三氧化二砷诱导血管平滑肌细胞凋亡的实验研究
作者：邵建伟 吴宗贵 李莉 张玲珍 仲人前 孔宪涛
单位：
关键词：三氧化二砷；血管平滑肌细胞；凋亡
第二军医大学学报000409 【摘要】目的：探讨三氧化二砷(As2O3)诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡的作用。方法：建立大鼠VSMCs增生模型。用四甲基偶氮唑蓝还原反应(MTT法)、透射电镜、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术等方法观察As2O3诱导VSMCs凋亡的作用。结果：经As2O3作用后VSMCs出现典型的凋亡变化，透射电镜下可见细胞核仁消失，染色质浓缩聚集于核膜下。DNA琼脂糖凝胶电泳出现凋亡特征性梯形电泳条带。流式细胞术检测出现典型的凋亡峰，并随As2O3浓度的增加和作用时间的延长而增高。对照组均不见上述变化。结论：As2O3可有效诱导VSMCs凋亡。
, 百拇医药
【中图分类号】R 543.3 【文献标识码】A
【文章编号】0258-879X(2000)04-0330-04
Experimental study on apoptotic effect of arsenic trioxide on vascular smooth muscle cells
SHAO Jian-Wei，WU Zong-Gui
(Department of Cardiovasology，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003,China)
LI Li，ZHANG Ling-Zhen，ZHONG Ren-Qian，KONG Xian-Tao
, 百拇医药
(Department of Laboratory Diagnosis)
【ABSTRACT】Objective:To study the apoptotic effect of arsenic trioxide (As2O3 ) on vascular smooth muscle cells(VSMCs) in rats.Methods:VSMCs proliferation model of cultured rat thoracic aorta was established.And NBT reduction test,transmission electron microscopy,agarose gel electrophoresis and flow cytometry were applied to observe the apoptotic changes of VSMCs induced by As2O3.Results:Typical apoptotic cellular changes were found after As2O3 treatment,transmission electron microscopy showed nucleole disappeared,chromatin condensated under nucleonic membrane.Agarose gel electrophoresis showed “ladder” strand of DNA,a special phenomenon of cellular apoptosis.And an Ap peak of degraded DNA could be seen by flow cytometry,which heightened in a concentration- and time-dependent manner.The above-mentioned changes were not found in the control group.Conclusion:As2O3 can induce apoptosis of rat proliferated VSMCs effectively.
, http://www.100md.com
【KEY WORDS】arsenic trioxide；vascular smooth muscle cells；apoptosis
经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)已成为公认有效的冠状动脉狭窄治疗手段，但术后较高的再狭窄(RS)发生率严重影响了其远期疗效，因此RS的防治已成为重要的研究课题。目前认为RS的主要病理基础是血管平滑肌细胞(VSMCs)大量增殖，其发生与肿瘤的发生有相似的分子生物学机制，有人甚至将RS比做VSMCs的良性肿瘤[1]。 因此，保持VSMCs增殖和凋亡的平衡就成为防治RS发生的重要途径之一。由于RS治疗给药途径的改进以及诱导凋亡的抗肿瘤药物在RS防治中的作用已被人们所认识，As2O3作为抗肿瘤药物的新军，也以其疗效佳、副作用少而日益受到世界医学界的重视。本实验观察了As2O3诱导体外培养的VSMCs的凋亡作用，旨在为其用于临床治疗RS提供实验依据。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验细胞 参考王道生[2]贴块法行SD大鼠(购自第二军医大学实验动物中心)VSMCs原代培养：大鼠断头处死后，无菌条件下迅速取出胸主动脉，置无菌PBS缓冲液中，冲净凝血块，剥离外膜，刮去内膜，将中膜用PBS缓冲液洗净剪碎，铺满培养瓶底部，翻转培养瓶，使组织块位于培养瓶的上方，加入含20% 胎牛血清(NCS)的DMEM培养液，拧紧瓶口，置于37℃，5%CO2的培养箱中，7 h后轻轻翻转培养瓶，使组织块浸入培养液中，然后静置培养。1周后可见细胞从组织块边缘爬出，2～3周出现致密细胞层，此时可传代。细胞经抗肌动蛋白抗体免疫组化染色，鉴定为平滑肌细胞。实验用细胞均为6～10代传代细胞。
1.2 主要试剂 As2O3为Sigma公司产品；DMEM培养基为Gibco公司产品；小牛血清为Hyclon公司产品；溴化乙啶(PI)为Coulter公司产品；MTT试剂、pGEM-7Zf/HaeⅢ marker为上海华美试剂公司产品。
, 百拇医药
1.3 四甲基偶氮唑蓝还原反应(MTT法) 将单细胞悬液以104个/ml的密度接种在96孔板上，200 μl/孔。次日细胞贴壁后换上0.5% NCS-DMEM培养液37℃,5%CO2培养56 h，使细胞基本同步于G0期，再换用10% NCS-DMEM培养液，分实验组和空白对照组，每组3块板(分别培养24，48，72 h)，加药组As2O3浓度分别为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 μmol/L，设5个复孔，37℃,5%CO2培养箱内培养。实验结束前4 h，每孔加入MTT溶液20 μl，继续培养4 h后，吸弃上清，每孔加入150 μl DMSO，振荡15 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上，以波长570 nm测定各孔光密度(D)值。以时间为横轴，D值为纵轴，绘制细胞生长曲线。
1.4 透射电镜观察 将不同浓度(1.0～5.0 μmol/L)的As2O3与VSMCs共育(37℃,5%CO2)12,24,36,72 h，并设相应时间点的对照组。将每组细胞(106个/ml)洗脱,置于尖底离心管，PBS缓冲液洗2次，1 000 r/min离心5 min，去上清，沿管壁滴入2.5%戊二醛及1%锇酸固定，乙醇脱水，环丙烷置换，环氧树脂浸透，用胶囊法包埋。超薄切片经电子染色后，透射电镜(H-500)观察超微结构并摄片。
, http://www.100md.com
1.5 琼脂糖凝胶电泳 将不同浓度(1.0～5.0 μmol/L)的As2O3与VSMCs共育(37℃,5%CO2) 48 h，设未加药组为阴性对照。将每组细胞(5×106个/ml)洗脱，2 000 r/min离心4 min，去上清，用PBS缓冲液1 ml重悬细胞，并转入Eppendorf管中，同法离心，去上清，用PC缓冲液40 μl重悬细胞，37℃过夜。加入0.25% NP-40溶液3 μl，RNase A溶液3 μl(1 mg/ml)，置37℃，30 min。加入蛋白酶K溶液3 μl，置37℃，30 min。PI染色，点样于2%琼脂糖凝胶；6 V/cm电泳2 h，紫外线(302 nm)透照，观察电泳条带并摄片。
1.6 流式细胞术检测 同上法制备标本，细胞经PBS缓冲液洗2次，离心后弃上清，加1 ml PBS缓冲液悬浮细胞，并加入50 μl含0.1% Triton X-100 的PI(5 μg/ml)染色，避光放置15 min(室温)，上机检测。采用MUTICYCLE软件(Phoenix公司)分析结果，低于G0/G1期DNA含量的细胞为凋亡细胞。
, 百拇医药
1.7 统计学处理 实验数据以
±s表示，采用方差分析。
2 结 果
2.1 MTT 法检测结果 终浓度分别为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 μmol/L的 As2O3与5×103个/ml的VSMCs共育不同时间后，可见细胞生长受到抑制，并且该抑制作用随浓度的升高和时间的延长而明显增强(图1)。当4.0 μmol/L As2O3分别作用24，48，72 h后细胞数逐渐下降，各时间点间有显著性差异(P<0.05)；当作用时间为72 h时，随 As2O3浓度的增加，细胞数明显下降，各浓度组之间有显著性差异(P<0.05)。
, 百拇医药
图 1 不同浓度As2O3对VSMCs的作用
Fig 1 Effect of different concentration of As2O3 on VSMCs
○:Control; △:1.0 μmol/L; ●:2.0 μmol/L;
▲:3.0 μmol/L; ■:4.0 μmol/L; ◆:5.0 μmol/L
2.2 透射电镜 对照组VSMCs细胞周围微绒毛完整，细胞核形态规则，核仁清晰，细胞内可见大量内质网(图2A)。用As2O3处理后细胞微绒毛消失，胞内大量空泡形成，胞质浓缩，核仁消失，核染色质固缩，呈境界分明的新月形、块形，聚集于核膜下，内质网扩张呈泡状与胞浆膜融合(图2B)。并且随As2O3浓度的增加和作用时间的延长凋亡特征更加明显。
, http://www.100md.com
图 2 血管平滑肌细胞超微结构(×4 800)
Fig 2 Electron micrograghs of ultrastructure in VSMCs(×4 800)
A:Control group; B:As2O3 group
2.3 琼脂糖凝胶电泳 不同浓度As2O3作用于VSMCs 24 h后，细胞凋亡在琼脂糖凝胶电泳获得模糊DNA梯形条带，36 h获得较清晰并呈一定间隔的DNA梯形条带，有别于细胞坏死时的模糊的片状条带(无间隔)，并且DNA梯形条带的清晰度随As2O3浓度的增加而更明显(图3)。
, 百拇医药
图 3 血管平滑肌细胞DNA电泳观察
Fig 3 DNA fragmentation of agarose gel
electrophoresis of VSMCs
1:As2O3 4.0 μmol/L ； 2:As2O3 3.0 μmol/L ；3:As2O3 2.0 μmol/L ； 4:As2O3 1.0 μmol/L ；
C:Control； M:pGEM-7Zf/HaeⅢ marker
2.4 流式细胞术检测 流式细胞术检测显示：(1)DNA直方图出现DNA降解的亚G1凋亡峰(AP峰)；(2)随着As2O3 作用时间(图4)或浓度(资料未显示)的增加，AP峰增高。空白对照组不显示AP峰。提示As2O3对凋亡的诱导具有剂量与时间的依赖关系。
, http://www.100md.com
图 4 As2O3诱导VSMCs凋亡时间效应图
Fig 4 Time-dependent effects of As2O3 on VSMCs apoptosis
4.0 μmol/L As2O3 incubated with VSMCs
for 0,2,4,8,12,48 h respectively
3 讨 论
正常情况下细胞的增殖和凋亡始终处于一个动态平衡，是机体维持细胞动力学稳态的一种保护机制。细胞凋亡受阻是人体疾病，包括肿瘤、AS，RS等的重要发病机制[3,4]。在RS形成过程中由于VSMCs大量增殖而凋亡相对不足使细胞大量积聚，平衡被破坏，导致细胞增殖-凋亡失衡，促进VSMCs凋亡可能会延缓或阻止RS的形成[5]。
, 百拇医药
As2O3作为药物已有悠久的历史，但由于其毒性较大，使用谨慎。近年研究发现，砷能抑制活体细胞所含的巯基酶活性，干扰细胞代谢，诱导肿瘤细胞凋亡[6]，它在白血病治疗方面的高疗效低毒副作用已引起世界瞩目；在胃癌、食管癌等方面的研究也取得了进展[7,8]。对于呈瘤样增生的VSMCs，As2O3能否诱导其凋亡呢？为了探讨As2O3在预防RS发生中的潜在作用，本实验首次采用VSMCs作为研究对象，研究As2O3诱导VSMCs凋亡的作用。
细胞发生凋亡的证据主要依赖于凋亡细胞在形态学、细胞学、生化学、分子生物学等方面所表现出的特征性改变。 本实验发现2～5 μmol/L的As2O3与指数增长期VSMCs共育后，细胞增殖受到抑制；同时发现细胞出现凋亡的特征性变化：透射电镜下可见细胞膜表面微绒毛消失，细胞内空泡变性，内质网扩张，染色质浓缩聚集于核膜下；DNA琼脂糖凝胶电泳出现凋亡特征性的梯形电泳条带；流式细胞术仪检测DNA含量直方图上显示在G1期峰前出现亚二倍体凋亡峰。并且PI/FCM检测显示凋亡峰随药物浓度的增高及作用时间的延长而逐渐增高。上述实验结果表明：As2O3可使体外培养的大鼠VSMCs出现细胞凋亡的典型细胞形态学改变和DNA降解，提示其具有诱导VSMCs凋亡的作用并具有浓度和时间依赖性，其具体作用机制有待进一步阐明，但从目前的结果看，砷剂的应用有可能为防治PTCA术后再狭窄的药物研究提供一个新思路。
, 百拇医药
【参考文献】
[1]汤 健，周爱儒.分子心血管病学.见:苏静怡主编，心血管疾病的病理生理和发病机制[M].北京:北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社，1994.359-363.
[2]王道生.动脉平滑肌细胞培养方法.见:徐淑云主编.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社，1991.353-358.
[3]Baxter GD,Lavin MF.Specific protein dephosphorylation in apoptosis induced by ionizing radiation and heat shock in human lymphoid tumor lines[J].J Immunol,1992,148(6):1949-1954.
, 百拇医药 [4]Bennett MR,Evan GI,Schwartz SM.Apoptosis of human vascular smooth muscle cells derived from normal vessels and coronary atherosclerotic plaques[J].J Clin Invest,1995,95(5):2266-2274.
[5]Perlman H,Maillard L,Krasinski K,et al.Evidence for the rapid onset of apoptosis in medial smooth muscle cells after balloon injury[J].Circulation,1997,95(4):981-987.
[6]王树叶，吕 明，张 鹏，等.砷与白血病治疗[J].哈尔滨医科大学学报，1997，31(5)：428-429.
[7]顾琴龙，纪玉宝，陈雪华，等.三氧化二砷对胃癌细胞杀伤作用的初步研究[J].肿瘤，1997，17(6)：461-462.
[8]谭立军，陈新宇，张 岚，等.DMSO和As2O3对人食管癌细胞增殖的抑制作用[J].上海第二医科大学学报，1999，19(1)：5-8.
【收稿日期】1999-11-22
【修回日期】2000-03-03, 百拇医药
单位：
关键词：三氧化二砷；血管平滑肌细胞；凋亡
第二军医大学学报000409 【摘要】目的：探讨三氧化二砷(As2O3)诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡的作用。方法：建立大鼠VSMCs增生模型。用四甲基偶氮唑蓝还原反应(MTT法)、透射电镜、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术等方法观察As2O3诱导VSMCs凋亡的作用。结果：经As2O3作用后VSMCs出现典型的凋亡变化，透射电镜下可见细胞核仁消失，染色质浓缩聚集于核膜下。DNA琼脂糖凝胶电泳出现凋亡特征性梯形电泳条带。流式细胞术检测出现典型的凋亡峰，并随As2O3浓度的增加和作用时间的延长而增高。对照组均不见上述变化。结论：As2O3可有效诱导VSMCs凋亡。
, 百拇医药
【中图分类号】R 543.3 【文献标识码】A
【文章编号】0258-879X(2000)04-0330-04
Experimental study on apoptotic effect of arsenic trioxide on vascular smooth muscle cells
SHAO Jian-Wei，WU Zong-Gui
(Department of Cardiovasology，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003,China)
LI Li，ZHANG Ling-Zhen，ZHONG Ren-Qian，KONG Xian-Tao
, 百拇医药
(Department of Laboratory Diagnosis)
【ABSTRACT】Objective:To study the apoptotic effect of arsenic trioxide (As2O3 ) on vascular smooth muscle cells(VSMCs) in rats.Methods:VSMCs proliferation model of cultured rat thoracic aorta was established.And NBT reduction test,transmission electron microscopy,agarose gel electrophoresis and flow cytometry were applied to observe the apoptotic changes of VSMCs induced by As2O3.Results:Typical apoptotic cellular changes were found after As2O3 treatment,transmission electron microscopy showed nucleole disappeared,chromatin condensated under nucleonic membrane.Agarose gel electrophoresis showed “ladder” strand of DNA,a special phenomenon of cellular apoptosis.And an Ap peak of degraded DNA could be seen by flow cytometry,which heightened in a concentration- and time-dependent manner.The above-mentioned changes were not found in the control group.Conclusion:As2O3 can induce apoptosis of rat proliferated VSMCs effectively.
, http://www.100md.com
【KEY WORDS】arsenic trioxide；vascular smooth muscle cells；apoptosis
经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)已成为公认有效的冠状动脉狭窄治疗手段，但术后较高的再狭窄(RS)发生率严重影响了其远期疗效，因此RS的防治已成为重要的研究课题。目前认为RS的主要病理基础是血管平滑肌细胞(VSMCs)大量增殖，其发生与肿瘤的发生有相似的分子生物学机制，有人甚至将RS比做VSMCs的良性肿瘤[1]。 因此，保持VSMCs增殖和凋亡的平衡就成为防治RS发生的重要途径之一。由于RS治疗给药途径的改进以及诱导凋亡的抗肿瘤药物在RS防治中的作用已被人们所认识，As2O3作为抗肿瘤药物的新军，也以其疗效佳、副作用少而日益受到世界医学界的重视。本实验观察了As2O3诱导体外培养的VSMCs的凋亡作用，旨在为其用于临床治疗RS提供实验依据。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验细胞 参考王道生[2]贴块法行SD大鼠(购自第二军医大学实验动物中心)VSMCs原代培养：大鼠断头处死后，无菌条件下迅速取出胸主动脉，置无菌PBS缓冲液中，冲净凝血块，剥离外膜，刮去内膜，将中膜用PBS缓冲液洗净剪碎，铺满培养瓶底部，翻转培养瓶，使组织块位于培养瓶的上方，加入含20% 胎牛血清(NCS)的DMEM培养液，拧紧瓶口，置于37℃，5%CO2的培养箱中，7 h后轻轻翻转培养瓶，使组织块浸入培养液中，然后静置培养。1周后可见细胞从组织块边缘爬出，2～3周出现致密细胞层，此时可传代。细胞经抗肌动蛋白抗体免疫组化染色，鉴定为平滑肌细胞。实验用细胞均为6～10代传代细胞。
1.2 主要试剂 As2O3为Sigma公司产品；DMEM培养基为Gibco公司产品；小牛血清为Hyclon公司产品；溴化乙啶(PI)为Coulter公司产品；MTT试剂、pGEM-7Zf/HaeⅢ marker为上海华美试剂公司产品。
, 百拇医药
1.3 四甲基偶氮唑蓝还原反应(MTT法) 将单细胞悬液以104个/ml的密度接种在96孔板上，200 μl/孔。次日细胞贴壁后换上0.5% NCS-DMEM培养液37℃,5%CO2培养56 h，使细胞基本同步于G0期，再换用10% NCS-DMEM培养液，分实验组和空白对照组，每组3块板(分别培养24，48，72 h)，加药组As2O3浓度分别为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 μmol/L，设5个复孔，37℃,5%CO2培养箱内培养。实验结束前4 h，每孔加入MTT溶液20 μl，继续培养4 h后，吸弃上清，每孔加入150 μl DMSO，振荡15 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上，以波长570 nm测定各孔光密度(D)值。以时间为横轴，D值为纵轴，绘制细胞生长曲线。
1.4 透射电镜观察 将不同浓度(1.0～5.0 μmol/L)的As2O3与VSMCs共育(37℃,5%CO2)12,24,36,72 h，并设相应时间点的对照组。将每组细胞(106个/ml)洗脱,置于尖底离心管，PBS缓冲液洗2次，1 000 r/min离心5 min，去上清，沿管壁滴入2.5%戊二醛及1%锇酸固定，乙醇脱水，环丙烷置换，环氧树脂浸透，用胶囊法包埋。超薄切片经电子染色后，透射电镜(H-500)观察超微结构并摄片。
, http://www.100md.com
1.5 琼脂糖凝胶电泳 将不同浓度(1.0～5.0 μmol/L)的As2O3与VSMCs共育(37℃,5%CO2) 48 h，设未加药组为阴性对照。将每组细胞(5×106个/ml)洗脱，2 000 r/min离心4 min，去上清，用PBS缓冲液1 ml重悬细胞，并转入Eppendorf管中，同法离心，去上清，用PC缓冲液40 μl重悬细胞，37℃过夜。加入0.25% NP-40溶液3 μl，RNase A溶液3 μl(1 mg/ml)，置37℃，30 min。加入蛋白酶K溶液3 μl，置37℃，30 min。PI染色，点样于2%琼脂糖凝胶；6 V/cm电泳2 h，紫外线(302 nm)透照，观察电泳条带并摄片。
1.6 流式细胞术检测 同上法制备标本，细胞经PBS缓冲液洗2次，离心后弃上清，加1 ml PBS缓冲液悬浮细胞，并加入50 μl含0.1% Triton X-100 的PI(5 μg/ml)染色，避光放置15 min(室温)，上机检测。采用MUTICYCLE软件(Phoenix公司)分析结果，低于G0/G1期DNA含量的细胞为凋亡细胞。
, 百拇医药
1.7 统计学处理 实验数据以
±s表示，采用方差分析。2 结 果
2.1 MTT 法检测结果 终浓度分别为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 μmol/L的 As2O3与5×103个/ml的VSMCs共育不同时间后，可见细胞生长受到抑制，并且该抑制作用随浓度的升高和时间的延长而明显增强(图1)。当4.0 μmol/L As2O3分别作用24，48，72 h后细胞数逐渐下降，各时间点间有显著性差异(P<0.05)；当作用时间为72 h时，随 As2O3浓度的增加，细胞数明显下降，各浓度组之间有显著性差异(P<0.05)。
, 百拇医药
图 1 不同浓度As2O3对VSMCs的作用
Fig 1 Effect of different concentration of As2O3 on VSMCs
○:Control; △:1.0 μmol/L; ●:2.0 μmol/L;
▲:3.0 μmol/L; ■:4.0 μmol/L; ◆:5.0 μmol/L
2.2 透射电镜 对照组VSMCs细胞周围微绒毛完整，细胞核形态规则，核仁清晰，细胞内可见大量内质网(图2A)。用As2O3处理后细胞微绒毛消失，胞内大量空泡形成，胞质浓缩，核仁消失，核染色质固缩，呈境界分明的新月形、块形，聚集于核膜下，内质网扩张呈泡状与胞浆膜融合(图2B)。并且随As2O3浓度的增加和作用时间的延长凋亡特征更加明显。
, http://www.100md.com
图 2 血管平滑肌细胞超微结构(×4 800)
Fig 2 Electron micrograghs of ultrastructure in VSMCs(×4 800)
A:Control group; B:As2O3 group
2.3 琼脂糖凝胶电泳 不同浓度As2O3作用于VSMCs 24 h后，细胞凋亡在琼脂糖凝胶电泳获得模糊DNA梯形条带，36 h获得较清晰并呈一定间隔的DNA梯形条带，有别于细胞坏死时的模糊的片状条带(无间隔)，并且DNA梯形条带的清晰度随As2O3浓度的增加而更明显(图3)。
, 百拇医药
图 3 血管平滑肌细胞DNA电泳观察
Fig 3 DNA fragmentation of agarose gel
electrophoresis of VSMCs
1:As2O3 4.0 μmol/L ； 2:As2O3 3.0 μmol/L ；3:As2O3 2.0 μmol/L ； 4:As2O3 1.0 μmol/L ；
C:Control； M:pGEM-7Zf/HaeⅢ marker
2.4 流式细胞术检测 流式细胞术检测显示：(1)DNA直方图出现DNA降解的亚G1凋亡峰(AP峰)；(2)随着As2O3 作用时间(图4)或浓度(资料未显示)的增加，AP峰增高。空白对照组不显示AP峰。提示As2O3对凋亡的诱导具有剂量与时间的依赖关系。
, http://www.100md.com
图 4 As2O3诱导VSMCs凋亡时间效应图
Fig 4 Time-dependent effects of As2O3 on VSMCs apoptosis
4.0 μmol/L As2O3 incubated with VSMCs
for 0,2,4,8,12,48 h respectively
3 讨 论
正常情况下细胞的增殖和凋亡始终处于一个动态平衡，是机体维持细胞动力学稳态的一种保护机制。细胞凋亡受阻是人体疾病，包括肿瘤、AS，RS等的重要发病机制[3,4]。在RS形成过程中由于VSMCs大量增殖而凋亡相对不足使细胞大量积聚，平衡被破坏，导致细胞增殖-凋亡失衡，促进VSMCs凋亡可能会延缓或阻止RS的形成[5]。
, 百拇医药
As2O3作为药物已有悠久的历史，但由于其毒性较大，使用谨慎。近年研究发现，砷能抑制活体细胞所含的巯基酶活性，干扰细胞代谢，诱导肿瘤细胞凋亡[6]，它在白血病治疗方面的高疗效低毒副作用已引起世界瞩目；在胃癌、食管癌等方面的研究也取得了进展[7,8]。对于呈瘤样增生的VSMCs，As2O3能否诱导其凋亡呢？为了探讨As2O3在预防RS发生中的潜在作用，本实验首次采用VSMCs作为研究对象，研究As2O3诱导VSMCs凋亡的作用。
细胞发生凋亡的证据主要依赖于凋亡细胞在形态学、细胞学、生化学、分子生物学等方面所表现出的特征性改变。 本实验发现2～5 μmol/L的As2O3与指数增长期VSMCs共育后，细胞增殖受到抑制；同时发现细胞出现凋亡的特征性变化：透射电镜下可见细胞膜表面微绒毛消失，细胞内空泡变性，内质网扩张，染色质浓缩聚集于核膜下；DNA琼脂糖凝胶电泳出现凋亡特征性的梯形电泳条带；流式细胞术仪检测DNA含量直方图上显示在G1期峰前出现亚二倍体凋亡峰。并且PI/FCM检测显示凋亡峰随药物浓度的增高及作用时间的延长而逐渐增高。上述实验结果表明：As2O3可使体外培养的大鼠VSMCs出现细胞凋亡的典型细胞形态学改变和DNA降解，提示其具有诱导VSMCs凋亡的作用并具有浓度和时间依赖性，其具体作用机制有待进一步阐明，但从目前的结果看，砷剂的应用有可能为防治PTCA术后再狭窄的药物研究提供一个新思路。
, 百拇医药
【参考文献】
[1]汤 健，周爱儒.分子心血管病学.见:苏静怡主编，心血管疾病的病理生理和发病机制[M].北京:北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社，1994.359-363.
[2]王道生.动脉平滑肌细胞培养方法.见:徐淑云主编.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社，1991.353-358.
[3]Baxter GD,Lavin MF.Specific protein dephosphorylation in apoptosis induced by ionizing radiation and heat shock in human lymphoid tumor lines[J].J Immunol,1992,148(6):1949-1954.
, 百拇医药 [4]Bennett MR,Evan GI,Schwartz SM.Apoptosis of human vascular smooth muscle cells derived from normal vessels and coronary atherosclerotic plaques[J].J Clin Invest,1995,95(5):2266-2274.
[5]Perlman H,Maillard L,Krasinski K,et al.Evidence for the rapid onset of apoptosis in medial smooth muscle cells after balloon injury[J].Circulation,1997,95(4):981-987.
[6]王树叶，吕 明，张 鹏，等.砷与白血病治疗[J].哈尔滨医科大学学报，1997，31(5)：428-429.
[7]顾琴龙，纪玉宝，陈雪华，等.三氧化二砷对胃癌细胞杀伤作用的初步研究[J].肿瘤，1997，17(6)：461-462.
[8]谭立军，陈新宇，张 岚，等.DMSO和As2O3对人食管癌细胞增殖的抑制作用[J].上海第二医科大学学报，1999，19(1)：5-8.
【收稿日期】1999-11-22
【修回日期】2000-03-03, 百拇医药