来氟米特在离体大鼠皮肤匀浆中的代谢
作者：朱全刚 胡晋红 孙华君 苏永庆
单位：
关键词：来氟米特；皮肤代谢；色谱法，高效液相
第二军医大学学报000423 【摘要】目的：研究来氟米特在新生SD大鼠皮肤匀浆中的代谢作用，为来氟米特经皮给药制剂的研究提供实验依据。方法：取新生SD大鼠腹部皮肤于生理盐水中匀浆，制备高、中、低3组浓度来氟米特的皮肤匀浆液，32℃保温，适时取样，以HPLC法测定来氟米特和其活性代谢物A77 1726的浓度。结果：除对照组(不含皮肤匀浆)中来氟米特浓度保持不变外，其他各组中来氟米特浓度均随保温时间的延长而降低，活性代谢物A77 1726的浓度随保温时间的延长而增加。结论：来氟米特在新生SD大鼠皮肤匀浆上清中具有较明显的代谢作用。
【中图分类号】R 976 【文献标识码】A
, http://www.100md.com
【文章编号】0258-879X(2000)04-0378-03
Study on metabolism of leflunomide in excised rat skin
ZHU Quan-Gang,HU Jin-Hong,SUN Hua-Jun,SU Yong-Qing
(Department of Pharmacy,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
【ABSTRACT】Objective:To study the skin metabolism of leflunomide in neonatal SD rat skin homogenate.Methods:Neonatal SD rat abdominal skin was homogenized in normal saline,and 3 different concentrations of leflunomide was added into the skin homogenate solution.These samples were incubated at 32℃,the concentration was measured by HPLC.Results:The concentration of leflunomide declined and the concentration of active metabolite A77 1726 rose in the skin homogenate solution as a prolonging of time,while no appreciable change in the drug concentration in the normal saline was observed.Conclusion:The effect of skin metabolism of leflunomide in neonatal SD rat skin is obvious.
, 百拇医药
【KEY WORDS】leflunomide；skin metabolism；chromatography,high performance liquid
来氟米特(leflunomide)是1998年在美国首次上市的一种治疗活动性类风湿性关节炎的新药，不良反应以恶心、呕吐、腹痛、腹泻、胃炎及胃肠炎等胃肠道症状和肝功能损害最为常见[1]。但来氟米特是一种前体药物，在人及动物体内转化成活性开环代谢物A77 1726[图见本刊1999;20(4):209]。为提高来氟米特在炎性关节局部的药物浓度、减少全身用药引起的不良反应，探讨其经皮给药的可行性具有重要意义。皮肤，尤其是表皮内的酶系屏障，作为药物透皮转运的一个重要制约因素已引起人们的重视[2]。本文报道来氟米特在新生SD大鼠皮肤内的代谢作用，为该药经皮给药制剂的研究提供实验依据。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 仪器和试药 高效液相色谱仪，包括LC-10ADVP泵、SPD-10AVP检测器、C-R6A积分仪(日本岛津公司)；UV-2100型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；CS501型超级恒温器(重庆实验设备厂)；6511型电动搅拌机(上海标本模型厂)；80-2型离心沉淀器(上海手术器械厂)；玻璃匀浆器(上海玻璃仪器厂)。联苯酚(Sigma 公司)；生理盐水(本院制剂室)；来氟米特和A77 1726(药物合成室提供)；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；pH 3.6醋酸盐缓冲液：取40 ml醋酸，加10.2 g醋酸钠，加水至1 000 ml，溶解混合均匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤。新生SD大鼠，体质量(6±1) g，3～4 d龄(第二军医大学实验动物中心)。
1.2 皮肤匀浆的制备 取新生SD大鼠，剥取腹部皮肤，剔除皮下组织和脂肪，以生理盐水漂洗干净，称量，加适量生理盐水匀浆，制成8%的皮肤匀浆，离心15 min(3 000×g)，分离上清液，备用。
1.3 皮肤代谢实验 分别取皮肤匀浆上清液5 ml、链霉素1 mg及来氟米特适量，加生理盐水至10 ml，配成初浓度依次约为10，7，4 μg/ml来氟米特的皮肤匀浆液；以生理盐水代替皮肤匀浆上清液，配制初浓度约为7 μg/ml来氟米特的对照液；并配制不含来氟米特的空白皮肤匀浆液。所有样品均置于32℃的恒温水浴中保温，定时取样测定。
, 百拇医药
1.4 来氟米特的含量测定
1.4.1 色谱条件 色谱柱为Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×150 mm,10 μm,大连依利特科学仪器有限公司)，流动相为乙腈∶醋酸盐缓冲液(50∶50)，流速为1.4 ml/min，检测波长275 nm，灵敏度0.01 AUFS，联苯酚为内标，进样量20 μl。色谱图见图1，2。
图 1 空白皮肤匀浆液的HPLC图
Fig 1 HPLC of a blank skin homogenate solution
图 2 来氟米特的皮肤匀浆液HPLC图
, 百拇医药
Fig 2 HPLC of a skin homogenate
solution of leflunomide
A:A77 1726(4.15 min)；B:p-phenylphenol
(8.96 min)；C:Leflunomide (12.42 min)
1.4.2 标准曲线的制作 精密称取干燥恒重来氟米特、A77 1726及联苯酚适量，加甲醇超声溶解，稀释成质量浓度依次为0.736 0，0.452 0，0.030 8 mg/ml的标准储备液，-20℃冰箱贮存。精密量取来氟米特、A77 1726标准储备液0.005，0.010， 0.025， 0.050， 0.100， 0.200 ml至10 ml量瓶中，加入联苯酚储备液0.2 ml、链霉素0.25 mg和8%皮肤匀浆上清1.25 ml，用甲醇稀释成含来氟米特0.368～14.720 μg/ml和A77 17260.226～9.040 μg/ml的系列标准液，离心15 min(1×104×g)，取上清液进样。每一标准液进样3次，取平均值。以来氟米特和A77 1726的质量浓度(c)为纵坐标，相应的峰面积与内标的峰面积比(R)为横坐标，进行线性回归。来氟米特的标准曲线为c= 0.148 2+0.970 2 R (r=0.999 7)， A77 1726的标准曲线方程为c=-0.067 9+0.987 2 R (r=0.999 0)。
, 百拇医药
1.4.3 回收率和重现性考察 按标准液配制方法制备样品，进行加样回收率实验，结果表明来氟米特及A77 1726的平均加样回收率分别为100.31%(RSD为0.76%，n=3)，99.69%(RSD为0.95%，n=3)。为了保证选定的色谱条件下定量分析的精密度，分别考察了来氟米特，A77 1726的保留时间重现性和样品内标峰面积比的重现性。6次重复进样，来氟米特，A77 1726保留时间的RSD分别为0.21%,0.32%；峰面积比的日内RSD分别为1.35%，0.91%，日间RSD分别为3.31%，2.69%。
1.4.4 样品的含量测定 精取皮肤代谢实验的样品溶液0.49 ml，加内标联苯酚储备液0.02 ml，用甲醇稀释至1 ml，终止代谢分解反应，离心15 min(1×104×g)，取上清液进样测定。
2 结 果
实验得到不同时间皮肤匀浆液中来氟米特和其活性代谢物A77 1726的质量浓度(表1，2),分别以它们的质量浓度c(μg/ml)与时间t(h)进行回归处理。回归方程依次为低浓度溶液组：来氟米特 c=3.761 4-0.031 1 t (r=-0.957 5)，A77 1726 c=-0.045 2+0.020 2 t (r= 0.999 8)；中浓度溶液组：来氟米特c= 6.900 7-0.039 2 t (r=-0.993 4)，A77 1726 c=-0.022 8+0.031 7 t (r=0.999 9)；高浓度溶液组：来氟米特c=10.324 5-0.068 4 t (r=-0.993 5)，A77 1726 c=-0.033 9+0.043 3 t (r= 0.999 2)。 空白皮肤匀浆液的HPLC图谱在3 min后没有色谱峰，皮肤蛋白等杂质不干扰来氟米特和活性代谢物A77 1726的测定。在对照液中，来氟米特的浓度没有变化(RSD为1.06%)。在来氟米特高、中、低3种不同浓度的皮肤匀浆液中，来氟米特存在分解现象，相当于零级速度过程，来氟米特分解速率常数依次为0.031 1， 0.039 2， 0.068 4 h-1，而活性代谢物A77 1726的生成速率常数分别为0.020 2，0.031 7，0.043 3 h-1。结果表明，来氟米特的分解是由皮肤匀浆的加入所致，即来氟米特在皮肤中存在代谢分解现象。
, 百拇医药
表1 不同时间来氟米特的浓度
Tab 1 Concentrations of leflunomide at different time
(n=3,
±s,ρB/μg.ml-1) Time (t/h)
Low
Middle
High
0
3.914±0.229
6.846±0.249
, http://www.100md.com
10.262±0.189
3
3.568±0.129
6.796±0.146
10.137±0.051
6
3.481±0.057
6.687±0.313
9.970±0.171
15
3.292±0.081
6.380±0.129
, 百拇医药
9.374±0.131
20
3.183±0.122
6.117±0.041
8.829±0.171
25
2.917±0.101
5.874±0.436
8.655±0.243
表2 不同时间A77 1726的浓度
Tab 2 Concentrations of A77 1726 at different time
, http://www.100md.com
(n=3,±s,ρB/μg.ml-1) Time (t/h)
Low
Middle
High
0
3
0.015±0.010
0.071±0.002
0.102±0.009
6
, 百拇医药
0.079±0.009
0.170±0.020
0.223±0.003
15
0.254±0.025
0.454±0.010
0.623±0.020
20
0.356±0.019
0.606±0.009
0.806±0.013
25
, 百拇医药
0.464±0.006
0.773±0.064
1.067±0.058
3 讨 论
有关A77 1726的测定方法，国外有采用HPLC方法测定的报道[3]，但条件要求较高，国内未见报道。来氟米特的含量测定方法，作者曾作过报道[4]。而在本实验中，通过流动相组成成分和比例的改变，实现了来氟米特和活性代谢物A77 1726的同时测定，不仅避免了皮肤蛋白等杂质的干扰，而且方法精密、准确，为进一步开展来氟米特经皮给药制剂的研究提供了一种简便、可靠的分析手段。
测定药物在皮肤中代谢速率的模型有皮肤匀浆模型、摄入代谢实验模型及药物转运分析模型等[5]。体外实验中以应用皮肤匀浆模型最为方便，但匀浆操作可使从生理环境中释放出来的酶的活性发生变化，因此必须采用温和而同一的匀浆方法，以使代谢研究结果具有重现性和准确性。全皮匀浆中含有多种细胞的成分及细胞外介质，因此各种酶系的确切来源不是很清楚[2]。本实验结果表明来氟米特在新生SD大鼠皮肤匀浆上清中存在代谢分解现象，其速率方程可能符合米氏(Michaelis-Menten)方程，我们将在以后的实验中进一步采用其他研究皮肤代谢的方法来考察来氟米特在皮肤中代谢的部位和机制，为来氟米特经皮给药制剂的研究提供依据。
, 百拇医药
【参考文献】
[1]Graul A,Castaner J.Leflunomide[J].Drugs Fut,1998,23(8):827-837.
[2]Steinstrasser I,Merkle HP.Dermal metabolism of topically applied drugs:pathways and models reconsidered[J].Pharm Acta Helv,1995,70(1):3-24.
[3]Lucien J,Dias VC,LeGatt DF,et al.Blood distribution and single-dose pharmacokinetics of leflunomide[J].Ther Drug Monit,1995,17(5):454-459.
[4]朱全刚，胡晋红，孙华君.反相高效液相色谱法测定来氟米特[J].中国药学杂志，1999，34(9):617-619.
[5]Bando H,Sahashi M,Takagi T,et al.Analysis of in vitro skin penetration of acyclovir prodrugs based on a diffusion model with a metabolic process[J].Int J Pharm,1996,135(1):91-102.
【收稿日期】1999-11-22
【修回日期】2000-03-05, 百拇医药
单位：
关键词：来氟米特；皮肤代谢；色谱法，高效液相
第二军医大学学报000423 【摘要】目的：研究来氟米特在新生SD大鼠皮肤匀浆中的代谢作用，为来氟米特经皮给药制剂的研究提供实验依据。方法：取新生SD大鼠腹部皮肤于生理盐水中匀浆，制备高、中、低3组浓度来氟米特的皮肤匀浆液，32℃保温，适时取样，以HPLC法测定来氟米特和其活性代谢物A77 1726的浓度。结果：除对照组(不含皮肤匀浆)中来氟米特浓度保持不变外，其他各组中来氟米特浓度均随保温时间的延长而降低，活性代谢物A77 1726的浓度随保温时间的延长而增加。结论：来氟米特在新生SD大鼠皮肤匀浆上清中具有较明显的代谢作用。
【中图分类号】R 976 【文献标识码】A
, http://www.100md.com
【文章编号】0258-879X(2000)04-0378-03
Study on metabolism of leflunomide in excised rat skin
ZHU Quan-Gang,HU Jin-Hong,SUN Hua-Jun,SU Yong-Qing
(Department of Pharmacy,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
【ABSTRACT】Objective:To study the skin metabolism of leflunomide in neonatal SD rat skin homogenate.Methods:Neonatal SD rat abdominal skin was homogenized in normal saline,and 3 different concentrations of leflunomide was added into the skin homogenate solution.These samples were incubated at 32℃,the concentration was measured by HPLC.Results:The concentration of leflunomide declined and the concentration of active metabolite A77 1726 rose in the skin homogenate solution as a prolonging of time,while no appreciable change in the drug concentration in the normal saline was observed.Conclusion:The effect of skin metabolism of leflunomide in neonatal SD rat skin is obvious.
, 百拇医药
【KEY WORDS】leflunomide；skin metabolism；chromatography,high performance liquid
来氟米特(leflunomide)是1998年在美国首次上市的一种治疗活动性类风湿性关节炎的新药，不良反应以恶心、呕吐、腹痛、腹泻、胃炎及胃肠炎等胃肠道症状和肝功能损害最为常见[1]。但来氟米特是一种前体药物，在人及动物体内转化成活性开环代谢物A77 1726[图见本刊1999;20(4):209]。为提高来氟米特在炎性关节局部的药物浓度、减少全身用药引起的不良反应，探讨其经皮给药的可行性具有重要意义。皮肤，尤其是表皮内的酶系屏障，作为药物透皮转运的一个重要制约因素已引起人们的重视[2]。本文报道来氟米特在新生SD大鼠皮肤内的代谢作用，为该药经皮给药制剂的研究提供实验依据。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 仪器和试药 高效液相色谱仪，包括LC-10ADVP泵、SPD-10AVP检测器、C-R6A积分仪(日本岛津公司)；UV-2100型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；CS501型超级恒温器(重庆实验设备厂)；6511型电动搅拌机(上海标本模型厂)；80-2型离心沉淀器(上海手术器械厂)；玻璃匀浆器(上海玻璃仪器厂)。联苯酚(Sigma 公司)；生理盐水(本院制剂室)；来氟米特和A77 1726(药物合成室提供)；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；pH 3.6醋酸盐缓冲液：取40 ml醋酸，加10.2 g醋酸钠，加水至1 000 ml，溶解混合均匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤。新生SD大鼠，体质量(6±1) g，3～4 d龄(第二军医大学实验动物中心)。
1.2 皮肤匀浆的制备 取新生SD大鼠，剥取腹部皮肤，剔除皮下组织和脂肪，以生理盐水漂洗干净，称量，加适量生理盐水匀浆，制成8%的皮肤匀浆，离心15 min(3 000×g)，分离上清液，备用。
1.3 皮肤代谢实验 分别取皮肤匀浆上清液5 ml、链霉素1 mg及来氟米特适量，加生理盐水至10 ml，配成初浓度依次约为10，7，4 μg/ml来氟米特的皮肤匀浆液；以生理盐水代替皮肤匀浆上清液，配制初浓度约为7 μg/ml来氟米特的对照液；并配制不含来氟米特的空白皮肤匀浆液。所有样品均置于32℃的恒温水浴中保温，定时取样测定。
, 百拇医药
1.4 来氟米特的含量测定
1.4.1 色谱条件 色谱柱为Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×150 mm,10 μm,大连依利特科学仪器有限公司)，流动相为乙腈∶醋酸盐缓冲液(50∶50)，流速为1.4 ml/min，检测波长275 nm，灵敏度0.01 AUFS，联苯酚为内标，进样量20 μl。色谱图见图1，2。
图 1 空白皮肤匀浆液的HPLC图
Fig 1 HPLC of a blank skin homogenate solution
图 2 来氟米特的皮肤匀浆液HPLC图
, 百拇医药
Fig 2 HPLC of a skin homogenate
solution of leflunomide
A:A77 1726(4.15 min)；B:p-phenylphenol
(8.96 min)；C:Leflunomide (12.42 min)
1.4.2 标准曲线的制作 精密称取干燥恒重来氟米特、A77 1726及联苯酚适量，加甲醇超声溶解，稀释成质量浓度依次为0.736 0，0.452 0，0.030 8 mg/ml的标准储备液，-20℃冰箱贮存。精密量取来氟米特、A77 1726标准储备液0.005，0.010， 0.025， 0.050， 0.100， 0.200 ml至10 ml量瓶中，加入联苯酚储备液0.2 ml、链霉素0.25 mg和8%皮肤匀浆上清1.25 ml，用甲醇稀释成含来氟米特0.368～14.720 μg/ml和A77 17260.226～9.040 μg/ml的系列标准液，离心15 min(1×104×g)，取上清液进样。每一标准液进样3次，取平均值。以来氟米特和A77 1726的质量浓度(c)为纵坐标，相应的峰面积与内标的峰面积比(R)为横坐标，进行线性回归。来氟米特的标准曲线为c= 0.148 2+0.970 2 R (r=0.999 7)， A77 1726的标准曲线方程为c=-0.067 9+0.987 2 R (r=0.999 0)。
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1.4.3 回收率和重现性考察 按标准液配制方法制备样品，进行加样回收率实验，结果表明来氟米特及A77 1726的平均加样回收率分别为100.31%(RSD为0.76%，n=3)，99.69%(RSD为0.95%，n=3)。为了保证选定的色谱条件下定量分析的精密度，分别考察了来氟米特，A77 1726的保留时间重现性和样品内标峰面积比的重现性。6次重复进样，来氟米特，A77 1726保留时间的RSD分别为0.21%,0.32%；峰面积比的日内RSD分别为1.35%，0.91%，日间RSD分别为3.31%，2.69%。
1.4.4 样品的含量测定 精取皮肤代谢实验的样品溶液0.49 ml，加内标联苯酚储备液0.02 ml，用甲醇稀释至1 ml，终止代谢分解反应，离心15 min(1×104×g)，取上清液进样测定。
2 结 果
实验得到不同时间皮肤匀浆液中来氟米特和其活性代谢物A77 1726的质量浓度(表1，2),分别以它们的质量浓度c(μg/ml)与时间t(h)进行回归处理。回归方程依次为低浓度溶液组：来氟米特 c=3.761 4-0.031 1 t (r=-0.957 5)，A77 1726 c=-0.045 2+0.020 2 t (r= 0.999 8)；中浓度溶液组：来氟米特c= 6.900 7-0.039 2 t (r=-0.993 4)，A77 1726 c=-0.022 8+0.031 7 t (r=0.999 9)；高浓度溶液组：来氟米特c=10.324 5-0.068 4 t (r=-0.993 5)，A77 1726 c=-0.033 9+0.043 3 t (r= 0.999 2)。 空白皮肤匀浆液的HPLC图谱在3 min后没有色谱峰，皮肤蛋白等杂质不干扰来氟米特和活性代谢物A77 1726的测定。在对照液中，来氟米特的浓度没有变化(RSD为1.06%)。在来氟米特高、中、低3种不同浓度的皮肤匀浆液中，来氟米特存在分解现象，相当于零级速度过程，来氟米特分解速率常数依次为0.031 1， 0.039 2， 0.068 4 h-1，而活性代谢物A77 1726的生成速率常数分别为0.020 2，0.031 7，0.043 3 h-1。结果表明，来氟米特的分解是由皮肤匀浆的加入所致，即来氟米特在皮肤中存在代谢分解现象。
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表1 不同时间来氟米特的浓度
Tab 1 Concentrations of leflunomide at different time
(n=3,
±s,ρB/μg.ml-1) Time (t/h)Low
Middle
High
0
3.914±0.229
6.846±0.249
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10.262±0.189
3
3.568±0.129
6.796±0.146
10.137±0.051
6
3.481±0.057
6.687±0.313
9.970±0.171
15
3.292±0.081
6.380±0.129
, 百拇医药
9.374±0.131
20
3.183±0.122
6.117±0.041
8.829±0.171
25
2.917±0.101
5.874±0.436
8.655±0.243
表2 不同时间A77 1726的浓度
Tab 2 Concentrations of A77 1726 at different time
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(n=3,
±s,ρB/μg.ml-1) Time (t/h)Low
Middle
High
0
3
0.015±0.010
0.071±0.002
0.102±0.009
6
, 百拇医药
0.079±0.009
0.170±0.020
0.223±0.003
15
0.254±0.025
0.454±0.010
0.623±0.020
20
0.356±0.019
0.606±0.009
0.806±0.013
25
, 百拇医药
0.464±0.006
0.773±0.064
1.067±0.058
3 讨 论
有关A77 1726的测定方法，国外有采用HPLC方法测定的报道[3]，但条件要求较高，国内未见报道。来氟米特的含量测定方法，作者曾作过报道[4]。而在本实验中，通过流动相组成成分和比例的改变，实现了来氟米特和活性代谢物A77 1726的同时测定，不仅避免了皮肤蛋白等杂质的干扰，而且方法精密、准确，为进一步开展来氟米特经皮给药制剂的研究提供了一种简便、可靠的分析手段。
测定药物在皮肤中代谢速率的模型有皮肤匀浆模型、摄入代谢实验模型及药物转运分析模型等[5]。体外实验中以应用皮肤匀浆模型最为方便，但匀浆操作可使从生理环境中释放出来的酶的活性发生变化，因此必须采用温和而同一的匀浆方法，以使代谢研究结果具有重现性和准确性。全皮匀浆中含有多种细胞的成分及细胞外介质，因此各种酶系的确切来源不是很清楚[2]。本实验结果表明来氟米特在新生SD大鼠皮肤匀浆上清中存在代谢分解现象，其速率方程可能符合米氏(Michaelis-Menten)方程，我们将在以后的实验中进一步采用其他研究皮肤代谢的方法来考察来氟米特在皮肤中代谢的部位和机制，为来氟米特经皮给药制剂的研究提供依据。
, 百拇医药
【参考文献】
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[2]Steinstrasser I,Merkle HP.Dermal metabolism of topically applied drugs:pathways and models reconsidered[J].Pharm Acta Helv,1995,70(1):3-24.
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【收稿日期】1999-11-22
【修回日期】2000-03-05, 百拇医药