我国肝病病人和健康人群中TTV基因型分析
作者：肖红 张建树 梁蔚芳 骆抗先
单位：肖红(第一军医大学南方医院感染内科，广东 广州510515)；张建树(第一军医大学南方医院感染内科，广东 广州510515)；梁蔚芳(第一军医大学南方医院感染内科，广东 广州510515)；骆抗先(第一军医大学南方医院感染内科，广东 广州510515)
关键词：TT病毒；基因型；序列比较
第一军医大学学报000426 摘要：目的 分析我国肝病患者和健康人群TTV基因型。方法 用巢式PCR扩增我国不同地区不明病因的急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌和自然健康人群TTV DNA片段，并对PCR产物进行克隆，测序分析和同源性比较。结果 武汉WH1、WH2、WH3 3个病人血清中TTV DNA序列与N22同源性分别为97% 、97% 和98% ；广州GZ 1、GZ2、GZ3 3例病人血清中TTV DNA 序列与N22同源性分别为98% 、95% 和95% ；山东SD2、SD3 TTV DNA序列与N22同源性分别为94.6% 和95.5% ；广州GZ4、山东SD1、新疆XJ1病人TTV DNA序列与TXO11同源性分别为98% 、98% 和95% 。结论 根据 Okamoto分类方法，我国TTV属于两个亚型，即基因1型中的a和b亚型。
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中图分类号：R372 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0357-03
Analysis of TTV genotype in hepatitis patients and healthy volunteers in China
XIAO Hong, ZHANG Jian-shu, LIANG Wei-fang, LUO Kang-xian
(Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract: Objective To analysis of TTV genotype/subtype in hepatitis patients and healthy volunteers in China. Methods DNA fragment of TTV was amplified by polymerase chain reaction with nested primers in 8 patients with liver disease and 3 healthy persons in China. The nested PCR products was cloned and sequenced. Results A TTV DNA sequence of 222 bp (primer sequence excluded) was prepared from 11 persons. The homology between N22 and WH1,WH2,WH3,GZ1,GZ2,GZ3,SD2,SD3 respectively was 97% , 97% , 98% , 98% , 95% , 95% ,.94.6% and 95.5% .The homology between TXO11 and GZ4,SD1,XJ1 respectively was 98% ，98% and 95% . Conclusion According to Okamoto’s methods, the 11 TTV clones were classified into genotype/subtype 1a and 1b.
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Key words: TTV; genotype; sequence comparison
自1996年武汉某军校发生不明原因的单项转氨酶增高的病毒性肝炎以来，我们收集了各地不同病情、不同症状肝炎病人及健康人群的血样，研究TTV (Transfusion transmitted virus)在各个地区的基因型及其亚型，对病人和健康人群TTV DNA进行初步分析，以期查明TTV的分布情况。
1 材料与方法
1.1 血清标本来源
广州血清标本(GZ)来自1998年7月～11月本科收检的TTV阳性病人；武汉标本(WH)来自1996年武汉某军校暴发的单项转氨酶增高的病人；山东标本(SD)为本科在山东某自然村普检的健康人血清；新疆标本(XJ)来自新疆某部队医院。所有标本的甲～庚型肝炎血清标志物均为阴性。
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1.2 检测方法
1.2.1 DNA抽提 200 μl血清中加入1×DNA抽提液和蛋白酶K(200 μg/ml)，70 ℃水浴1.5 h，用酚/氯仿/异戊醇抽提和乙醇沉淀后，用20 μl水重悬。
1.2.2 TTV DNA扩增 参考Okamoto等[2]的半巢式PCR方法，采用改进的巢式PCR扩增TTV DNA保守片段。第一轮PCR引物为NG059引物(1714 sense 5’ ACA GAC AGA GGA GAA GGC AAC ATG 3’)和 RD038引物(2302 反义 5’ TGA CTG TGC TAA AGC CTC TA 3’)；第二轮PCR引物 为NG061引物(1915 sense 5’ GGC AAC ATG TTA TGG ATA GAC TGG 3’)和NG063引物(2 185 反义 5’ CTG GCA TTT TAC CAT TTC CAA AGT 3’)。PCR循环条件为变性94 ℃，45 s；退火55 ℃，45 s；延伸72 ℃，50 s；35个循环，72 ℃延伸5 min。第二轮PCR产物进行2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。
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1.3 TTV DNA片段的序列分析和基因型确定
将pGEM-T载体(Promega 公司)和第二轮PCR产物连接、转化、克隆。用质粒抽提试剂盒(Boehriger Mannheim公司)从转化的大肠杆菌XL1-Blue中抽提出质粒。质粒由大连宝生物工程有限公司测序。测序结果用Sequence Version 3.0软件进行分析。
参照Okamoto 等[2]的方法，将TTV DNA 序列分别与N22(基因1a型)、TXO11(基因1b型)、TS003(基因2a型)和NA004(基因2b型)进行进化距离计算及分类。
2 结果
2.1 TTV DNA序列分析
将11个标本的222 bp(引物序列除外)TTV DNA序列与4种基因亚型的DNA序列进行同源性比较(图1)。结果表明武汉WH1、WH2、WH3 3例病人TTV DNA序列与N22同源性分别为97% 、97% 和98% ；广州GZ 1、GZ2、GZ3 3例病人的血清中TTV DNA 序列与N22同源性分别为98% 、95% 和95% ；山东SD2、SD3 病人的血清中 TTV DNA序列与N22同源性为94.6% 和95.5% ； 广州GZ4、山东的SD1和新疆XJ1 的TTV DNA序列与TXO11同源性分别为98% 、98% 和95% 。
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图1 11个血清标本的TTV DNA 保守序列的比较
Fig.1 Sequence comparison of TTV DNA in serum samples from the 11 persons
2.2 进化距离的计算及分类
对
对11个标本的TTV DNA 222 bp序列与已报道的4种基因亚型进行进化距离的计算及比较，结果(图2)表明武汉WH1、WH2、WH3 3例病人，广州GZ 1、GZ2、GZ3 3例病人和山东SD2、SD3 2例健康人TT病毒均属于基因1a型(N22)；GZ4、SD1、XJ1这3例属于基因1b型 (TXO11) 。
, http://www.100md.com 图2 TTV 种系进化树
Fig.2 A phylogenetic tree of TTV
3 讨论
1997年，日本学者Nishizawa 等[1]从1例输血后感染肝炎的病人血清中分离出一种新型人类DNA病毒，并命名为TT病毒。TT病毒是一种无囊膜的单链DNA病毒, 全长为3 739 bp。其序列之间存在很大差异。1998年Okamoto等[2]根据TTV DNA的一段保守序列，对TTV进行了分类，并规定：基因型之间的差异为30%以上，每一种基因型中亚型差异为15%以上。按照这种差异度将TTV DNA序列分成两个基因型，其中每个基因型中又分出两个亚型，即基因1 a型(N22)和基因1 b型(TXO11)，基因2 a型(TS003)和基因2 b型(NA004)。随着对TTV的深入研究，新的基因型和新的亚型不断地被发现，Okamoto原有的分类方法得到了补充 [3、6、8]。
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自TTV被发现后，各国学者在不同病情的肝病患者、血友病患者、健康人群中进行了TTV感染调查，发现在不同地区不同人群中TTV检出率达10%～50%，健康人群中的检出率也为10%[4～6、8、10]。TTV的广泛存在以及传播途径的双重性(血液传播及肠道传播)[4、9]，都说明TTV的特殊性。本研究发现TTV基因1b亚型既存在于肝硬化、肝癌患者，也存在于健康人的血清中，表明肝炎病人其病情的严重性与其基因型可能没有必然联系。武汉某军校暴发流行的单项转氨酶增高的肝炎患者，其血清中TTV基因亚型为1a，但各患者之间也存在0.5%～2.7%的差异，这说明TTV在流行传播中，可能因个体差异而产生变异。至于为什么有的致病，有的不致病？同一基因型既存在于健康人，也存在于病人中？这些问题有待进一步研究。另外，对这种新发现病毒的生物学特性有待更深入的研究，其基因型分类的方法也有待完善。
基金项目：军队九五重点课题(98Z073)
, http://www.100md.com 作者简介：肖 红(1970-)，女，湖南武冈人，1995年毕业于武汉大学，讲师，在读博士研究生，电话：85141944
参考文献：
[1] Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology[J]. Biochem Biophy Res Commun, 1997, 241(1):92-7.
[2] Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatistis of unknown etiology[J]. Hepatol Res, 1998, 10(1):1-16.
, http://www.100md.com
[3] Tanaka H, Okamoto H, Luengrojanakul P, et al. Infection with an unenveloped DNA virus (TTV) associated with posttransfusion non A to G hepatistis in hepatistis patients and healthy blood donors in Thailand[J]. J Med Virol, 1998, 56(3):234-8.
[4] Okamoto H, Akahane Y, Ukita M, et al. Fecal excretion of a nonenveloped DNA virus (TTV) associated with posttransfusion non A to G hepatitis[J]. J Med Virol, 1998, 56(2):128-32.
[5] Charlton M, Adjei P, Poterucha J, et al. TT virus infection in North American blood donors, patients with fulminant hepatic failure,and cryptogenic cirrhosis[J]. Hepatology, 1998, 28(3):839-42.
, 百拇医药
[6] Naoumov NV, Petrova EP, Thomas MG, et al. Presence of a newly described human DNA virus (TTV) inpatients with liver disease[J]. Lancet, 1998, 352(9123):195-7.
[7] Yamamoto T, Kajino K, Ogawa M, et al. Hepatocellular carcinomas infected with the novel TT DNA virus lack viral integration[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1998, 251(1):339-43.
[8] Simnonds P, Davidson F, Lycett C, et al. Detection of a novel DVA virus (TTV) in blood donors and blood products[J]. Lancet, 1998, 352(9123):191-4.
[9] 骆抗先，张 廉，王姗姗，等. 一种新型肠传性病毒性肝炎的临床流行病学和病毒学的初步研究[J]. 中华肝脏病杂, 1998, 6(3):161-4.
[10] 骆抗先，陈志英，梁蔚芳，等. 新型肠传性病毒性肝炎流行点的无症状携带者调查[J]. 中华流行病学杂志, 1998, 19(1):1-3.
收稿日期：1999-09-21, 百拇医药
单位：肖红(第一军医大学南方医院感染内科，广东 广州510515)；张建树(第一军医大学南方医院感染内科，广东 广州510515)；梁蔚芳(第一军医大学南方医院感染内科，广东 广州510515)；骆抗先(第一军医大学南方医院感染内科，广东 广州510515)
关键词：TT病毒；基因型；序列比较
第一军医大学学报000426 摘要：目的 分析我国肝病患者和健康人群TTV基因型。方法 用巢式PCR扩增我国不同地区不明病因的急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌和自然健康人群TTV DNA片段，并对PCR产物进行克隆，测序分析和同源性比较。结果 武汉WH1、WH2、WH3 3个病人血清中TTV DNA序列与N22同源性分别为97% 、97% 和98% ；广州GZ 1、GZ2、GZ3 3例病人血清中TTV DNA 序列与N22同源性分别为98% 、95% 和95% ；山东SD2、SD3 TTV DNA序列与N22同源性分别为94.6% 和95.5% ；广州GZ4、山东SD1、新疆XJ1病人TTV DNA序列与TXO11同源性分别为98% 、98% 和95% 。结论 根据 Okamoto分类方法，我国TTV属于两个亚型，即基因1型中的a和b亚型。
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中图分类号：R372 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0357-03
Analysis of TTV genotype in hepatitis patients and healthy volunteers in China
XIAO Hong, ZHANG Jian-shu, LIANG Wei-fang, LUO Kang-xian
(Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract: Objective To analysis of TTV genotype/subtype in hepatitis patients and healthy volunteers in China. Methods DNA fragment of TTV was amplified by polymerase chain reaction with nested primers in 8 patients with liver disease and 3 healthy persons in China. The nested PCR products was cloned and sequenced. Results A TTV DNA sequence of 222 bp (primer sequence excluded) was prepared from 11 persons. The homology between N22 and WH1,WH2,WH3,GZ1,GZ2,GZ3,SD2,SD3 respectively was 97% , 97% , 98% , 98% , 95% , 95% ,.94.6% and 95.5% .The homology between TXO11 and GZ4,SD1,XJ1 respectively was 98% ，98% and 95% . Conclusion According to Okamoto’s methods, the 11 TTV clones were classified into genotype/subtype 1a and 1b.
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Key words: TTV; genotype; sequence comparison
自1996年武汉某军校发生不明原因的单项转氨酶增高的病毒性肝炎以来，我们收集了各地不同病情、不同症状肝炎病人及健康人群的血样，研究TTV (Transfusion transmitted virus)在各个地区的基因型及其亚型，对病人和健康人群TTV DNA进行初步分析，以期查明TTV的分布情况。
1 材料与方法
1.1 血清标本来源
广州血清标本(GZ)来自1998年7月～11月本科收检的TTV阳性病人；武汉标本(WH)来自1996年武汉某军校暴发的单项转氨酶增高的病人；山东标本(SD)为本科在山东某自然村普检的健康人血清；新疆标本(XJ)来自新疆某部队医院。所有标本的甲～庚型肝炎血清标志物均为阴性。
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1.2 检测方法
1.2.1 DNA抽提 200 μl血清中加入1×DNA抽提液和蛋白酶K(200 μg/ml)，70 ℃水浴1.5 h，用酚/氯仿/异戊醇抽提和乙醇沉淀后，用20 μl水重悬。
1.2.2 TTV DNA扩增 参考Okamoto等[2]的半巢式PCR方法，采用改进的巢式PCR扩增TTV DNA保守片段。第一轮PCR引物为NG059引物(1714 sense 5’ ACA GAC AGA GGA GAA GGC AAC ATG 3’)和 RD038引物(2302 反义 5’ TGA CTG TGC TAA AGC CTC TA 3’)；第二轮PCR引物 为NG061引物(1915 sense 5’ GGC AAC ATG TTA TGG ATA GAC TGG 3’)和NG063引物(2 185 反义 5’ CTG GCA TTT TAC CAT TTC CAA AGT 3’)。PCR循环条件为变性94 ℃，45 s；退火55 ℃，45 s；延伸72 ℃，50 s；35个循环，72 ℃延伸5 min。第二轮PCR产物进行2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。
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1.3 TTV DNA片段的序列分析和基因型确定
将pGEM-T载体(Promega 公司)和第二轮PCR产物连接、转化、克隆。用质粒抽提试剂盒(Boehriger Mannheim公司)从转化的大肠杆菌XL1-Blue中抽提出质粒。质粒由大连宝生物工程有限公司测序。测序结果用Sequence Version 3.0软件进行分析。
参照Okamoto 等[2]的方法，将TTV DNA 序列分别与N22(基因1a型)、TXO11(基因1b型)、TS003(基因2a型)和NA004(基因2b型)进行进化距离计算及分类。
2 结果
2.1 TTV DNA序列分析
将11个标本的222 bp(引物序列除外)TTV DNA序列与4种基因亚型的DNA序列进行同源性比较(图1)。结果表明武汉WH1、WH2、WH3 3例病人TTV DNA序列与N22同源性分别为97% 、97% 和98% ；广州GZ 1、GZ2、GZ3 3例病人的血清中TTV DNA 序列与N22同源性分别为98% 、95% 和95% ；山东SD2、SD3 病人的血清中 TTV DNA序列与N22同源性为94.6% 和95.5% ； 广州GZ4、山东的SD1和新疆XJ1 的TTV DNA序列与TXO11同源性分别为98% 、98% 和95% 。
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图1 11个血清标本的TTV DNA 保守序列的比较
Fig.1 Sequence comparison of TTV DNA in serum samples from the 11 persons
2.2 进化距离的计算及分类
对
对11个标本的TTV DNA 222 bp序列与已报道的4种基因亚型进行进化距离的计算及比较，结果(图2)表明武汉WH1、WH2、WH3 3例病人，广州GZ 1、GZ2、GZ3 3例病人和山东SD2、SD3 2例健康人TT病毒均属于基因1a型(N22)；GZ4、SD1、XJ1这3例属于基因1b型 (TXO11) 。
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Fig.2 A phylogenetic tree of TTV
3 讨论
1997年，日本学者Nishizawa 等[1]从1例输血后感染肝炎的病人血清中分离出一种新型人类DNA病毒，并命名为TT病毒。TT病毒是一种无囊膜的单链DNA病毒, 全长为3 739 bp。其序列之间存在很大差异。1998年Okamoto等[2]根据TTV DNA的一段保守序列，对TTV进行了分类，并规定：基因型之间的差异为30%以上，每一种基因型中亚型差异为15%以上。按照这种差异度将TTV DNA序列分成两个基因型，其中每个基因型中又分出两个亚型，即基因1 a型(N22)和基因1 b型(TXO11)，基因2 a型(TS003)和基因2 b型(NA004)。随着对TTV的深入研究，新的基因型和新的亚型不断地被发现，Okamoto原有的分类方法得到了补充 [3、6、8]。
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自TTV被发现后，各国学者在不同病情的肝病患者、血友病患者、健康人群中进行了TTV感染调查，发现在不同地区不同人群中TTV检出率达10%～50%，健康人群中的检出率也为10%[4～6、8、10]。TTV的广泛存在以及传播途径的双重性(血液传播及肠道传播)[4、9]，都说明TTV的特殊性。本研究发现TTV基因1b亚型既存在于肝硬化、肝癌患者，也存在于健康人的血清中，表明肝炎病人其病情的严重性与其基因型可能没有必然联系。武汉某军校暴发流行的单项转氨酶增高的肝炎患者，其血清中TTV基因亚型为1a，但各患者之间也存在0.5%～2.7%的差异，这说明TTV在流行传播中，可能因个体差异而产生变异。至于为什么有的致病，有的不致病？同一基因型既存在于健康人，也存在于病人中？这些问题有待进一步研究。另外，对这种新发现病毒的生物学特性有待更深入的研究，其基因型分类的方法也有待完善。
基金项目：军队九五重点课题(98Z073)
, http://www.100md.com 作者简介：肖 红(1970-)，女，湖南武冈人，1995年毕业于武汉大学，讲师，在读博士研究生，电话：85141944
参考文献：
[1] Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology[J]. Biochem Biophy Res Commun, 1997, 241(1):92-7.
[2] Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatistis of unknown etiology[J]. Hepatol Res, 1998, 10(1):1-16.
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[3] Tanaka H, Okamoto H, Luengrojanakul P, et al. Infection with an unenveloped DNA virus (TTV) associated with posttransfusion non A to G hepatistis in hepatistis patients and healthy blood donors in Thailand[J]. J Med Virol, 1998, 56(3):234-8.
[4] Okamoto H, Akahane Y, Ukita M, et al. Fecal excretion of a nonenveloped DNA virus (TTV) associated with posttransfusion non A to G hepatitis[J]. J Med Virol, 1998, 56(2):128-32.
[5] Charlton M, Adjei P, Poterucha J, et al. TT virus infection in North American blood donors, patients with fulminant hepatic failure,and cryptogenic cirrhosis[J]. Hepatology, 1998, 28(3):839-42.
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[6] Naoumov NV, Petrova EP, Thomas MG, et al. Presence of a newly described human DNA virus (TTV) inpatients with liver disease[J]. Lancet, 1998, 352(9123):195-7.
[7] Yamamoto T, Kajino K, Ogawa M, et al. Hepatocellular carcinomas infected with the novel TT DNA virus lack viral integration[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1998, 251(1):339-43.
[8] Simnonds P, Davidson F, Lycett C, et al. Detection of a novel DVA virus (TTV) in blood donors and blood products[J]. Lancet, 1998, 352(9123):191-4.
[9] 骆抗先，张 廉，王姗姗，等. 一种新型肠传性病毒性肝炎的临床流行病学和病毒学的初步研究[J]. 中华肝脏病杂, 1998, 6(3):161-4.
[10] 骆抗先，陈志英，梁蔚芳，等. 新型肠传性病毒性肝炎流行点的无症状携带者调查[J]. 中华流行病学杂志, 1998, 19(1):1-3.
收稿日期：1999-09-21, 百拇医药