慢性特发性荨麻疹患者血清组胺释放活性的检测
作者：孙仁山 刘荣卿 叶庆佾 刁庆春 向明明 张黎 黄秀英
单位：孙仁山(第 三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038)；刘荣卿(第 三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038)；叶庆佾(第 三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038)；刁庆春(第 三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038)；向明明(第 三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038)；张黎(第 三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038)；黄秀英(第 三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038)
关键词：慢性特发性荨麻疹；组胺释放活性；自身血清皮肤 试验；嗜碱粒细胞组胺释放试验
第三军医大学学报000414 提 要： 目的 检测慢性特发性荨麻疹患者血中组胺释放 活性。方法 自身血清皮肤试验和嗜碱性粒细胞组胺释放试验。结果 自身血清皮肤试验和嗜碱性粒细胞组胺释放试验的阳性率分别为37.5 %和43.75%。结论 部分慢性特发性荨麻疹患者血中组胺释放活性增 高，提示该类病人具有特殊的肥大细胞和嗜碱性粒细胞激活机制，很可能与自身免疫有关。
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中图法分类号： R758.240.2 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)04-0349-02
Evaluation of histamine-releasing activity in the serum of the patients with ch ronic idiopathic urticaria
SUN Ren-shan, LIU Rong-qing, YIE Qing-yi, DIAO Qing-chun, XIANG Min g-ming, ZHANG Li, HUANG Xiu-ying
(Department of dermatology, Southw est Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
, 百拇医药
Abstract: Objective To evaluate the histamine-releasing ac tivity in the serum of the patients with chronic idiopathic urticaria (CIU). Methods Skin tests with autologous serum and basophil histamine-r elease assay (BHRA)were performed. Results The positive rates of skin tests with autologous serum and BHRA were 37.5% and 43.75 respectively. Conclusion Certain patients with ClU exhibited elevated histami ne-releasing activity in their serum. This implies unusual activating mechanism of their mast cells and basophils. It may be related to autoimmunity.
, 百拇医药
Key words chronic idiopathic urticaria; histamine-r eleasing activity; skin tests with autologous serum; basophil histamine-releas e assay▲
慢性特发性荨麻疹(Chronic idiopathic urticaria,CIU)是一种原因不清楚的慢性荨麻 疹，它的临床表现迁延顽固，常 规抗组胺药物治疗效果不好，临床上常找不到明确的过敏原。近年研究发现，部分CIU患者 体内存在循环性组胺释放因子，病人的病情与血清组胺释放活性密切相关。进一步研究表明 ，该组胺释放活性大部分是由抗高亲和力IgE受体(FcεR1)的自身抗体所致，说明部分CIU的 发生有自身免疫机制的参与[1]。本实验在该方面用自身血清皮肤试验和嗜碱粒细 胞组胺释放试验进行了初步的试验研究。
1 资料与方法
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1.1 慢性荨麻疹病例的选择
我们从1998年1月至1998年6月的门诊病人中选择了32例慢性荨麻疹患者，这些病人均符合如下条件：①皮肤粘膜表面复发性风团，持续时间不超 过24 h；②每周发作不少于2次；③病 程超过2个月；④排除了食物、药物为过敏原；⑤非物理性荨麻疹(寒冷性荨麻疹，胆碱能 性荨麻疹和人工荨麻疹)及荨麻疹性血管炎患者；⑥1周内未使用抗组胺药物、类固醇激素 药物及免疫抑制药物；⑦同意进行自身血清皮肤试验；⑧非异位性体质者。该32例患者平 均年龄为38岁(21～56岁)，男性21例，女性11例。病程从3个月到16年不等。25例对照血清 ，其中20例来自本院输血科的健康自愿者，其余5例既作为对照血清，也作为自身血清皮肤 试验的正常对照者，为研究者本人和科室同事。
1.2 自身血清皮肤试验(Skin test with autologous serum)[2]
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常规方法抽取外周血3 ml，放入无菌试管中30 min后血液凝固，常温下离心，分离血清 ，取50 μl，用皮试针头，注入该被抽血者的前臂屈侧真皮内，其余血清存入-20°C 冰箱备用。同时，用等量生理盐水注入对侧真皮内，作为对照。
1.3 嗜碱粒细胞组胺释放试验(Basophil histamine release assays,BHR A)[3]
1.3.1 嗜碱粒细胞悬液制备 从一健康自愿者肘静脉，采血30 ml，肝素抗凝，等量分配 至3个离心管中后，每管10 ml肝素抗凝血与等体积pH 7.6 Hepes-ACM缓冲液(Hepes 25 mmo l/L,CaCl2 1 mmol/L,NaCl 130 mmol/L,KCl 5mmol/L,MgCl2 1 mmol/L)混和，温和平铺 于10 ml葡聚糖-泛影葡胺分离液(密度为1.085)表面，2 500 r/min离心20 min。吸取中间 层细胞，加入同样缓冲液15 ml洗涤1次，1 500 r/min离心10 min。弃上清留约1 ml，轻轻 混匀备用。
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1.3.2 温育 50 μl待检测血清，或对照血清，或等量Hepes-ACM缓冲液与50 μl细胞 悬液在37°C条件下温育40 min。温育结束后，立即离心6 000 r/min 15 min, 分离上清，进行组胺测定。组胺的自发释放由Hepes-ACM缓冲液与细胞悬液温育后得出。50 μl细胞悬液煮沸后，分离上清，所测定的组胺含量为嗜碱粒细胞的组胺总含量。以上每个 测定均用复管进行。
1.3.3 组胺释放率的测定 用荧光测定法测定组胺含量，按窦淑筠方法略加修改进行 [4]。由于最后的结果用组胺释放率表示，所以不需要用标准浓度的组胺溶液进行组 胺测定及绘制标准曲线。
将待检测管的溶液体积用0.4 mol/L的过氯酸补充至1 ml，加入5 mol/L NaOH 0.125 ml 、NaCl 0.375 g和正丁醇2.5 ml，振荡5 min后，低速离心，吸取上层有机相至另一试管， 加入盐饱和的0.1 mol/L NaOH 1.25 ml，振荡1 min，离心分层。吸取2 ml正丁醇提取液， 加入0.1 mol/L HCl 1.125 ml和正庚烷3.75 ml。同样地振荡1 min后离心分层，吸取0.5 ml 水相，加入0.1 mol/L NaOH 0.1 ml和邻苯二甲醛0.025 ml,准确反应4 min后，加入3 mol/L HCl 0.050 ml终止反应，空白管为先加入3 mol/L HCl后，再加入邻苯二甲醛。
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利用Beckman自动荧光分光光度计于激发波360 nm，荧光波长450 mm，狭缝为10 nm条件 下测定荧光强度读数(T)。组胺的释放用百分比来表示。
Tt:组胺总含量管；Tto:组胺总含量对照管；
Tb:自发释放管；Tbo:自发释放对照管；
Tx:血清测定管；Txo：血清测定对照管。
2 结果
2.1 自身血清皮肤试验
自身血清皮肤试验的阳性标准为风团直径大于对侧5 mm，或者潮红、红斑大于对侧10 m m[2]。32例病人中有12例符合阳性标准，阳性率为37.5%。5例对照者中，无1例出 现红斑或风团。在12例阳性患者中，4例风团和红晕均符合阳性标准，1例只有风团无红晕； 有7例为红斑阳性，而 风团是阴性反应。这些观察表明红晕或潮红，较风团容易出现。有的病人对自身血清可出现 急剧的反应，皮内注射数分钟后，即出现红晕，而后为风团及大片红斑，红晕的直径可扩大 至15 cm，风团直径达6 cm，有轻度的瘙痒，无全身不适。患者皮试后，阳性反应一 般出现在半小时后，90 min至2 h为反应高峰期，风团或红晕在6～8 h后逐渐消退。
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2.2 嗜碱粒细胞组胺释放试验
25例对照血清中，无1例组胺释放率大于10%。嗜碱粒细胞的自发组胺释放率均低于5%。 32例慢性荨麻疹血清中，有14例其组胺释放率大于10%，从12%或86%不等，平均为46%，明显 高于对照组。按10%为组胺释放率的阳性界线，其阳性率为43.75%。
3 讨论
过敏原首次进入机体后，诱导B淋巴细胞分化产生IgE，IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞 表面的高亲和力IgE受体结合；当过敏原再次进入机体时，过敏原使结合于效应细胞膜上的I gE发生交联，激活效应细胞，致肥大细胞及嗜碱粒细胞释放组胺和白三烯等炎性介质，进而 产生了荨麻疹、哮喘等过敏性疾病。慢性荨麻疹常常找不到明确的过敏原，所以它们的肥大 细胞激活机制尚不明确。本实验利用自身血清皮肤试验，从32例慢性特发性荨麻疹患者中， 检测出37.5%的患者呈阳性反应，表明该类病人血清中存在循环性组胺释放因子，该释放因 子不可能是IgE，因为IgE不可能使自身肥大细胞直接致敏脱颗粒，它的性质尚须进一步的实 验研究确定。Niimi等[3]从163例CIU中用自身血清皮肤试验方法获得了60%的阳性 率。 他们的深入研究显示，其中38例携带抗高亲和力IgE受体的自身抗体，9例携带抗IgE的自身 抗体，前者可以直接活化肥大细胞及嗜碱粒细胞，而后者通过IgE起作用。我们在本实验中 进一步应用BHRA法，在体外证实部分特发性荨麻疹患者，BHRA阳性率为43.75%。该结果与国 外学者报道基本一致[5，6]。
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总之，本实验的研究结果表明部分CIU患者血清中可能存在组胺释放因子，通过直接活 化肥大细胞与嗜碱粒细胞，释放炎症介质，产生临床症状，对其活化机制的深入研 究将有助于对慢性特发性荨麻疹的治疗。
基金项目：重庆市科委院士基金资助项目
作者简介：孙仁山(1964-)，男，河南省博爱县人，博士，主治医师 ，主要从事荨麻疹方面的研究，发表论文5篇。电话：(023)68752278
参考文献：
[1] Sabroe R A, Greaves M W. The pathogenesis of chronic idio pa-thic urticaria[J]. Arch Dermatol,1997,133(8):1 003-1 008.
[2] Grattan C E H, Wallington T B, Warin R P, et al. A serolo gical mediator in chronic idiopathic urticaria-a clinical, immunological and histolgi cal evaluation[J]. Br J Dermatol,1986,114(2):583-590.
, 百拇医药
[3] Niimi N, Francis D M, Kermani F, et al. Dermal mast cell activ ation by autoantibodies against the high affinity IgE receptor in chronic urtica raia[J]. J Invest Dermatol,1996,106(5):1 001-1 006.
[4] 窦淑筠，符云峰.血及组织中组织胺的荧光测定法[J].中华医学检验杂志， 1981，4(2)：100-102.
[5] Ferrer M, Kinet J, Kaplan A P, et al. Comparative studies of fu nctional and binding assays for IgG anti-Fc ε R1α(α-subuntit) in chronic ur ticaria[J]. J Allergy Clin Immunol,1998,101(5):672-676.
[6] Tong L, Balakrishnan G, Kochan J P, et al. Assessment of autoim munity in patients with chronic urticaria[J]. J Allergy Clin Immunol,1997,99(4 )：461-465.
收稿日期：1999-08-30；修回日期：1999-12-22, 百拇医药
单位：孙仁山(第 三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038)；刘荣卿(第 三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038)；叶庆佾(第 三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038)；刁庆春(第 三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038)；向明明(第 三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038)；张黎(第 三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038)；黄秀英(第 三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038)
关键词：慢性特发性荨麻疹；组胺释放活性；自身血清皮肤 试验；嗜碱粒细胞组胺释放试验
第三军医大学学报000414 提 要： 目的 检测慢性特发性荨麻疹患者血中组胺释放 活性。方法 自身血清皮肤试验和嗜碱性粒细胞组胺释放试验。结果 自身血清皮肤试验和嗜碱性粒细胞组胺释放试验的阳性率分别为37.5 %和43.75%。结论 部分慢性特发性荨麻疹患者血中组胺释放活性增 高，提示该类病人具有特殊的肥大细胞和嗜碱性粒细胞激活机制，很可能与自身免疫有关。
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中图法分类号： R758.240.2 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)04-0349-02
Evaluation of histamine-releasing activity in the serum of the patients with ch ronic idiopathic urticaria
SUN Ren-shan, LIU Rong-qing, YIE Qing-yi, DIAO Qing-chun, XIANG Min g-ming, ZHANG Li, HUANG Xiu-ying
(Department of dermatology, Southw est Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
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Abstract: Objective To evaluate the histamine-releasing ac tivity in the serum of the patients with chronic idiopathic urticaria (CIU). Methods Skin tests with autologous serum and basophil histamine-r elease assay (BHRA)were performed. Results The positive rates of skin tests with autologous serum and BHRA were 37.5% and 43.75 respectively. Conclusion Certain patients with ClU exhibited elevated histami ne-releasing activity in their serum. This implies unusual activating mechanism of their mast cells and basophils. It may be related to autoimmunity.
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Key words chronic idiopathic urticaria; histamine-r eleasing activity; skin tests with autologous serum; basophil histamine-releas e assay▲
慢性特发性荨麻疹(Chronic idiopathic urticaria,CIU)是一种原因不清楚的慢性荨麻 疹，它的临床表现迁延顽固，常 规抗组胺药物治疗效果不好，临床上常找不到明确的过敏原。近年研究发现，部分CIU患者 体内存在循环性组胺释放因子，病人的病情与血清组胺释放活性密切相关。进一步研究表明 ，该组胺释放活性大部分是由抗高亲和力IgE受体(FcεR1)的自身抗体所致，说明部分CIU的 发生有自身免疫机制的参与[1]。本实验在该方面用自身血清皮肤试验和嗜碱粒细 胞组胺释放试验进行了初步的试验研究。
1 资料与方法
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1.1 慢性荨麻疹病例的选择
我们从1998年1月至1998年6月的门诊病人中选择了32例慢性荨麻疹患者，这些病人均符合如下条件：①皮肤粘膜表面复发性风团，持续时间不超 过24 h；②每周发作不少于2次；③病 程超过2个月；④排除了食物、药物为过敏原；⑤非物理性荨麻疹(寒冷性荨麻疹，胆碱能 性荨麻疹和人工荨麻疹)及荨麻疹性血管炎患者；⑥1周内未使用抗组胺药物、类固醇激素 药物及免疫抑制药物；⑦同意进行自身血清皮肤试验；⑧非异位性体质者。该32例患者平 均年龄为38岁(21～56岁)，男性21例，女性11例。病程从3个月到16年不等。25例对照血清 ，其中20例来自本院输血科的健康自愿者，其余5例既作为对照血清，也作为自身血清皮肤 试验的正常对照者，为研究者本人和科室同事。
1.2 自身血清皮肤试验(Skin test with autologous serum)[2]
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常规方法抽取外周血3 ml，放入无菌试管中30 min后血液凝固，常温下离心，分离血清 ，取50 μl，用皮试针头，注入该被抽血者的前臂屈侧真皮内，其余血清存入-20°C 冰箱备用。同时，用等量生理盐水注入对侧真皮内，作为对照。
1.3 嗜碱粒细胞组胺释放试验(Basophil histamine release assays,BHR A)[3]
1.3.1 嗜碱粒细胞悬液制备 从一健康自愿者肘静脉，采血30 ml，肝素抗凝，等量分配 至3个离心管中后，每管10 ml肝素抗凝血与等体积pH 7.6 Hepes-ACM缓冲液(Hepes 25 mmo l/L,CaCl2 1 mmol/L,NaCl 130 mmol/L,KCl 5mmol/L,MgCl2 1 mmol/L)混和，温和平铺 于10 ml葡聚糖-泛影葡胺分离液(密度为1.085)表面，2 500 r/min离心20 min。吸取中间 层细胞，加入同样缓冲液15 ml洗涤1次，1 500 r/min离心10 min。弃上清留约1 ml，轻轻 混匀备用。
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1.3.2 温育 50 μl待检测血清，或对照血清，或等量Hepes-ACM缓冲液与50 μl细胞 悬液在37°C条件下温育40 min。温育结束后，立即离心6 000 r/min 15 min, 分离上清，进行组胺测定。组胺的自发释放由Hepes-ACM缓冲液与细胞悬液温育后得出。50 μl细胞悬液煮沸后，分离上清，所测定的组胺含量为嗜碱粒细胞的组胺总含量。以上每个 测定均用复管进行。
1.3.3 组胺释放率的测定 用荧光测定法测定组胺含量，按窦淑筠方法略加修改进行 [4]。由于最后的结果用组胺释放率表示，所以不需要用标准浓度的组胺溶液进行组 胺测定及绘制标准曲线。
将待检测管的溶液体积用0.4 mol/L的过氯酸补充至1 ml，加入5 mol/L NaOH 0.125 ml 、NaCl 0.375 g和正丁醇2.5 ml，振荡5 min后，低速离心，吸取上层有机相至另一试管， 加入盐饱和的0.1 mol/L NaOH 1.25 ml，振荡1 min，离心分层。吸取2 ml正丁醇提取液， 加入0.1 mol/L HCl 1.125 ml和正庚烷3.75 ml。同样地振荡1 min后离心分层，吸取0.5 ml 水相，加入0.1 mol/L NaOH 0.1 ml和邻苯二甲醛0.025 ml,准确反应4 min后，加入3 mol/L HCl 0.050 ml终止反应，空白管为先加入3 mol/L HCl后，再加入邻苯二甲醛。
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利用Beckman自动荧光分光光度计于激发波360 nm，荧光波长450 mm，狭缝为10 nm条件 下测定荧光强度读数(T)。组胺的释放用百分比来表示。
Tt:组胺总含量管；Tto:组胺总含量对照管；
Tb:自发释放管；Tbo:自发释放对照管；
Tx:血清测定管；Txo：血清测定对照管。
2 结果
2.1 自身血清皮肤试验
自身血清皮肤试验的阳性标准为风团直径大于对侧5 mm，或者潮红、红斑大于对侧10 m m[2]。32例病人中有12例符合阳性标准，阳性率为37.5%。5例对照者中，无1例出 现红斑或风团。在12例阳性患者中，4例风团和红晕均符合阳性标准，1例只有风团无红晕； 有7例为红斑阳性，而 风团是阴性反应。这些观察表明红晕或潮红，较风团容易出现。有的病人对自身血清可出现 急剧的反应，皮内注射数分钟后，即出现红晕，而后为风团及大片红斑，红晕的直径可扩大 至15 cm，风团直径达6 cm，有轻度的瘙痒，无全身不适。患者皮试后，阳性反应一 般出现在半小时后，90 min至2 h为反应高峰期，风团或红晕在6～8 h后逐渐消退。
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2.2 嗜碱粒细胞组胺释放试验
25例对照血清中，无1例组胺释放率大于10%。嗜碱粒细胞的自发组胺释放率均低于5%。 32例慢性荨麻疹血清中，有14例其组胺释放率大于10%，从12%或86%不等，平均为46%，明显 高于对照组。按10%为组胺释放率的阳性界线，其阳性率为43.75%。
3 讨论
过敏原首次进入机体后，诱导B淋巴细胞分化产生IgE，IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞 表面的高亲和力IgE受体结合；当过敏原再次进入机体时，过敏原使结合于效应细胞膜上的I gE发生交联，激活效应细胞，致肥大细胞及嗜碱粒细胞释放组胺和白三烯等炎性介质，进而 产生了荨麻疹、哮喘等过敏性疾病。慢性荨麻疹常常找不到明确的过敏原，所以它们的肥大 细胞激活机制尚不明确。本实验利用自身血清皮肤试验，从32例慢性特发性荨麻疹患者中， 检测出37.5%的患者呈阳性反应，表明该类病人血清中存在循环性组胺释放因子，该释放因 子不可能是IgE，因为IgE不可能使自身肥大细胞直接致敏脱颗粒，它的性质尚须进一步的实 验研究确定。Niimi等[3]从163例CIU中用自身血清皮肤试验方法获得了60%的阳性 率。 他们的深入研究显示，其中38例携带抗高亲和力IgE受体的自身抗体，9例携带抗IgE的自身 抗体，前者可以直接活化肥大细胞及嗜碱粒细胞，而后者通过IgE起作用。我们在本实验中 进一步应用BHRA法，在体外证实部分特发性荨麻疹患者，BHRA阳性率为43.75%。该结果与国 外学者报道基本一致[5，6]。
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总之，本实验的研究结果表明部分CIU患者血清中可能存在组胺释放因子，通过直接活 化肥大细胞与嗜碱粒细胞，释放炎症介质，产生临床症状，对其活化机制的深入研 究将有助于对慢性特发性荨麻疹的治疗。
基金项目：重庆市科委院士基金资助项目
作者简介：孙仁山(1964-)，男，河南省博爱县人，博士，主治医师 ，主要从事荨麻疹方面的研究，发表论文5篇。电话：(023)68752278
参考文献：
[1] Sabroe R A, Greaves M W. The pathogenesis of chronic idio pa-thic urticaria[J]. Arch Dermatol,1997,133(8):1 003-1 008.
[2] Grattan C E H, Wallington T B, Warin R P, et al. A serolo gical mediator in chronic idiopathic urticaria-a clinical, immunological and histolgi cal evaluation[J]. Br J Dermatol,1986,114(2):583-590.
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[3] Niimi N, Francis D M, Kermani F, et al. Dermal mast cell activ ation by autoantibodies against the high affinity IgE receptor in chronic urtica raia[J]. J Invest Dermatol,1996,106(5):1 001-1 006.
[4] 窦淑筠，符云峰.血及组织中组织胺的荧光测定法[J].中华医学检验杂志， 1981，4(2)：100-102.
[5] Ferrer M, Kinet J, Kaplan A P, et al. Comparative studies of fu nctional and binding assays for IgG anti-Fc ε R1α(α-subuntit) in chronic ur ticaria[J]. J Allergy Clin Immunol,1998,101(5):672-676.
[6] Tong L, Balakrishnan G, Kochan J P, et al. Assessment of autoim munity in patients with chronic urticaria[J]. J Allergy Clin Immunol,1997,99(4 )：461-465.
收稿日期：1999-08-30；修回日期：1999-12-22, 百拇医药