兔局灶性脑梗死溶栓动物模型的建立
作者：胡顶高 吴宣富 余力
单位：胡顶高(第一军医大学珠江医院 神经内科广东 广州 510282)；吴宣富(第一军医大学珠江医院 神经内科广东 广州 510282)；余力(第一军医大学珠江医院 病理科，广东 广州 510282)
关键词：脑缺血；数字减影；溶栓；动物模型
第一军医大学学报000406 摘要：目的 建立脑梗死溶栓动物模型，并探讨溶栓药物对溶栓动物模型的影响及临床意义。方法 采用兔自体动脉血栓，在数字减影动脉造影术(DSA)下栓塞兔大脑中动脉，造成局灶性脑梗死。经氯化-2,3,5,-三苯基四氯唑染色，作光镜病理形态学观察。结果 给予尿激酶后在DSA血管造影下观察到血管再通，证实该梗死模型能较好地反映脑缺血的病理发展过程。结论 提示该梗死模型可作为溶栓动物模型。此模型的建立为临床筛选各种溶栓药物奠定了动物实验学基础。
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中图分类号：Q461; Q571 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)04-0324-03
Establishment of a rabbit model of focal cerebral infarction and thrombolytic therapy
HU Ding-gao, WU Xuan-fu
(Departments of Neurology Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
YU Li
(Departments ofPathology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)Abstract: Objective To establish a model of focal cerebral infarction in rabbits for thrombolytic therapy and explore the effect and clinic significance of thrombolytic drugs in the model. Methods Focal cerebral infarction was produced by embolizing the artertia cerebri media with arterial emboli by means of digital subtraction angiography. The sections was stained with triphenyltetrazolium chloride. Pathological morphology was observed under light microscope. Results Pathological examination showed that this model could better reflect the process of pathological development of cerebral ischemia and its blood flow could be restored. Conclusion Establishment of the model is successful and may be useful in screening out potent thrombolytic drugs.
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Key words: cerebral ischemia; digital subtraction angiography; thrombolytic therapy; animal model
溶栓治疗超早期急性脑梗死是降低死亡率和致残率的一种可靠方法，但对溶栓的时间窗尚无一致观点。目前溶栓药物众多，其疗效评价尚无动物实验学基础。国内众多脑梗死模型主要用于研究缺血和再灌注对神经元细胞损害的影响，国内尚无人建立脑梗死溶栓动物模型[1～3]。我们对Benes等[4～6]的动物实验方法进行改良，建立了兔大脑中动脉局灶性脑梗死溶栓动物模型。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性新西兰白兔50只，体质量2.5～3.5 kg。分为3组，假手术对照组6只；病理形态学观察组24只；溶栓效果观察组12只。另有8只因麻醉过量或术中大出血死亡而未加分析。
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1.2 仪器设备
菲利蒲PH3000数字减影机(日本)。
1.3 实验方法
1.3.1 制备自体动脉栓子 以3% 戊巴比妥1 ml/kg.b.w.麻醉动物。兔头固定于动物实验台上，在双侧耳动脉用一支改良腰穿针穿刺插管。通过腰穿针擦伤管腔内2 cm长的动脉内膜。穿刺针取出后，在血管损伤段近心端松松地结扎动脉，减少血流，增加栓子形成。兔从麻醉中醒来后仍放回笼中。内皮损伤后24～48 h内继续实验，麻醉同前。将损伤段的耳动脉切下，在解剖显微镜下纵行切开，从血管壁上分离血栓。将分离出的血栓放在10 mmol/L的磷酸盐缓冲液中，用微型手术刀将其切成0.5 mm×0.7 mm片段的栓子。分别将栓子放在充满缓冲液的注射器内以备栓塞用。
1.3.2 自体动脉栓子栓塞兔脑循环 采用显微外科技术暴露和分离左侧颈总、颈内、颈外动脉。分别结扎血管肌支和颈外动脉起始段。从接近颈总动脉分叉处穿刺，将一个3F聚四氟乙烯导管插入到颈内动脉起始部，并用5-0号丝线结扎固定。在颈总动脉近心端，用微血管动脉瘤夹暂时阻断血流，以防止穿刺部位出血。动脉栓子通过导管注入颈内动脉，并通过数字减影动脉造影术(DSA)证明兔左侧大脑中动脉栓塞成功。将穿刺针拔出，穿刺口用ZT医用胶粘合止血，迅速将颈总动脉血管夹移开，以恢复颈总动脉血流。整个手术操作时间约1 h。
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1.3.3 假手术对照组 手术步骤同上。当导管从颈总动脉插入颈内动脉起始部后，注入生理盐水1～2 ml，再通过DSA显示血管是否畅通。拔出穿刺针，穿刺口用ZT医用胶粘合止血，恢复颈总动脉血流。
1.3.4 观察指标
1.3.4.1 形态学观察 (1)氯化-2,3,5,-三苯基四氮唑 (TTC)染色，观察梗死灶范围。兔12只，分别在栓塞后3、6、12、24 h处死，迅速取出大脑，将大脑放在冰盐水中冷却，并切成5个近似0.5 cm厚的冠状切片。检查切片有无出血，再将切片放入2% 的TTC液中染色，置37 ℃温水浴30 min。被染色的切片浸泡在10%的磷酸盐福尔马林液中，一周后检查，以确定梗死灶大小。按下列公式求出每只兔脑梗死面积的百分比：梗死区总面积/梗死区半球总面积×100%。(2) 光镜组织形态学检查。兔12只，分别在栓塞后3、6、12、24 h处死，迅速取出大脑，浸泡在10%的磷酸盐福尔马林液中固定，石蜡包埋，HE染色，光镜观察。
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1.3.4.2 溶栓及梗死血管再通试验 兔12只，分别在栓塞后1、3、6、12 h时动脉内注入尿激酶(2.5万 U/kg.b.w.)，直接观察梗死血管再通情况，并在栓塞后24 h 处死动物，观察不同时间动脉溶栓对梗死灶大小的影响。
2 结果
2.1 临床观察
待兔麻醉苏醒后观察其反应能力和肢体功能。栓塞组可见对侧肢体不同程度的偏瘫，表现为蹦跳无力，后肢外展，肌张力降低，回缩反应减弱。对照组无此体征。本组实验初期，因麻醉过量死亡4只，此类兔不作为观察对象加以分析。
2.2 TTC染色观察
栓塞后3 h，兔脑冠状切面上未见明显的缺血苍白区；6 h时可见栓塞侧大脑中动脉分布区梗死灶出现；12～24 h时梗死灶明显扩大。3、6、12、24 h时梗死灶面积百分比分别为0、(20±10)%、(43±13)%和(45±11)%。但两个时间点梗死灶大小无显著差异。
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2.3 光镜观察
对照组脑神经组织HE染色，光镜检查均正常。观察组栓塞后3 h，缺血侧脑组织灰质、白质形态基本正常，个别神经细胞肿胀，尼氏小体溶解、消失，胞浆呈淡红色 (图1A)。栓塞后6 h，脑组织水肿，神经细胞周围间隙增宽，细胞肿胀，固缩，并有散在中性白细胞浸润(图1B)。栓塞后12～24 h，兔脑切片可见脑组织水肿加重，神经元变性、坏死更明显，空泡形成，并伴有不同程度的小胶质细胞反应性增生，可见嗜神经现象(图1C)。
图1 栓塞后3、6、12 h的脑组织病理图片
Fig.1 Pathological image of the cerebral tissue at 3、6、12 h after embolism
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A: 3 h after embolization, showing the shapes are normal,and the single neurocyte swells (HE×100);
B: 6 h after embolization, showing swollen brain tissue,neurocyte degeneration or necrosis, and leukocyte infiltration (HE×150);
C: 12 h after embolization, showing swollen brain tissue,neurocyte degeneration or severe necrosis (HE×200)
2.4 溶栓及梗死血管再通观察
经DSA证实栓塞兔大脑中动脉后，分别在0.5、3、6、12 h时，采用疗效肯定的国产天普洛欣尿激酶(2.5万 U/kg.b.w.)在DSA下直接进行动脉溶栓，结果发现梗死血管在用药后5 min内均可再通，栓塞后24 h未发生脑实质出血现象。TTC染色发现，30 min进行溶栓的兔脑在栓塞后24 h未见任何大小的苍白区；3～12 h进行溶栓的动物，其梗死灶随着时间的延迟而逐渐扩大。0.5、3、6、12 h梗死灶面积百分比分别为0、(8±5)%、(18±11)%和(44±8)%。
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3 讨论
用于治疗急性脑梗死的药物种类繁多，溶栓剂和抗凝剂是其中的两大类。如何客观评价此类药物的临床效果往往受众多因素的影响，诸如梗死部位、面积、持续时间和患者全身情况等，故建立一个可供溶栓或抗凝的局灶性脑梗死动物模型对评价某种药物的疗效有一定的价值。本实验采用兔自体动脉栓子栓塞一侧大脑中动脉，能造成较稳定的局灶性脑梗死，借助脑DSA，直接观察大脑中动脉栓塞情况和溶栓药物的溶栓效果，为临床客观评价某种溶栓或抗凝药物的疗效提供了一种新的途径。选择兔作为溶栓动物模型有以下考虑：(1)兔脑血管接近人脑血管，进行DSA比较容易完成; (2)在脑DSA下栓塞兔大脑中动脉，可使梗死条件的控制相对一致; (3)兔血液相对较多，可反复抽血，适合动态观察某些生化指标的改变。
兔脑侧支循环非常丰富，颈内动脉栓塞往往不引起任何缺血症状。本组实验开始时曾有2只兔仅栓塞了颈内动脉，兔清醒后蹦跳自如，6 h后TTC染色未出现梗死灶。而栓塞大脑中动脉，兔清醒后即出现不同程度的偏瘫，6 h 后TTC染色可见明显的梗死灶，且随着时间的延长梗死灶明显扩大。光镜检查符合神经细胞缺血性改变。栓塞成功后，在不同时间点重复DSA，仍显示大脑中动脉血管梗死，表明栓子是可靠的。一般认为，自体动脉栓子(白色栓子)比血凝块(红色栓子)更接近人的脑血栓，不易发生栓子自溶现象[6]。在梗死后不同时间点使用尿激酶溶栓5 min 后，均可使梗死血管再通，且梗死后30 min即开始溶栓，不出现任何缺血症状和形态学改变。梗死后12 h开始溶栓的动物，其脑缺血症状与24 h的比较，无显著差异。梗死后3～6 h之间，溶栓愈早，兔脑冠状面梗死区愈小。不同时间点行动脉溶栓的动物，在梗死后24 h均未出现脑实质出血，提示使用尿激酶溶栓发生脑出血的危险性较小。
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致谢 本实验的脑DSA得到放射科导管室蒋霓主管技师、黄凡衡技师大力支持与配合，深表谢意! 法国赛诺菲公司为本实验提供部分赞助经费，广东天普生物化学制药有限公司免费提供尿激酶产品，在此一并表示诚挚感谢。
作者简介：胡顶高(1962-)，男，湖南南县人，解放军458医院神经内科主治医生，现为第一军医大学在职研究生，电话：87377881-2206
参考文献：
[1] 李盈盈，王子灿，李麟仙. 家兔急性不完全性脑缺血模型和特点的实验研究[J]. 中华神经精神科杂志, 1987, 20(2):101-4.
[2] 赵卫国，张天锡. 兔MCAo型局灶脑缺血模型的建立[J]. 中国神经精神疾病杂志, 1990, 16(2):143-5.
[3] 杨金升，张如富，赵红全，等. 兔急性全脑缺血模型的建立[J]. 兰州医学院学报, 1995, 21(2):123-5.
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[4] Benes V, Zabramski JM, Boston M, et al. Effect of intra-arterial antifibrinolytic agents on autologous arterial emboli in the cerebral circulation of rabbits[J]. Stroke, 1990, 21(11):1594-9.
[5] Hamilton MG, Lee JS, Cummings PJ, et al. A comparison of intra-arterial and intravenous tissue-type plasminogen activator on autologous arterial emboli in the cerebral circulation of rabbits[J]. Stroke, 1994, 25(3):651-6.
[6] Carter LP, Guthkelch AN, Orozco J, et al. Influence of tissue plasminogen activator and heparin on cerebral ischemia in a rabbit model[J]. Stroke, 1992, 23:883-8.
收稿日期：2000-01-23, 百拇医药
单位：胡顶高(第一军医大学珠江医院 神经内科广东 广州 510282)；吴宣富(第一军医大学珠江医院 神经内科广东 广州 510282)；余力(第一军医大学珠江医院 病理科，广东 广州 510282)
关键词：脑缺血；数字减影；溶栓；动物模型
第一军医大学学报000406 摘要：目的 建立脑梗死溶栓动物模型，并探讨溶栓药物对溶栓动物模型的影响及临床意义。方法 采用兔自体动脉血栓，在数字减影动脉造影术(DSA)下栓塞兔大脑中动脉，造成局灶性脑梗死。经氯化-2,3,5,-三苯基四氯唑染色，作光镜病理形态学观察。结果 给予尿激酶后在DSA血管造影下观察到血管再通，证实该梗死模型能较好地反映脑缺血的病理发展过程。结论 提示该梗死模型可作为溶栓动物模型。此模型的建立为临床筛选各种溶栓药物奠定了动物实验学基础。
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中图分类号：Q461; Q571 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)04-0324-03
Establishment of a rabbit model of focal cerebral infarction and thrombolytic therapy
HU Ding-gao, WU Xuan-fu
(Departments of Neurology Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
YU Li
(Departments ofPathology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)Abstract: Objective To establish a model of focal cerebral infarction in rabbits for thrombolytic therapy and explore the effect and clinic significance of thrombolytic drugs in the model. Methods Focal cerebral infarction was produced by embolizing the artertia cerebri media with arterial emboli by means of digital subtraction angiography. The sections was stained with triphenyltetrazolium chloride. Pathological morphology was observed under light microscope. Results Pathological examination showed that this model could better reflect the process of pathological development of cerebral ischemia and its blood flow could be restored. Conclusion Establishment of the model is successful and may be useful in screening out potent thrombolytic drugs.
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Key words: cerebral ischemia; digital subtraction angiography; thrombolytic therapy; animal model
溶栓治疗超早期急性脑梗死是降低死亡率和致残率的一种可靠方法，但对溶栓的时间窗尚无一致观点。目前溶栓药物众多，其疗效评价尚无动物实验学基础。国内众多脑梗死模型主要用于研究缺血和再灌注对神经元细胞损害的影响，国内尚无人建立脑梗死溶栓动物模型[1～3]。我们对Benes等[4～6]的动物实验方法进行改良，建立了兔大脑中动脉局灶性脑梗死溶栓动物模型。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性新西兰白兔50只，体质量2.5～3.5 kg。分为3组，假手术对照组6只；病理形态学观察组24只；溶栓效果观察组12只。另有8只因麻醉过量或术中大出血死亡而未加分析。
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1.2 仪器设备
菲利蒲PH3000数字减影机(日本)。
1.3 实验方法
1.3.1 制备自体动脉栓子 以3% 戊巴比妥1 ml/kg.b.w.麻醉动物。兔头固定于动物实验台上，在双侧耳动脉用一支改良腰穿针穿刺插管。通过腰穿针擦伤管腔内2 cm长的动脉内膜。穿刺针取出后，在血管损伤段近心端松松地结扎动脉，减少血流，增加栓子形成。兔从麻醉中醒来后仍放回笼中。内皮损伤后24～48 h内继续实验，麻醉同前。将损伤段的耳动脉切下，在解剖显微镜下纵行切开，从血管壁上分离血栓。将分离出的血栓放在10 mmol/L的磷酸盐缓冲液中，用微型手术刀将其切成0.5 mm×0.7 mm片段的栓子。分别将栓子放在充满缓冲液的注射器内以备栓塞用。
1.3.2 自体动脉栓子栓塞兔脑循环 采用显微外科技术暴露和分离左侧颈总、颈内、颈外动脉。分别结扎血管肌支和颈外动脉起始段。从接近颈总动脉分叉处穿刺，将一个3F聚四氟乙烯导管插入到颈内动脉起始部，并用5-0号丝线结扎固定。在颈总动脉近心端，用微血管动脉瘤夹暂时阻断血流，以防止穿刺部位出血。动脉栓子通过导管注入颈内动脉，并通过数字减影动脉造影术(DSA)证明兔左侧大脑中动脉栓塞成功。将穿刺针拔出，穿刺口用ZT医用胶粘合止血，迅速将颈总动脉血管夹移开，以恢复颈总动脉血流。整个手术操作时间约1 h。
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1.3.3 假手术对照组 手术步骤同上。当导管从颈总动脉插入颈内动脉起始部后，注入生理盐水1～2 ml，再通过DSA显示血管是否畅通。拔出穿刺针，穿刺口用ZT医用胶粘合止血，恢复颈总动脉血流。
1.3.4 观察指标
1.3.4.1 形态学观察 (1)氯化-2,3,5,-三苯基四氮唑 (TTC)染色，观察梗死灶范围。兔12只，分别在栓塞后3、6、12、24 h处死，迅速取出大脑，将大脑放在冰盐水中冷却，并切成5个近似0.5 cm厚的冠状切片。检查切片有无出血，再将切片放入2% 的TTC液中染色，置37 ℃温水浴30 min。被染色的切片浸泡在10%的磷酸盐福尔马林液中，一周后检查，以确定梗死灶大小。按下列公式求出每只兔脑梗死面积的百分比：梗死区总面积/梗死区半球总面积×100%。(2) 光镜组织形态学检查。兔12只，分别在栓塞后3、6、12、24 h处死，迅速取出大脑，浸泡在10%的磷酸盐福尔马林液中固定，石蜡包埋，HE染色，光镜观察。
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1.3.4.2 溶栓及梗死血管再通试验 兔12只，分别在栓塞后1、3、6、12 h时动脉内注入尿激酶(2.5万 U/kg.b.w.)，直接观察梗死血管再通情况，并在栓塞后24 h 处死动物，观察不同时间动脉溶栓对梗死灶大小的影响。
2 结果
2.1 临床观察
待兔麻醉苏醒后观察其反应能力和肢体功能。栓塞组可见对侧肢体不同程度的偏瘫，表现为蹦跳无力，后肢外展，肌张力降低，回缩反应减弱。对照组无此体征。本组实验初期，因麻醉过量死亡4只，此类兔不作为观察对象加以分析。
2.2 TTC染色观察
栓塞后3 h，兔脑冠状切面上未见明显的缺血苍白区；6 h时可见栓塞侧大脑中动脉分布区梗死灶出现；12～24 h时梗死灶明显扩大。3、6、12、24 h时梗死灶面积百分比分别为0、(20±10)%、(43±13)%和(45±11)%。但两个时间点梗死灶大小无显著差异。
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2.3 光镜观察
对照组脑神经组织HE染色，光镜检查均正常。观察组栓塞后3 h，缺血侧脑组织灰质、白质形态基本正常，个别神经细胞肿胀，尼氏小体溶解、消失，胞浆呈淡红色 (图1A)。栓塞后6 h，脑组织水肿，神经细胞周围间隙增宽，细胞肿胀，固缩，并有散在中性白细胞浸润(图1B)。栓塞后12～24 h，兔脑切片可见脑组织水肿加重，神经元变性、坏死更明显，空泡形成，并伴有不同程度的小胶质细胞反应性增生，可见嗜神经现象(图1C)。
图1 栓塞后3、6、12 h的脑组织病理图片
Fig.1 Pathological image of the cerebral tissue at 3、6、12 h after embolism
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A: 3 h after embolization, showing the shapes are normal,and the single neurocyte swells (HE×100);
B: 6 h after embolization, showing swollen brain tissue,neurocyte degeneration or necrosis, and leukocyte infiltration (HE×150);
C: 12 h after embolization, showing swollen brain tissue,neurocyte degeneration or severe necrosis (HE×200)
2.4 溶栓及梗死血管再通观察
经DSA证实栓塞兔大脑中动脉后，分别在0.5、3、6、12 h时，采用疗效肯定的国产天普洛欣尿激酶(2.5万 U/kg.b.w.)在DSA下直接进行动脉溶栓，结果发现梗死血管在用药后5 min内均可再通，栓塞后24 h未发生脑实质出血现象。TTC染色发现，30 min进行溶栓的兔脑在栓塞后24 h未见任何大小的苍白区；3～12 h进行溶栓的动物，其梗死灶随着时间的延迟而逐渐扩大。0.5、3、6、12 h梗死灶面积百分比分别为0、(8±5)%、(18±11)%和(44±8)%。
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3 讨论
用于治疗急性脑梗死的药物种类繁多，溶栓剂和抗凝剂是其中的两大类。如何客观评价此类药物的临床效果往往受众多因素的影响，诸如梗死部位、面积、持续时间和患者全身情况等，故建立一个可供溶栓或抗凝的局灶性脑梗死动物模型对评价某种药物的疗效有一定的价值。本实验采用兔自体动脉栓子栓塞一侧大脑中动脉，能造成较稳定的局灶性脑梗死，借助脑DSA，直接观察大脑中动脉栓塞情况和溶栓药物的溶栓效果，为临床客观评价某种溶栓或抗凝药物的疗效提供了一种新的途径。选择兔作为溶栓动物模型有以下考虑：(1)兔脑血管接近人脑血管，进行DSA比较容易完成; (2)在脑DSA下栓塞兔大脑中动脉，可使梗死条件的控制相对一致; (3)兔血液相对较多，可反复抽血，适合动态观察某些生化指标的改变。
兔脑侧支循环非常丰富，颈内动脉栓塞往往不引起任何缺血症状。本组实验开始时曾有2只兔仅栓塞了颈内动脉，兔清醒后蹦跳自如，6 h后TTC染色未出现梗死灶。而栓塞大脑中动脉，兔清醒后即出现不同程度的偏瘫，6 h 后TTC染色可见明显的梗死灶，且随着时间的延长梗死灶明显扩大。光镜检查符合神经细胞缺血性改变。栓塞成功后，在不同时间点重复DSA，仍显示大脑中动脉血管梗死，表明栓子是可靠的。一般认为，自体动脉栓子(白色栓子)比血凝块(红色栓子)更接近人的脑血栓，不易发生栓子自溶现象[6]。在梗死后不同时间点使用尿激酶溶栓5 min 后，均可使梗死血管再通，且梗死后30 min即开始溶栓，不出现任何缺血症状和形态学改变。梗死后12 h开始溶栓的动物，其脑缺血症状与24 h的比较，无显著差异。梗死后3～6 h之间，溶栓愈早，兔脑冠状面梗死区愈小。不同时间点行动脉溶栓的动物，在梗死后24 h均未出现脑实质出血，提示使用尿激酶溶栓发生脑出血的危险性较小。
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致谢 本实验的脑DSA得到放射科导管室蒋霓主管技师、黄凡衡技师大力支持与配合，深表谢意! 法国赛诺菲公司为本实验提供部分赞助经费，广东天普生物化学制药有限公司免费提供尿激酶产品，在此一并表示诚挚感谢。
作者简介：胡顶高(1962-)，男，湖南南县人，解放军458医院神经内科主治医生，现为第一军医大学在职研究生，电话：87377881-2206
参考文献：
[1] 李盈盈，王子灿，李麟仙. 家兔急性不完全性脑缺血模型和特点的实验研究[J]. 中华神经精神科杂志, 1987, 20(2):101-4.
[2] 赵卫国，张天锡. 兔MCAo型局灶脑缺血模型的建立[J]. 中国神经精神疾病杂志, 1990, 16(2):143-5.
[3] 杨金升，张如富，赵红全，等. 兔急性全脑缺血模型的建立[J]. 兰州医学院学报, 1995, 21(2):123-5.
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[4] Benes V, Zabramski JM, Boston M, et al. Effect of intra-arterial antifibrinolytic agents on autologous arterial emboli in the cerebral circulation of rabbits[J]. Stroke, 1990, 21(11):1594-9.
[5] Hamilton MG, Lee JS, Cummings PJ, et al. A comparison of intra-arterial and intravenous tissue-type plasminogen activator on autologous arterial emboli in the cerebral circulation of rabbits[J]. Stroke, 1994, 25(3):651-6.
[6] Carter LP, Guthkelch AN, Orozco J, et al. Influence of tissue plasminogen activator and heparin on cerebral ischemia in a rabbit model[J]. Stroke, 1992, 23:883-8.
收稿日期：2000-01-23, 百拇医药