of the bronchial tissue and blood eosinophils of the asthmatic guinea pigs, r=0.705, P<0.01; r=0.558, P<0.01. Conclusions: The PBMC IL-5mRNA expression can reflect the state of eosinophils infiltration and IL-5mRNA expression increased inflammatory pathology in the airway of asthmatic guinea pig models. Measurement of IL-5mRNA expression by PBMC may become a new clinical test that is useful in understanding the severity of asthma and the reaction to corticostoroid therapy.
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Key words: Bronchial asthma; Peripheral blood mononuclear cells; Interleakin-5; Eosinophil.
为了解哮喘者外周血单个核细胞(PBMC)IL-5表达能否敏感反映哮喘气道炎症，我们利用哮喘豚鼠模型，观察其外周血与肺泡灌洗液(BALF)细胞成份改变一致性；研究其PBMC、IL-5 mRNA表达变化及与支气管组织IL-5 mRNA表达的相关性。
1 材料与方法
1.1 研究对象
健康豚鼠31只，雌雄不拘，体重250～350 g。随机分成哮喘模型组(A组)11只，地塞米松治疗组(D组)10只，对照组(C组)10只。
1.2 建立哮喘模型
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A、D组鼠均腹腔内注入10% OVA(卵蛋白Sigma产品)1 ml(致敏)，C组鼠腹腔内注入0.9%生理盐水1 ml。A组鼠致敏后第14天吸入雾化的1%OVA诱喘，诱喘时间视豚鼠出现明确的哮喘表现而终止(诱喘潜伏期)。诱喘1次/d，连续5 d。D组豚鼠每诱喘前2 h腹腔内注入地塞米松(DXM) 0.5 mg/kg(生理盐水稀释)，余同A组。C组鼠腹腔内注入生理盐水后第14天，每天给予生理盐水雾化吸入1次。
1.3 制备标本
1.3.1 PBMC：诱喘5次后心脏采血5 ml置肝素抗凝管，利用Ficall分离液密度梯度离心法分离PBMC(PBMC 数为≥2×106/ml，活细胞比例>95%)。
1.3.2 支气管组织：各组留取2例左肺上叶支气管肺组织供电镜病检，分离左肺支气管，立即冻存-80 ℃冰箱备用。
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1.3.3 支气管肺泡灌洗及细胞计数：从气管插入输液用塑料细管至右主支气管，行右肺支气管肺泡灌洗(BLA)。每次注入2 ml生理盐水(37 ℃)，留置2 min后回抽支气管肺泡灌洗液，重复3次。取回收BALF分量高倍镜下行白细胞计数，取1 ml 离心5 min，细胞沉淀涂片，吹干，用Wright-Giemsa染色，油镜下计数200个细胞作分类。
1.3.4 取耳垂血，常规显微镜下行白细胞计数及分类，嗜酸性细胞(EOS)计数。
1.4 PBMC、支气管组织IL-5 mRNA表达及半定量
按RNA分离试剂Trizal(Life Technology产品)说明，抽提PBMC及支气管组织总RNA。根据豚鼠IL-5[1]及选作内对照的三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)[2]cDNA序列设计引物(上海Sangon公司合成)。扩增片断长段分别为340 bp (IL-5)及227 bp(GAPDH)。按《分子克隆》[3]及RT-PCR试剂盒(promega产品)说明操作IL-5、GAPDH mRNA RT-PCR。RT-PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳。根据标准DNA参照，确定IL-5为340 bp及GAPDH为227 bp，然后经电脑图像分析系统，测定两者光密度比值，确定IL-5 mRNA表达半定量值。
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1.5 统计处理
实验数据用
±s表示。方差齐性下两两比较用方差分析(Tukey检验)，相关性统计用直线相关分析。2 结果
2.1 各组病理形态学变化:电镜病理学检查,A组豚鼠细支气管病变符合哮喘气道炎症病理学改变[4]。哮喘组豚鼠细支气管病理改变显示管腔内、上皮粘膜层大量EOS浸润,脱颗粒。DXM治疗组改变轻微,无明显EOS浸润。对照组细支气管结构正常。
2.2 BALF细胞计数与分类：A组BALF中总细胞数、EOS百分率均显著高于C组(均P<0.001)及D组(P<0.005，P<0.01)。D组与C组间上述三者均无显著差别。A组淋巴细胞较C、D组升高，但无统计学意义。
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2.3 外周血白细胞计数及分类：A组WBC、淋巴细胞及EOS百分率显著高于C组，(P<0.001,P<0.05及P<0.001)显著高于D组(P<0.005,P<0.05,P<0.005)。
2.4 PBMC、支气管组织IL-5 mRNA RT-PCR产物电泳结果。两不同来源的IL-5 mRNA表达对照组、DXM干预组、哮喘组豚鼠依次增强，PBMC IL-5 mRNA表达均弱于支气管组织IL-5 mRNA表达，见附图，IL-5 mRNA定量表达见附表。
附表 PBMC及支气管组织IL-5 mRNA表达半定量变化 分组
例数
(例)
PBMC IL-5
表达量(%)
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支气管组织
IL-5表达量(%)
A组
11
84.10±26.751)3)
106.91±20.091)2)
D组
10
59.60±9.21
75.30±10.70
C组
10
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40.80±13.90
62.60±13.84
注：1)与C组比较P<0.001；
2)与D组比较P<0.001；
3)与D组比较P<0.05
2.5 哮喘发作豚鼠(含A、D组豚鼠)支气管组织IL-5 mRNA与BALF及外周血EOS计数以及PBMC与支气管组织IL-5 mRNA表达水平相关性分析。支气管组织IL-5 mRNA表达量与BALF中EOS百分比为正相关(r＝0.924，P<0.01)，PBMC IL-5 mRNA与支气管组织IL-5 mRNA表达量呈正相关(r＝0.705，P<0.01)。
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附图 PBMC IL-5 mRNA RT-PCR电泳
1、3、5为哮喘组，DXM组及对照组豚鼠支气管组织IL-5 mRNA表达，2、4、6则分别为上述组PBMC IL-5 mRNA表达,M为标本分子量DNA
3 讨论
哮喘患者支气管粘膜、BALF细胞均有IL-5 mRNA表达，表达强度与EOS细胞浸润及气道损伤程度呈正相关[5]。但哮喘气道炎症局部IL-5 表达变化能否通过PBMC IL-5 mRNA表达来反映尚未见报道。
据本课题各组鼠发病程度、细支气管病理改变、BALF细胞成份、支气管组织IL-5 mRNA表达以及IL-5与EOS间关系，证实EOS是哮喘气道炎症病理中主要细胞事件，IL-5与EOS在哮喘气道炎症中均增加，二者以正相关参与哮喘发病。激素在哮喘中能下调IL-5 mRNA表达，对EOS浸润有明显抑制作用。
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Douglas[6]发现过敏性哮喘患者BALF细胞中IL-5 mRNA表达阳性细胞中91%是淋巴细胞。PBMC主要组成细胞即是淋巴细胞，Till报道[7]哮喘者吸入抗原后，其BALF及外周血中淋巴细胞以及其细胞培养液中IL-5均增加，且BALF淋巴细胞产生了更多的IL-5，本课题结果正与此相符。外周血淋巴细胞数及PBMC IL-5 mRNA表达在哮喘组显著增高，而DXM治疗组则增加不明显，并且PBMC IL-5 mRNA与支气管组织IL-5 mRNA表达水平及与外周血EOS数量呈正相关。说明PBMC IL-5 mRNA表达量敏感反应了哮喘气道炎症程度，提示我们可以通过简单的采静脉血测PBMC IL-5 mRNA表达水平来了解哮喘气道炎症及指导激素运用。
参 考 文 献
1，Mahmoud M,Micheal K,Steven J,et al.Production and characterization of guinea pig IL-5 by baculovirus-infected insect cells.Am J Physiol,1996；270:1002～1007
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2，Aguan K,Weiner CP.Direct submission submitted(30-oct-1996)obstetrics and gynecology.Univ.of maryland,655 west Baltimore st,Baltimore,MD，21201,USA
3，J.萨姆布鲁克等著(U.S.A).分子克隆实验指南.北京：科学出版社，1995：129
4，李明华，李进.支气管哮喘病理学改变.李明华，殷凯生主编.哮喘病学.北京：人民卫生出版社，1998：76～82
5，Marc H,Christopher JC,Patrick K,et al.Relationship between IL-4 and IL-5 mRNA expression and disease severity in atopic asthma.Am J Respir Crit Care Med,1997；156:704～708
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6，Douglas SR,Qutayba H,Sun Y,et al.Predominant TH2-Like bronchoalveolar T-lymphocytes population in atopic asthma.N Engl J Med,1992；326:298～304
7，Till SJ,Durham S R,Rajakuladingam MK,et al.Allergen-induced proliferation and interleukin-5 production by bronchoalverolar lavage and blood T cells after segmented allergen challenge.AM J Respir Crit Care Med,1998；158:404～411
收稿1999-12-03, 百拇医药