遗传性非息肉性大肠癌遗传学检测结果的解释：临床易感检测的意义
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单位：
关键词：
美国医学会杂志中文版000403
背景：癌症易感性遗传学检测正在从纯粹研究向临床应用演化。
目的：确定遗传性非息肉性大肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)的遗传学检测结果在何种情况下能够明确解释疾病并指导临床实践。
设计：1996～1998年进行的系列病例研究。该研究对hMSH2和hMLH1编码序列及其旁侧内含子区域进行了全序列分析。突变分为蛋白截断和错义两类。对错义改变做进一步分析以评价其致病性。
条件设定和参加者：家族根据本人或保健人员向癌症遗传机构提供的资料确定。参加者及其亲属分为四类：(1)HNPCC符合Amsterdam标准；(2)HNPCC符合改良的Amsterdam标准；(3)年轻发病；(4)变异型HNPCC。另外，根据Bethesda指南确定HNPCC先证者。
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主要观察指标：hMSH2和hMLH1基因的改变。
结果：在34.3%的家族(24/70)发现27处hMSH2和hMLH1改变。其中25.7%(18/70)的家族发现了能够用于指导临床的有害突变。明确结果的比例，符合Amsterdam标准的家族为39.3%(27)，符合改良Amsterdam标准的家族为18.2%(13)，年轻发病的为16.7%(12)，符合变异型HNPCC的为15.8%(11)，符合Bethesda先证者指南的为30.4%(21)。错义突变的存在、综合征的遗传异质性以及功能检测手段有限使HNPCC家族检测结果的解释颇具挑战性。
结论：在重要家族检测致病突变，为HNPCC和HNPCC样亲属提供了一个重要的遗传学检测方式。然而，由于大部分个体hMSH2和hMLH1序列分析并未获得明确的结果，所以密切随访仍然是必要的。
Interpretation of Genetic Test Results for Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer：Implications for Clinical Predisposition Testing
, 百拇医药
Sapna Syngal,MD,MPH Edward A.Fox,PhD Christine Li,MD Marisa Dovidio,BS Charis Eng,MD,PhD Richard D.Kolodner,PhD Judy E.Garber,MD,MPH
癌症易感性的遗传学检测正在从实验研究向临床服务模式转化。为指导这种转化，美国临床癌症学会建议，在符合如下条件时，可考虑临床易感性检测：(1)有明确的家族癌症史或异常早发癌症病史，预期阳性结果可能性很高时；(2)检测能被适当解释时；(3)检测结果可能影响患者及其亲属的临床处理1。
遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)是最常见的遗传性结肠癌综合征2。HNPCC属显性遗传病。其特点是随着生命的延长，有关癌症的发生率升高，包括大肠癌、子宫内膜癌以及结肠外消化道癌、泌尿生殖系统癌和卵巢癌3-5。目前已提出多种确定HNPCC的临床标准，包括Amsterdam标准6和改良的Amesterdam标准7。此综合征与5个DNA错配修复基因的胚系突变有关，最常见的为hMSH2和hMLH18-23。具有hMSH2和hMLH1突变的肿瘤，具有一种称为微卫星不稳定性的特定表型，其特点为在多个位点上短重复DNA序列的延长或缩短24-27。
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HNPCC综合征的准确定义仍未明确。无论是对临床医生还是对研究者，临床表型多样以及基因众多均使HNPCC患者和家族的评估成为一个非常复杂的问题。有人指责Amsterdam标准过于苛刻28，而其他临床标准对HNPCC又过于宽松且缺乏特异性。因为已知突变并不能对所有符合最严格的Amsterdam标准的家族作出解释，所以人们猜测可能还有其他更为相关的基因。尽管如此，对于高危家族的成员，癌症易感性遗传学检测仍为一种有价值的选择。在先证者确定一种与癌症危险升高相关的致病胚系突变，可使我们检出无症状的突变携带者，从而使其从癌症监测或降低癌症危险的措施中获益29。检测阴性不但可使有关家族成员避免不必要的监测或预防性手术，并且可减轻其对癌症的恐惧。
我们对70个提示有家族HNPCC病史的成员进行了hMSH2和hMLH1基因的突变分析。研究的目的是：在符合现有HNPCC标准的个体，通过hMSH2和hMLH1基因突变的发生情况，从临床应用角度对HNPCC遗传学检测作出评估；进而确定HNPCC遗传检测结果可被清楚解释并用于指导临床决策的程度。
, 百拇医药
表1 HNPCC 临床标准* 名称
标准
Amsterdam标准6
家族中3例患CRC，其他2例的一级亲属1人；至少2代人患CRC； 50岁前诊断CRC者≥1例
改良Amsterdam标准7
1. 家族很小，无法再扩展，一级亲属中仅2例CRC考虑为HNPCC；至少2代人患CRC；必须有1例于55岁前诊断
2. 在有2例一级亲属受CRC影响的家族中，第三名亲属患有异常早发肿瘤或子宫内膜癌症
, 百拇医药
年轻发病
先证诊断<40岁，没有家族史满足Amsterdam或改良Amsterdam标准
变异型HNPCC
家族史提示HNPCC，但未满足Amsterdam标准、改良Amsterdam标准、年轻发病标准
Bethesda28条款
1. 满足Amsterdam标准家族的患癌个体
2. 患有两种HNPCC相关癌症，包括同时发生或异时发生的CRC或相关结肠外癌症
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3. 个体患有CRC和1例一级亲属患有CRC及/或HNPCC相关结肠外癌症及/或结肠腺癌；其中1例癌症诊断年龄<45岁，腺癌诊断年龄<40岁
4. 个体患有CRC或子宫内膜癌症，诊断年龄<45岁
5. 个体患有右侧CRC，有<45岁的分化不良形式(固体/多孔)的病理诊断
6. 个体患有细胞型CRC，诊断年龄<45岁
7. 个体患有腺癌，诊断年龄<40岁
*HNPCC:遗传性非息肉性大肠癌；CRC:大肠癌所有标准必须满足满足所列任何标准的所有特点方法
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样本获得
我们的目的是：在目前推荐的临床使用背景或范围内，对 HNPCC遗传易感检测的实用性进行评估。有关家族通过个人或保健人员提供的资料确定，根据多例大肠癌(CRC)、发病年龄小于40岁或CRC与其他HNPCC相关癌症的家族相关性登记注册。个人和家族癌症史及人口学资料由先证者及其亲属提供。癌症诊断和死亡通过回顾医疗史、病理报告或死亡证明证实。此项目经单位审查委员会批准，每例患者均获得知情同意。
每个家系均按家族史是否符合Amsterdam标准6、改良Amsterdam标准7、年轻发病或变异型HNPCC标准(表1)分类。根据最近提出的确定HNPCC患者的Bethesda指南，对每个家系发生大肠癌的早发先证者也进行了评估确定28。
利用每个家族中先证者的血样进行遗传学检测。由于难以得到用于微卫星不稳定性分析的石蜡包埋肿瘤标本，加之遗传突变检测技术可靠性提高，我们采用了血样标本DNA序列分析，而不是从分析癌症的微卫星不稳定性入手。
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hMSH2和hMLH1序列分析
使用一种DNA提取工具(Qiagen，Valencia，Calif)从外周血提取DNA。通过多聚酶链反应扩增hMSH2和hMSH1基因的每个外显子和其一些旁侧内含子序列(引物序列及条件由作者提供)。测序反应在一个多探针自动仪上进行(104DT，Packard Instrument Company，Meriden，Conn)。产生的荧光测序产物用半自动序列仪进行分析(Model 377，PerkinsElmer Applied Biosystems Division，Foster City，Calif)。
每个先证者的测序结果均首先进行致病突变分析。家族中其他患癌症或腺瘤息肉的成员，其血样也进行同样分析。一个等位基因至少5%的序列改变，考虑为正常变异(多态性)且不作报道。对于其他所有改变，则评估其突变是否为癌症易感的原因。序列变化如果产生终止子、移码或保守剪切序列的改变则归类为蛋白截断突变，因此是有害的。根据以下标准和可以利用的资料，确定错义突变导致氨基酸替换的潜在致病性30：(1)评估这种改变是否改变种间保守氨基酸的进化和性质；(2)估算普通人群这种改变的频率；(3)在家系中分离出携带突变的癌症个体(例如：癌症家族成员表现这种改变而无癌症成员不表现这种改变)；(4)改变影响基因功能的结论性证据。
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然后，根据每个家庭的遗传学检测结果，评估其潜在作用，并将其作为向先证者和其他家族成员提出临床措施的依据。结果分为两类，肯定性的和非结论性的。如果先证者发现明显的致病突变，那么检测结果则被认为是肯定性的；如果先证者未发现序列改变，或者根据评估标准，错义突变为非致病性的，结果就被认为是非结论性的。
表2 在70个家族队列发现的有害突变* 先证者
编号
家族类别
基因
外显子或
内含子
核苷酸
, 百拇医药
突变
氨基酸
改变
出处，年
预测的结果
DF1751
Amsterdam
(1,2,3,4,7)
hMLH1
7
IVS7-2A→G
, 百拇医药 NA
Luce et al21，1995
剪切位点丢失
DF2842
Amsterdam
(1,2,3,4,)
hMLH1
8
c.676C→T
R226X
Moslein et al31，1996
, 百拇医药 蛋白截断
DF168
Amsterdam
(1,2,3,4,7)
hMLH1
8
c.677G→A
R226Q
Wijnen et al17，1996
异常剪切
DF1846
Amsterdam
, http://www.100md.com
(1,3,4,)
hMLH1
12
c.1381A→T
K461X
新发现
蛋白截断
DF2722
Amsterdam
(1,3,4,)
hMLH1
16
c.1810A→T
, 百拇医药
K604X
新发现
蛋白截断
DF336
Amsterdam
(1,3,4)
hMLH1
16
c.1852-1854
delAAG
K618del
Liu et al12 ，1996; Hamilton at al15， 1995; Wijnen et al17， 1996; Weber et al32， 1997; Wijnen et al33 ，1997; Moslein et al31， 1996
, 百拇医药
赖氨酸缺失
DF397
Amsterdam
(1,2,3,4)
hMLH1
16
IVS16+1G→A
NA
新发现
剪切位点丢失
DF1448§
Amsterdam
, 百拇医药 (1,3,4)
hMLH1
19
c.2104-2105
del AG
NA
新发现
蛋白截断
DF2913
Amsterdam
(1,3,4)
hMLH1
19
, 百拇医药
c.2198-2199
insAACA
733
Risinger et al34，1996
蛋白截断
DF171
Amsterdam
(1,3,4,)
hMLH1
19
c.2250C→G
Y750X
, 百拇医药
新发现
蛋白截断
DF241
Amsterdam
(1,3)
hMSH2
12
c.1786-1788
delAAT
N596del
Liu et al12 ，1996; Moslein et al31， 1996; Buerstedde et al35， 1995; Borresen et al36， 1995;Mary et al37，1994
, 百拇医药
天冬酰胺缺失
DF1851
修订的
Amsterdam
hMSH2
5
IVS5+3A→T
NA
Liu et al12， 1996; Wijnen et al33， 1997; Moslein et al31，1997; Liu et al38 ，1994; Froggatt et al39 ，1995; Pensotti et al40， 1997
, 百拇医药
外显子5缺失
DF2579
修订的
Amsterdam
hMSH2
4
c.704-705
delAA
235
新发现
蛋白截断
DF268
变异型HNPCC(7)
, 百拇医药
hMSH2
5
IVS5+3A→T
NA
Liu et al12 ，1996; Wijnen et al33， 1997; Moslein et al31， 1996; Liu et al38， 1994; Froggatt et al39， 1995; Pensotti et al40， 1997
外显子5缺失
DF951
变异型
, http://www.100md.com
HNPCC(2,3,4)
hMSH2
4
c.704-705
delAA
235
新发现
蛋白截断
DF1754
变异型HNPCC
(2,3,4)
hMSH2
, http://www.100md.com 8
c.1352-1353
delAG
451
新发现
蛋白截断
DF1251
年轻发病
(2，3，4)
hMSH2
5
IVS5+3A→T
NA
, 百拇医药
Liu et al12， 1996; Wijnen et al38， 1997; Moslein et al31， 1996; Liu et al38， 1994; Froggatt et al39， 1995; Pensotti et al40， 1997
外显子5缺失
DF357
年轻发病(4)
hMLH1
9
IVS9-1G→T
NA
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新发现
异常剪切
*NA：无效；C：密码子括号内数字代表家族满足的Bethesda 条款根据命名工作组建议的标准命名突变
§此个体还发现第二个突变结果
测序结果
总共登记70个家族，其中297例CRC，364例其他癌症。根据测序结果、已发表资料和现存的突变数据库，我们发现18个家族明确携带有害突变。其中8个突变以往未见报道。2个家族发现1个新的有害突变。尽管没有家族史证据表明这2个家族具有亲缘性，但进一步分析揭示其先证者拥有共同的单倍体型。
, 百拇医药
8个家族发现错义突变(表3)。其中4个突变已经报道，并且至少在1篇报道中被认为是致病性的(表3)。我们对已发表的突变以及所有新的突变均进行补充分析以确定其致病性。通常已发表的文章并不阐述错义突变致癌的机制，并且定义致病突变的标准也多具变化。例如，2个突变(hMLH1编码子1517→C，V506A和hMSH2密码子965G→A，G322D)，由于突变的位点使进化保守氨基酸发生错义改变因而被认为是致病性的12,43。同样，hMLH1基因V506A突变在新的功能检测中，使酵母中该基因失去了“显性阴性”功能，而被认为是致病的48。相反，hMSH2 G322D突变在对照人群也有一定发生率，从而降低了这种突变在功能上的意义44-47。
3个不同家族发现携带2个不同的潜在致病突变。先证者DF260带有2个不同的hMLH1错义突变，哪个有致病性并不明确。先证者DF1751同样带有hMLH1蛋白截断突变和hMSH1错义突变，从酶母分析看来后者也是功能丢失突变48。这两个潜在致病突变可能出现在hMLH1基因的相同拷贝中，或者如新近文章所述49，这些个体是复杂的杂合子。先证者DH1448带有一个hMLH1蛋白截断突变和hMSH2 G322D突变，后者由于在对照人群亦有出现因而一些研究者认为它是非致病性的44-47。此例先证者的这个突变，与一个蛋白截断突变相偶连，更加证明G322D是一个多态性现象。
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表3 错义改变的致病性评估* 先证者
编码
家族类别
外显子或
内含子
氨基酸
改变
出处，年
致病性评估
保守
氨基酸
氨基酸性质
改变
, 百拇医药
普通人群
频率
分离
分析
酵母功能
分析
DF5
Amsterdam
(1,2,3,4)
3
T821
新发现
hMLH1
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极性变为
非极性
0/166
等位基因
非结论性
功能丧失
DF232
Amsterdam
(1,3,4)
19
R755S
新发现
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+
带正电变
为中性
0/186
等位基因
不可能
未检测
DF260
Amsterdam
(1,2,3,4)
13
V506A
, 百拇医药
Liu et al12，1996;
+
非极性变
为非极性
0/184
等位基因
不可能
功能丧失
DF260
Amsterdam
(1,2,3,4)
, 百拇医药
16
K618A
Mauillon et al20， 1996; Weber et al32，1997;Wijnen et al33， 1997
-
带正电变为
非极性
1/186
等位基因
不可能
功能丧失
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DF1751
Amsterdam
(1,2,3,4,7)
19
V716M
Kowalski et al42， 1997
+
非极性变为
非极性
1/180等位基因
非结论性
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功能丧失
DF597
Amsterdam
(1,2,3,4)
5
A272V
新发现
hMSH2
非极性变
为极性
0/186
等位基因
, 百拇医药
非结论性
NA§
DF3002
变异型
HNPCC(3)
6
G315V
新发现
+/-‖
非极性变为
非极性
0/172等位
, 百拇医药
基因
不可能
NA§
DF1448
Amsterdam
(1,2,3)
6
G322D
Maliaka et al43， 1996; Liu et al44， 1995; Wu et al45， 1997; Herfarth et al46， 1997; Froggatt et al47， 1996
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+
非极性变为
带负电
0%-3%△
非结论性
NA§
DF1370
年轻发病
6
G322D
Maliaks et al43， 1996; Liu et al44， 1995; Wu et al45， 1997; Herfarth et al46， 1997; Froggatt et al47， 1996
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+
非极性变为
带负电
0%-3%△
非结论性
NA§
* 括号内数字代表家族满足的Bethesda 条款，根据命名工作组建议的标准命名突变41。黑体代表新突变，加号代表保守氨基酸，减号代表非保守氨基酸；HNPCC，遗传性非息肉性大肠癌一些受影响的家族成员携带同样的突变，但每个家族只有3个或更少的这样的成员；因此，无法得到有统计学意义的结果为致病性下一个肯定的结论其他所有受影响的家族成员死亡或无法与家族其他成员联系
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§ 没有进行hMSH2的功能分析
‖ 在小鼠中保守，酵母中不保守
△ 根据各种报道44，46，47表4 HNPCC中hMSH2和hMLH1基因遗传学检测结果的临床解释 标准
家族数
肯定结果，数目(%)
(非肯定结果，数目(%))/(无突变 非结论性)
总队列
70
18(25.7)
46(65.7)
, 百拇医药
6(8.6)
Amsterdam标准
28
11(39.3)
13(46.4)
4(14.3)
修订的Amsterdam标准
11
2(18.2)
9(81.8)
0(0)
变异型HNPCC
, 百拇医药
19
3(15.8)
15(78.9)
1(5.3)
年轻发病(<40岁)
12
2(16.7)
9(75.0)
1(8.3)
Bethesda(B1-7)
56
17(30.4)
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33(58.9)
6(10.7)
为临床咨询解释遗传学结果
按临床标准分类的所有群组，hMSH2和hMLH1突变分析的临床解释结果见表4。其中，25.7%(18/70)检测结果表明有致病突变，可以用来制定患者和其亲属的医疗决策。符合Amsterdam标准的家族，39.3%有结论性检测结果。在符合改良Amsterdam标准、年轻发病、变异型HNPCC标准的家族中，肯定性结果的比例分别为：18.2%、16.7%和15.8% 。在至少符合一条Bethesda指南的个体中，肯定性结果的比例是30.4%。
在每个分类和总队列分析中，导致非结论性结果的最主要的原因是未发现hMLH1或hMSH2序列的改变。在符合Amsterdam标准家族中有4个(14.3%)先证者，在一个变异性家族中有一个年轻先证者和一个成员发现仅携带一个错义突变。根据表3总结的数据，在先证者DF260和DF5发现的hMLH1突变以及在先证者DF507发现的hMSH2 突变很可能是致病性的。由于缺乏足够的信息，很难为先证者DF232发现的hMLH1 R7555突变以及先证者DF3002发现的hMSH2 G315V下一个结论。在先证者DF1370发现的错义突变(G322D)极可能是多态性。在先证者DF1448，对这种突变的影响也可作出相同的结论。
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尽管进行了补充分析，但是没有一个突变完全符合致病性的标准。我们的一些病例应用了近来发展的hMSH1基因酵母功能分析法，但是由于该法在人类实验研究缺乏依据，因此这种检测作为临床咨询的基础尚不成熟。因此，尽管有几种错义突变可能是致病性的，但是确定致病性资料的可信程度还不足以建议对这些家系未携带突变的个体放弃临床监控。
评论
如今对于许多遗传综合征，癌症易感性遗传检测，已有可能为患者和保健人员提供有价值的信息。然而与其他任何诊断检测相同，遗传学检测的临床应用亦取决于其提供明确结果(阳性或阴性)的能力。取得受检者知情同意的责任，提供检测前和检测后咨询以及解释遗传学检测结果，这些都依赖于组织检测的保健人员50。我们的研究展示了获得满意临床检测面临的优势和挑战。
首先，对那些测序分析具有肯定结果的HNPCC家族成员，遗传学检测是有临床价值的。在这些家族，当发现一个致病突变时，进一步的观察和预防手术可局限于那些携带突变的个体。不带突变的家族成员可以进行一般的普查。在一系列HNPCC和HNPCC样家族中，包括本研究中的家族，有关成员 hMSH2和hMLH1基因致病胚系突变的频率在15%～60%之间12，13，17，19，22，31-33，51，符合较严格HNPCC标准的家族突变发生率更高。
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其次，目前的序列分析并不能给许多家族提供明确的结果。在符合HNPCC临床标准的个人和家族，如果hMSH2和hMLH1序列分析没有发现明确的致病突变，就不需要改变高危家族成员的临床决策。一些已知基因的突变采用现有检测方法并不能查到，也许在家族中还有其他目前未知的基因改变52。错误地解释遗传学结果可造成严重后果，因为假阴性结果有可能导致人们放松对高危个体的医疗监控。对遗传学检测结果进行解释的难度已有文献报道。甚至对于出现临床综合征的患者，医生也会错误地把非结论性的遗传学结果解释为阴性，这样的情况占31.6%53。
第三，并非所有检测到的相关基因序列改变均为一个家族癌症易感的病因。只有在有充分证据显示序列改变可导致基因功能改变的情况下，一个突变才可被认为是癌症易感的原因。不同的研究人员把相同突变确定为致病性或非致病性的事实表明，序列分析结果的解释并不简单。确定一个序列改变是否有意义通常需要与家族成员不断接触，需要他们的同意和参与；不但要进行多步骤实验分析还要对已发表的结果的可信度进行综合评估。
, 百拇医药
对于非结论性的hMSH2和hMLH1结果的家族该怎么办呢？最成熟的方法是对那些未发现突变的家族进行癌症微卫星不稳定性分析。在肿瘤中，证实含有序列改变的第二个等位基因的丢失，也可为突变的致病性提供进一步证据。对于那些带有DNA错义突变和明显微卫星不稳定性的个体，应进一步分析突变的功能意义。对于那些有微卫星不稳定性而无hMSH1改变的个体，则应进行其他HNPCC相关基因分析。其他遗传性结肠癌相关基因的发现最终将使更多的患者获得有关其家族癌症易感性的遗传学结果。
总之，错义突变的发生、综合征的遗传异质性以及缺乏有效功能分析手段，使遗传检测结果的解释以及HNPCC家族的咨询面临挑战。在考虑HNPCC的遗传易感检测时，医务工作者和患者应该充分认识到，遗传学分析及其结果的解释可能比许多传统的诊断检测更为复杂。除了金钱、时间和多步骤分析外，这种检测不但需要多个家族成员的参与并且还可能产生非结论性的结果。然而，对于已找到致病突变的家族，这种检测则有明显的临床价值。在这种情况下，遗传学检测对于HNPCC和HNPCC样家族是一个重要的选择。
姜劲迈 译 柯 杨 校
JAMA 1999；282：247～253
(参考文献从略), 百拇医药
单位：
关键词：
美国医学会杂志中文版000403
背景：癌症易感性遗传学检测正在从纯粹研究向临床应用演化。
目的：确定遗传性非息肉性大肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)的遗传学检测结果在何种情况下能够明确解释疾病并指导临床实践。
设计：1996～1998年进行的系列病例研究。该研究对hMSH2和hMLH1编码序列及其旁侧内含子区域进行了全序列分析。突变分为蛋白截断和错义两类。对错义改变做进一步分析以评价其致病性。
条件设定和参加者：家族根据本人或保健人员向癌症遗传机构提供的资料确定。参加者及其亲属分为四类：(1)HNPCC符合Amsterdam标准；(2)HNPCC符合改良的Amsterdam标准；(3)年轻发病；(4)变异型HNPCC。另外，根据Bethesda指南确定HNPCC先证者。
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主要观察指标：hMSH2和hMLH1基因的改变。
结果：在34.3%的家族(24/70)发现27处hMSH2和hMLH1改变。其中25.7%(18/70)的家族发现了能够用于指导临床的有害突变。明确结果的比例，符合Amsterdam标准的家族为39.3%(27)，符合改良Amsterdam标准的家族为18.2%(13)，年轻发病的为16.7%(12)，符合变异型HNPCC的为15.8%(11)，符合Bethesda先证者指南的为30.4%(21)。错义突变的存在、综合征的遗传异质性以及功能检测手段有限使HNPCC家族检测结果的解释颇具挑战性。
结论：在重要家族检测致病突变，为HNPCC和HNPCC样亲属提供了一个重要的遗传学检测方式。然而，由于大部分个体hMSH2和hMLH1序列分析并未获得明确的结果，所以密切随访仍然是必要的。
Interpretation of Genetic Test Results for Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer：Implications for Clinical Predisposition Testing
, 百拇医药
Sapna Syngal,MD,MPH Edward A.Fox,PhD Christine Li,MD Marisa Dovidio,BS Charis Eng,MD,PhD Richard D.Kolodner,PhD Judy E.Garber,MD,MPH
癌症易感性的遗传学检测正在从实验研究向临床服务模式转化。为指导这种转化，美国临床癌症学会建议，在符合如下条件时，可考虑临床易感性检测：(1)有明确的家族癌症史或异常早发癌症病史，预期阳性结果可能性很高时；(2)检测能被适当解释时；(3)检测结果可能影响患者及其亲属的临床处理1。
遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)是最常见的遗传性结肠癌综合征2。HNPCC属显性遗传病。其特点是随着生命的延长，有关癌症的发生率升高，包括大肠癌、子宫内膜癌以及结肠外消化道癌、泌尿生殖系统癌和卵巢癌3-5。目前已提出多种确定HNPCC的临床标准，包括Amsterdam标准6和改良的Amesterdam标准7。此综合征与5个DNA错配修复基因的胚系突变有关，最常见的为hMSH2和hMLH18-23。具有hMSH2和hMLH1突变的肿瘤，具有一种称为微卫星不稳定性的特定表型，其特点为在多个位点上短重复DNA序列的延长或缩短24-27。
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HNPCC综合征的准确定义仍未明确。无论是对临床医生还是对研究者，临床表型多样以及基因众多均使HNPCC患者和家族的评估成为一个非常复杂的问题。有人指责Amsterdam标准过于苛刻28，而其他临床标准对HNPCC又过于宽松且缺乏特异性。因为已知突变并不能对所有符合最严格的Amsterdam标准的家族作出解释，所以人们猜测可能还有其他更为相关的基因。尽管如此，对于高危家族的成员，癌症易感性遗传学检测仍为一种有价值的选择。在先证者确定一种与癌症危险升高相关的致病胚系突变，可使我们检出无症状的突变携带者，从而使其从癌症监测或降低癌症危险的措施中获益29。检测阴性不但可使有关家族成员避免不必要的监测或预防性手术，并且可减轻其对癌症的恐惧。
我们对70个提示有家族HNPCC病史的成员进行了hMSH2和hMLH1基因的突变分析。研究的目的是：在符合现有HNPCC标准的个体，通过hMSH2和hMLH1基因突变的发生情况，从临床应用角度对HNPCC遗传学检测作出评估；进而确定HNPCC遗传检测结果可被清楚解释并用于指导临床决策的程度。
, 百拇医药
表1 HNPCC 临床标准* 名称
标准
Amsterdam标准6
家族中3例患CRC，其他2例的一级亲属1人；至少2代人患CRC； 50岁前诊断CRC者≥1例
改良Amsterdam标准7
1. 家族很小，无法再扩展，一级亲属中仅2例CRC考虑为HNPCC；至少2代人患CRC；必须有1例于55岁前诊断
2. 在有2例一级亲属受CRC影响的家族中，第三名亲属患有异常早发肿瘤或子宫内膜癌症
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年轻发病
先证诊断<40岁，没有家族史满足Amsterdam或改良Amsterdam标准
变异型HNPCC
家族史提示HNPCC，但未满足Amsterdam标准、改良Amsterdam标准、年轻发病标准
Bethesda28条款
1. 满足Amsterdam标准家族的患癌个体
2. 患有两种HNPCC相关癌症，包括同时发生或异时发生的CRC或相关结肠外癌症
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3. 个体患有CRC和1例一级亲属患有CRC及/或HNPCC相关结肠外癌症及/或结肠腺癌；其中1例癌症诊断年龄<45岁，腺癌诊断年龄<40岁
4. 个体患有CRC或子宫内膜癌症，诊断年龄<45岁
5. 个体患有右侧CRC，有<45岁的分化不良形式(固体/多孔)的病理诊断
6. 个体患有细胞型CRC，诊断年龄<45岁
7. 个体患有腺癌，诊断年龄<40岁
*HNPCC:遗传性非息肉性大肠癌；CRC:大肠癌
所有标准必须满足满足所列任何标准的所有特点方法, http://www.100md.com
样本获得
我们的目的是：在目前推荐的临床使用背景或范围内，对 HNPCC遗传易感检测的实用性进行评估。有关家族通过个人或保健人员提供的资料确定，根据多例大肠癌(CRC)、发病年龄小于40岁或CRC与其他HNPCC相关癌症的家族相关性登记注册。个人和家族癌症史及人口学资料由先证者及其亲属提供。癌症诊断和死亡通过回顾医疗史、病理报告或死亡证明证实。此项目经单位审查委员会批准，每例患者均获得知情同意。
每个家系均按家族史是否符合Amsterdam标准6、改良Amsterdam标准7、年轻发病或变异型HNPCC标准(表1)分类。根据最近提出的确定HNPCC患者的Bethesda指南，对每个家系发生大肠癌的早发先证者也进行了评估确定28。
利用每个家族中先证者的血样进行遗传学检测。由于难以得到用于微卫星不稳定性分析的石蜡包埋肿瘤标本，加之遗传突变检测技术可靠性提高，我们采用了血样标本DNA序列分析，而不是从分析癌症的微卫星不稳定性入手。
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hMSH2和hMLH1序列分析
使用一种DNA提取工具(Qiagen，Valencia，Calif)从外周血提取DNA。通过多聚酶链反应扩增hMSH2和hMSH1基因的每个外显子和其一些旁侧内含子序列(引物序列及条件由作者提供)。测序反应在一个多探针自动仪上进行(104DT，Packard Instrument Company，Meriden，Conn)。产生的荧光测序产物用半自动序列仪进行分析(Model 377，PerkinsElmer Applied Biosystems Division，Foster City，Calif)。
每个先证者的测序结果均首先进行致病突变分析。家族中其他患癌症或腺瘤息肉的成员，其血样也进行同样分析。一个等位基因至少5%的序列改变，考虑为正常变异(多态性)且不作报道。对于其他所有改变，则评估其突变是否为癌症易感的原因。序列变化如果产生终止子、移码或保守剪切序列的改变则归类为蛋白截断突变，因此是有害的。根据以下标准和可以利用的资料，确定错义突变导致氨基酸替换的潜在致病性30：(1)评估这种改变是否改变种间保守氨基酸的进化和性质；(2)估算普通人群这种改变的频率；(3)在家系中分离出携带突变的癌症个体(例如：癌症家族成员表现这种改变而无癌症成员不表现这种改变)；(4)改变影响基因功能的结论性证据。
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然后，根据每个家庭的遗传学检测结果，评估其潜在作用，并将其作为向先证者和其他家族成员提出临床措施的依据。结果分为两类，肯定性的和非结论性的。如果先证者发现明显的致病突变，那么检测结果则被认为是肯定性的；如果先证者未发现序列改变，或者根据评估标准，错义突变为非致病性的，结果就被认为是非结论性的。
表2 在70个家族队列发现的有害突变* 先证者
编号
家族类别
基因
外显子或
内含子
核苷酸
, 百拇医药
突变
氨基酸
改变
出处，年
预测的结果
DF1751
Amsterdam
(1,2,3,4,7)
hMLH1
7
IVS7-2A→G
, 百拇医药 NA
Luce et al21，1995
剪切位点丢失
DF2842
Amsterdam
(1,2,3,4,)
hMLH1
8
c.676C→T
R226X
Moslein et al31，1996
, 百拇医药 蛋白截断
DF168
Amsterdam
(1,2,3,4,7)
hMLH1
8
c.677G→A
R226Q
Wijnen et al17，1996
异常剪切
DF1846
Amsterdam
, http://www.100md.com
(1,3,4,)
hMLH1
12
c.1381A→T
K461X
新发现
蛋白截断
DF2722
Amsterdam
(1,3,4,)
hMLH1
16
c.1810A→T
, 百拇医药
K604X
新发现
蛋白截断
DF336
Amsterdam
(1,3,4)
hMLH1
16
c.1852-1854
delAAG
K618del
Liu et al12 ，1996; Hamilton at al15， 1995; Wijnen et al17， 1996; Weber et al32， 1997; Wijnen et al33 ，1997; Moslein et al31， 1996
, 百拇医药
赖氨酸缺失
DF397
Amsterdam
(1,2,3,4)
hMLH1
16
IVS16+1G→A
NA
新发现
剪切位点丢失
DF1448§
Amsterdam
, 百拇医药 (1,3,4)
hMLH1
19
c.2104-2105
del AG
NA
新发现
蛋白截断
DF2913
Amsterdam
(1,3,4)
hMLH1
19
, 百拇医药
c.2198-2199
insAACA
733
Risinger et al34，1996
蛋白截断
DF171
Amsterdam
(1,3,4,)
hMLH1
19
c.2250C→G
Y750X
, 百拇医药
新发现
蛋白截断
DF241
Amsterdam
(1,3)
hMSH2
12
c.1786-1788
delAAT
N596del
Liu et al12 ，1996; Moslein et al31， 1996; Buerstedde et al35， 1995; Borresen et al36， 1995;Mary et al37，1994
, 百拇医药
天冬酰胺缺失
DF1851
修订的
Amsterdam
hMSH2
5
IVS5+3A→T
NA
Liu et al12， 1996; Wijnen et al33， 1997; Moslein et al31，1997; Liu et al38 ，1994; Froggatt et al39 ，1995; Pensotti et al40， 1997
, 百拇医药
外显子5缺失
DF2579
修订的
Amsterdam
hMSH2
4
c.704-705
delAA
235
新发现
蛋白截断
DF268
变异型HNPCC(7)
, 百拇医药
hMSH2
5
IVS5+3A→T
NA
Liu et al12 ，1996; Wijnen et al33， 1997; Moslein et al31， 1996; Liu et al38， 1994; Froggatt et al39， 1995; Pensotti et al40， 1997
外显子5缺失
DF951
变异型
, http://www.100md.com
HNPCC(2,3,4)
hMSH2
4
c.704-705
delAA
235
新发现
蛋白截断
DF1754
变异型HNPCC
(2,3,4)
hMSH2
, http://www.100md.com 8
c.1352-1353
delAG
451
新发现
蛋白截断
DF1251
年轻发病
(2，3，4)
hMSH2
5
IVS5+3A→T
NA
, 百拇医药
Liu et al12， 1996; Wijnen et al38， 1997; Moslein et al31， 1996; Liu et al38， 1994; Froggatt et al39， 1995; Pensotti et al40， 1997
外显子5缺失
DF357
年轻发病(4)
hMLH1
9
IVS9-1G→T
NA
, http://www.100md.com
新发现
异常剪切
*NA：无效；C：密码子
括号内数字代表家族满足的Bethesda 条款根据命名工作组建议的标准命名突变§此个体还发现第二个突变结果
测序结果
总共登记70个家族，其中297例CRC，364例其他癌症。根据测序结果、已发表资料和现存的突变数据库，我们发现18个家族明确携带有害突变。其中8个突变以往未见报道。2个家族发现1个新的有害突变。尽管没有家族史证据表明这2个家族具有亲缘性，但进一步分析揭示其先证者拥有共同的单倍体型。
, 百拇医药
8个家族发现错义突变(表3)。其中4个突变已经报道，并且至少在1篇报道中被认为是致病性的(表3)。我们对已发表的突变以及所有新的突变均进行补充分析以确定其致病性。通常已发表的文章并不阐述错义突变致癌的机制，并且定义致病突变的标准也多具变化。例如，2个突变(hMLH1编码子1517→C，V506A和hMSH2密码子965G→A，G322D)，由于突变的位点使进化保守氨基酸发生错义改变因而被认为是致病性的12,43。同样，hMLH1基因V506A突变在新的功能检测中，使酵母中该基因失去了“显性阴性”功能，而被认为是致病的48。相反，hMSH2 G322D突变在对照人群也有一定发生率，从而降低了这种突变在功能上的意义44-47。
3个不同家族发现携带2个不同的潜在致病突变。先证者DF260带有2个不同的hMLH1错义突变，哪个有致病性并不明确。先证者DF1751同样带有hMLH1蛋白截断突变和hMSH1错义突变，从酶母分析看来后者也是功能丢失突变48。这两个潜在致病突变可能出现在hMLH1基因的相同拷贝中，或者如新近文章所述49，这些个体是复杂的杂合子。先证者DH1448带有一个hMLH1蛋白截断突变和hMSH2 G322D突变，后者由于在对照人群亦有出现因而一些研究者认为它是非致病性的44-47。此例先证者的这个突变，与一个蛋白截断突变相偶连，更加证明G322D是一个多态性现象。
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表3 错义改变的致病性评估* 先证者
编码
家族类别
外显子或
内含子
氨基酸
改变
出处，年
致病性评估
保守
氨基酸
氨基酸性质
改变
, 百拇医药
普通人群
频率
分离
分析
酵母功能
分析
DF5
Amsterdam
(1,2,3,4)
3
T821
新发现
hMLH1
, http://www.100md.com
极性变为
非极性
0/166
等位基因
非结论性
功能丧失
DF232
Amsterdam
(1,3,4)
19
R755S
新发现
, http://www.100md.com
+
带正电变
为中性
0/186
等位基因
不可能
未检测
DF260
Amsterdam
(1,2,3,4)
13
V506A
, 百拇医药
Liu et al12，1996;
+
非极性变
为非极性
0/184
等位基因
不可能
功能丧失
DF260
Amsterdam
(1,2,3,4)
, 百拇医药
16
K618A
Mauillon et al20， 1996; Weber et al32，1997;Wijnen et al33， 1997
-
带正电变为
非极性
1/186
等位基因
不可能
功能丧失
, http://www.100md.com
DF1751
Amsterdam
(1,2,3,4,7)
19
V716M
Kowalski et al42， 1997
+
非极性变为
非极性
1/180等位基因
非结论性
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功能丧失
DF597
Amsterdam
(1,2,3,4)
5
A272V
新发现
hMSH2
非极性变
为极性
0/186
等位基因
, 百拇医药
非结论性
NA§
DF3002
变异型
HNPCC(3)
6
G315V
新发现
+/-‖
非极性变为
非极性
0/172等位
, 百拇医药
基因
不可能
NA§
DF1448
Amsterdam
(1,2,3)
6
G322D
Maliaka et al43， 1996; Liu et al44， 1995; Wu et al45， 1997; Herfarth et al46， 1997; Froggatt et al47， 1996
, http://www.100md.com
+
非极性变为
带负电
0%-3%△
非结论性
NA§
DF1370
年轻发病
6
G322D
Maliaks et al43， 1996; Liu et al44， 1995; Wu et al45， 1997; Herfarth et al46， 1997; Froggatt et al47， 1996
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+
非极性变为
带负电
0%-3%△
非结论性
NA§
* 括号内数字代表家族满足的Bethesda 条款，根据命名工作组建议的标准命名突变41。黑体代表新突变，加号代表保守氨基酸，减号代表非保守氨基酸；HNPCC，遗传性非息肉性大肠癌
一些受影响的家族成员携带同样的突变，但每个家族只有3个或更少的这样的成员；因此，无法得到有统计学意义的结果为致病性下一个肯定的结论其他所有受影响的家族成员死亡或无法与家族其他成员联系, http://www.100md.com
§ 没有进行hMSH2的功能分析
‖ 在小鼠中保守，酵母中不保守
△ 根据各种报道44，46，47表4 HNPCC中hMSH2和hMLH1基因遗传学检测结果的临床解释 标准
家族数
肯定结果，数目(%)
(非肯定结果，数目(%))/(无突变 非结论性)
总队列
70
18(25.7)
46(65.7)
, 百拇医药
6(8.6)
Amsterdam标准
28
11(39.3)
13(46.4)
4(14.3)
修订的Amsterdam标准
11
2(18.2)
9(81.8)
0(0)
变异型HNPCC
, 百拇医药
19
3(15.8)
15(78.9)
1(5.3)
年轻发病(<40岁)
12
2(16.7)
9(75.0)
1(8.3)
Bethesda(B1-7)
56
17(30.4)
, http://www.100md.com
33(58.9)
6(10.7)
为临床咨询解释遗传学结果
按临床标准分类的所有群组，hMSH2和hMLH1突变分析的临床解释结果见表4。其中，25.7%(18/70)检测结果表明有致病突变，可以用来制定患者和其亲属的医疗决策。符合Amsterdam标准的家族，39.3%有结论性检测结果。在符合改良Amsterdam标准、年轻发病、变异型HNPCC标准的家族中，肯定性结果的比例分别为：18.2%、16.7%和15.8% 。在至少符合一条Bethesda指南的个体中，肯定性结果的比例是30.4%。
在每个分类和总队列分析中，导致非结论性结果的最主要的原因是未发现hMLH1或hMSH2序列的改变。在符合Amsterdam标准家族中有4个(14.3%)先证者，在一个变异性家族中有一个年轻先证者和一个成员发现仅携带一个错义突变。根据表3总结的数据，在先证者DF260和DF5发现的hMLH1突变以及在先证者DF507发现的hMSH2 突变很可能是致病性的。由于缺乏足够的信息，很难为先证者DF232发现的hMLH1 R7555突变以及先证者DF3002发现的hMSH2 G315V下一个结论。在先证者DF1370发现的错义突变(G322D)极可能是多态性。在先证者DF1448，对这种突变的影响也可作出相同的结论。
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尽管进行了补充分析，但是没有一个突变完全符合致病性的标准。我们的一些病例应用了近来发展的hMSH1基因酵母功能分析法，但是由于该法在人类实验研究缺乏依据，因此这种检测作为临床咨询的基础尚不成熟。因此，尽管有几种错义突变可能是致病性的，但是确定致病性资料的可信程度还不足以建议对这些家系未携带突变的个体放弃临床监控。
评论
如今对于许多遗传综合征，癌症易感性遗传检测，已有可能为患者和保健人员提供有价值的信息。然而与其他任何诊断检测相同，遗传学检测的临床应用亦取决于其提供明确结果(阳性或阴性)的能力。取得受检者知情同意的责任，提供检测前和检测后咨询以及解释遗传学检测结果，这些都依赖于组织检测的保健人员50。我们的研究展示了获得满意临床检测面临的优势和挑战。
首先，对那些测序分析具有肯定结果的HNPCC家族成员，遗传学检测是有临床价值的。在这些家族，当发现一个致病突变时，进一步的观察和预防手术可局限于那些携带突变的个体。不带突变的家族成员可以进行一般的普查。在一系列HNPCC和HNPCC样家族中，包括本研究中的家族，有关成员 hMSH2和hMLH1基因致病胚系突变的频率在15%～60%之间12，13，17，19，22，31-33，51，符合较严格HNPCC标准的家族突变发生率更高。
, 百拇医药
其次，目前的序列分析并不能给许多家族提供明确的结果。在符合HNPCC临床标准的个人和家族，如果hMSH2和hMLH1序列分析没有发现明确的致病突变，就不需要改变高危家族成员的临床决策。一些已知基因的突变采用现有检测方法并不能查到，也许在家族中还有其他目前未知的基因改变52。错误地解释遗传学结果可造成严重后果，因为假阴性结果有可能导致人们放松对高危个体的医疗监控。对遗传学检测结果进行解释的难度已有文献报道。甚至对于出现临床综合征的患者，医生也会错误地把非结论性的遗传学结果解释为阴性，这样的情况占31.6%53。
第三，并非所有检测到的相关基因序列改变均为一个家族癌症易感的病因。只有在有充分证据显示序列改变可导致基因功能改变的情况下，一个突变才可被认为是癌症易感的原因。不同的研究人员把相同突变确定为致病性或非致病性的事实表明，序列分析结果的解释并不简单。确定一个序列改变是否有意义通常需要与家族成员不断接触，需要他们的同意和参与；不但要进行多步骤实验分析还要对已发表的结果的可信度进行综合评估。
, 百拇医药
对于非结论性的hMSH2和hMLH1结果的家族该怎么办呢？最成熟的方法是对那些未发现突变的家族进行癌症微卫星不稳定性分析。在肿瘤中，证实含有序列改变的第二个等位基因的丢失，也可为突变的致病性提供进一步证据。对于那些带有DNA错义突变和明显微卫星不稳定性的个体，应进一步分析突变的功能意义。对于那些有微卫星不稳定性而无hMSH1改变的个体，则应进行其他HNPCC相关基因分析。其他遗传性结肠癌相关基因的发现最终将使更多的患者获得有关其家族癌症易感性的遗传学结果。
总之，错义突变的发生、综合征的遗传异质性以及缺乏有效功能分析手段，使遗传检测结果的解释以及HNPCC家族的咨询面临挑战。在考虑HNPCC的遗传易感检测时，医务工作者和患者应该充分认识到，遗传学分析及其结果的解释可能比许多传统的诊断检测更为复杂。除了金钱、时间和多步骤分析外，这种检测不但需要多个家族成员的参与并且还可能产生非结论性的结果。然而，对于已找到致病突变的家族，这种检测则有明显的临床价值。在这种情况下，遗传学检测对于HNPCC和HNPCC样家族是一个重要的选择。
姜劲迈 译 柯 杨 校
JAMA 1999；282：247～253
(参考文献从略), 百拇医药