链酶亲和素-生物素ELISA 检测人心肌肌钙蛋白T
作者：李志梁 钱洪津 焦保明 陆青 王素华
单位：李志梁(第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州510282)；钱洪津(第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州510282)；焦保明(第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州510282)；陆青(第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州510282)；王素华(第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州510282)
关键词：肌钙蛋白；心肌；链酶亲和素；生物素；酶联免疫吸附测定
第一军医大学学报000402 摘要：目的 建立人心肌肌钙蛋白T (cTnT)链酶亲和素-生物素(SAB)双抗体夹心酶联免疫分析(ELISA)方法，诊断急性心肌损伤性疾病。方法 以固相化单抗3F7捕捉样品中cTnT，生物素化3H12单抗为检测抗体，加入SA-HRP，显色。根据已知不同浓度标准cTnT显色后D(λ)值的标准曲线，检测待测样品cTnT含量。结果 cTnT的最低检测值为0.15 ng/ml，批内变异系数为3.8%，批间变异系数为11.2%，回收率为98%。35例急性心肌损伤患者cTnT含量为(0.68±0.17) ng/ml，明显高于52例正常人对照组(0.20±0.03) ng/ml(P<0.01)。结论 本方法灵敏、特异、稳定，可用于临床急性心肌损伤疾病的诊断。
, 百拇医药
中图分类号：R392.33 文献标识码：A 文章编号： 1000-2588(2000)04-0293-03
Streptavidin-biotin ELISA for human cardiac troponin TLI Zhi-liang, QIAN Hong-jin, JIAO Bao-ming, LU Qing, WANG Su-hua
(Department of Cardiology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
Abstract: Objective To establish a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to examin cardiac troponin T (cTnT) for diagnosing acute myocardial ischemic diseases. Methods The sandwich ELISA for cTnT was developed using 2 monoclonal antibodies to cTnT (3F7, 3H12), 3F7 serving as solid plase antibody and biotinylated-3H12 as the reporter. Streptavidin-HRP is added for coloration. According to the standard curves describing the value of D(λ), the content of cTnT in the samples was determined. Results Sensitivity of this assay was 0.15 ng/ml. Coefficients of variation were 3.8 percent within assays and 11.2 precent between assays. The recovery rate of added cTnT was about 98 percent. By this assay, the serum level of cTnT (0.68±0.17 ng/ml) was higher in 35 patients with acute myocardial ischemic diseases than in 53 normal subjects (0.20±0.03 ng/ml) (P<0.01). Conclusion This assay is sensitive, specific and stable, and is of value in the diagnosis of acute myocardial ischemic diseases.
, 百拇医药
Key words: troponin; myocardium; streptavidiv; biotin; ELISA
人心肌肌钙蛋白T(cTnT)是心肌兴奋-收缩耦联过程中重要的调节蛋白，是肌钙蛋白的亚单位之一。近年来，国外学者[1、3]通过检测人血清cTnT来早期诊断急性心肌损伤程度、范围，评估心肌细胞功能状态，预测缺血性心肌疾病的远期预后。由于其诊断心肌损伤的高特异性、高敏感性及诊断时间窗口长等特点，优于现行的磷酸肌酸激酶(CPK)及同工酶(CK-MB)[4]，已成为20世纪90年代诊断急性心肌梗死、不稳定型心绞痛及心脏介入治疗后心肌缺血新的标志[5]。我们在成功纯化人cTnT及制备抗cTnT单克隆抗体的基础上，建立了链酶亲和素-生物素双抗体夹心酶联免疫法，检测人血清cTnT含量并初步用于临床，其特异性、敏感性和稳定性已基本达到临床诊断要求。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 主要试剂和仪器
酰化生物素与链酶亲和素-HRP(SA-HRP)，Sigma产品；牛血清白蛋白购自上海生化所；条排酶标板，Nunc产品；Bio-RAD Model 550酶联检测仪，LKB产品；GrammaBind Plus Sepharose，Sweden产品。
1.2 cTnT抗原
从志愿者捐献遗体的心脏中提取纯化[6]。
1.3 抗cTnT单克隆抗体制备
首先采用脾内注射快速免疫法，制备出cTnT单克隆抗体细胞株2H8，为IgM[7]，而后采用腹腔内注射免疫法，获取8株抗cTnT单克隆抗体细胞株，经筛选的3F7、3H12分别作为包被抗体和生物素化抗体，均为IgG。
, http://www.100md.com
1.4 抗cTnT单克隆抗体纯化
收集离心去脂及沉淀后的腹水直接上GrammaBind Plus Sepharose层析柱，收集第一峰透析，Lowry法测定蛋白含量，间接ELISA测定抗体效价，SDS-PAGE鉴定纯度。3F7、3H12蛋白含量分别为1.4 mg/ml和0.98 mg/ml，均为电泳纯，抗体效价分别为6.4×10-8，3.2×10-7。
1.5 cTnT酶联免疫检测方法的建立
3F7单克隆抗体用包被液稀释后加入条排板，每孔100 μl，4 ℃ 24 h过夜，洗涤3次，每次5 min；加入1% BSA封闭过夜，洗涤3次，每次5 min，备用。加稀释后样品0～100 ng，每孔100 μl，37 ℃水浴1 h，洗涤3次，加入生物素化3H12，37 ℃1 h，洗涤3次，每次5 min；加入SA-HRP(1:2 000)，37 ℃水浴30 min；加入TMB(3.3’.5.5’-四甲基联苯胺，Tetramethylbenzidine)50 μl，37 ℃10 min。2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪450 nm检测各孔D(λ)值。
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2 结果
2.1 链酶亲和素-生物素化双抗体夹心法最适条件
2.1.1包被条件 选择pH 7.4戊二醛-磷酸盐缓冲液，pH 9.6 0.02 mol/L碳酸盐缓冲液包被第一抗体，以后者包被后吸附效果最佳。包被IgG浓度为10～20 μg/ml，检测灵敏度最高。
2.1.2生物素化标记3H12浓度 将BNSH(酰化生物素，Biotin-N-hydroxysuccinimine)用DMF(二甲苯亚风，Dimethyl sulfoxide)稀释成1 mg/ml后，按质量比(m/m)1∶5、7、10、15、30比例标记，以1:10为最佳标记，(1～2)μg/ml为最佳浓度，标记后加等量甘油，分装， -40 ℃贮存。
2.1.3稀释液 分别配制三种稀释液，A：pH 7.4磷酸缓冲液+1%BSA+0.5‰Tween(吐温-20)；B：pH 7.4磷酸缓冲液+1%BSA+1‰Tween(吐温-20)；C：pH 8.0磷酸缓冲液。经筛选以C为最佳稀释液。
, 百拇医药
2.1.4 SA-HRP选择 用矩阵法确定1:2 000的SA-HRP为佳，能使0.15 ng/ml cTnT显色后D(λ)大于本底值的2.1倍，非特异性吸附D(λ)值小于0.05。
2.1.5 最适反应时间 固相单抗4 ℃、18～24 h能最大限度捕获待检样品中的cTnT；加入cTnT后37 ℃、1 h与第一抗体结合最佳；SA-HRP反应30 min可达到理想效果。
2.2 标准曲线
分别用PBS、正常人血清与0～100 ng/ml不同的cTnT配成一定梯度，结果显示0.2～30 ng范围内能形成一线性曲线，如图1所示。
图1 cTnT标准曲线
, 百拇医药
Fig.1.Standard curves of cTnT detection
2.3 灵敏度
cTnT浓度0.05～20 ng/ml时所测的D(λ)值的均数分别与本底比较，结果显示：cTnT 0.15 ng/ml为本底的2.1倍(P<0.01)。以此为阳性标准，即为最低检测值。如表1所示。
表1 SAB-ELISA检测cTnT灵敏度
Tab. 1 Sensitivity of SAB-ELISA for detecting cTnT
Zero plate
Negative plate
CTnT(0.15 ng/ml)
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D(λ)
value
0.092±0.006
0.114±0.004
0.138±0.007
Average
-
0.022
0.046
2.4 精确度
对同一样品所测的12个复孔的D(λ)值，计算批内变异系数为3.8%。2个月后对同一样品(-40℃)再次检测，批间变异系数为11.2%。
, 百拇医药
2.5 特异性
主要与心肌肌钙蛋白I作交叉反应比较，显示无交叉反应。
2.6 回收率
将10 ng cTnT分别投入PBS、1% BSA、2% BSA及5% BSA，结果为表2所示。在5% BSA中回收率有较明显下降。
表2 SAB-ELISA回收率
Tab 2. Rate of recovery of SAB-ELISA
PBS
1%BSA
2%BSA
5%BSA
, 百拇医药
D(λ) value
1.041
1.033
1.027
0.947
Reclamation(%)
100
99.3
98.7
91
2.7 临床初步应用
采用本方法检测53例正常成人血清cTnT含量为(0.20±0.03)ng/ml，35例急性心肌损伤性疾病患者血清cTnT含量为(0.68±0.17) ng/ml。两者比较P<0.01，基本达到临床早期诊断要求。
, 百拇医药
3 讨论
将SA-HRP引入ELISA系统，能大大提高灵敏度，同时非特异性显色远比AV低，故已成为检测血清或体液含量极低水平(ng～pg)物质的ELISA方法的重要放大系统[8]。Katus[2]建立的cTnT ELISA 方法中，将SA固相在酶标板上，不但保证其优良的放大效应，而且大大缩短了操作过程时间。但SA价格昂贵，其试剂盒在我国临床广泛应用有一定困难。本方法虽然较Katus方法所需时间多1 h，但灵敏度和稳定性较好，成本较低，适合国内基层医院临床检测和应用。
本方法中制备稳定、高效的单克隆抗体最为关键。2H8为一高效特异的抗cTnT单克隆抗体，但为IgM，不太稳定，故被摒弃。3F7及3H12均为第二次细胞融合获得的高效单克隆抗体，均为IgG，是本方法建立的成功基础。单克隆抗体的纯化有许多方法，我们采用Gramma Bind Plus Sepharose 层析方法，不但省时，更重要的是能使抗体效价稳定不降低，纯度高。
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夹心ELISA方法引进放大系统以后，其稳定性、准确性和降低非特异性显色受多种因素影响，实际操作中工作量极大。我们体会首先确定生物素化抗体浓度后能有助于其他条件的筛选，大大加快方法建立的速度，并且是提高灵敏度、降低本底值的关键之一。
磷酸肌酸激酶(CPK)极其同工酶(CK-MB)曾经被认为是诊断急性心肌梗死等疾病的血清学“金指标”[9]。cTnT、cTnI的ELISA方法的建立和临床应用，表明cTnT、cTnI对急性心肌损伤性疾病诊断的敏感性、特异性较CPK及CK-MB更佳，且诊断时间窗长(2周)，还可对部分亚急性心肌损伤诊断起重要临床参考作用[10]。本方法的建立，使其试剂盒国产化，将有力地提高缺血性心血管疾病的血清学诊断水平。
基金项目：广州市重点攻关项目基金资助(9724806)
作者简介：李志梁(1958-)，男，福建长汀人， 1992年毕业于第二军医大学，硕士，副教授，硕士生导师，电话：85143296
, http://www.100md.com
参考文献：
[1] Katus HA, Remphis A, Looser S, et al. Enzyme linked immunoassay of cardiac troponin T for the determination of acute myocardial infarction in patients[J]. J Mol Cell Cardial, 1989, 21(12):1349-53.
[2] Katus HA, Looser S, Hallermayer K, et al. Development and in vitro characterization of a new immunoassay of cardiac troponin T[J]. Clin Chem, 1992, 38(3):386-93.
[3] Jimenez FL, Goldman L, Sacks D, et al. Prognostic value of cardiac troponin T after noncardiac surgery: 6-month follow-up data[J]. JACC, 1997, 29(6):1241-5.
, http://www.100md.com
[4] Bhayana V, Henderson R. Biochemical markers of myocardial damage[J]. Clin Biochem, 1995, 28(1):1-6.
[5] 杨振华.应考虑在缺血性心脏病使用一些新的生化标记物[J]. 中华心血管病杂志, 1997, 25(5):327-9.
[6] 李志梁，傅朝平，钱学贤.人心肌肌钙蛋白T的纯化和初步鉴定[J].第一军医大学学报, 1996, 16(2):130-1.
[7] 李志梁，傅朝平，陆 青.人心肌肌钙蛋白T的纯化和单克隆抗体制备[J].生物化学和生物物理进展, 1996, 23(5):459-62.
[8] 程振球，章谷生.链酶亲和素的特性及其应用[J]. 上海免疫学杂志, 1992, 12(1):56-9.
, http://www.100md.com
[9] Wong SS. Strategic utilization of cardiac markers for the diagnostic of acute myocardial infarction[J]. Ann Clin Biochem, 1996, 26(2):301-6.
[10] Mair J, Morandell D, Genser N, et al. Equivalent early sensitivities of myoglobin, creatine kiease MB mass, creatine kinase isoform ratios and cardiac troponins I and T for acute myocardial infarction[J]. Clin Chem, 1995, 41(9):1266-72.
收稿日期：1999-10-11, http://www.100md.com
单位：李志梁(第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州510282)；钱洪津(第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州510282)；焦保明(第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州510282)；陆青(第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州510282)；王素华(第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州510282)
关键词：肌钙蛋白；心肌；链酶亲和素；生物素；酶联免疫吸附测定
第一军医大学学报000402 摘要：目的 建立人心肌肌钙蛋白T (cTnT)链酶亲和素-生物素(SAB)双抗体夹心酶联免疫分析(ELISA)方法，诊断急性心肌损伤性疾病。方法 以固相化单抗3F7捕捉样品中cTnT，生物素化3H12单抗为检测抗体，加入SA-HRP，显色。根据已知不同浓度标准cTnT显色后D(λ)值的标准曲线，检测待测样品cTnT含量。结果 cTnT的最低检测值为0.15 ng/ml，批内变异系数为3.8%，批间变异系数为11.2%，回收率为98%。35例急性心肌损伤患者cTnT含量为(0.68±0.17) ng/ml，明显高于52例正常人对照组(0.20±0.03) ng/ml(P<0.01)。结论 本方法灵敏、特异、稳定，可用于临床急性心肌损伤疾病的诊断。
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中图分类号：R392.33 文献标识码：A 文章编号： 1000-2588(2000)04-0293-03
Streptavidin-biotin ELISA for human cardiac troponin TLI Zhi-liang, QIAN Hong-jin, JIAO Bao-ming, LU Qing, WANG Su-hua
(Department of Cardiology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
Abstract: Objective To establish a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to examin cardiac troponin T (cTnT) for diagnosing acute myocardial ischemic diseases. Methods The sandwich ELISA for cTnT was developed using 2 monoclonal antibodies to cTnT (3F7, 3H12), 3F7 serving as solid plase antibody and biotinylated-3H12 as the reporter. Streptavidin-HRP is added for coloration. According to the standard curves describing the value of D(λ), the content of cTnT in the samples was determined. Results Sensitivity of this assay was 0.15 ng/ml. Coefficients of variation were 3.8 percent within assays and 11.2 precent between assays. The recovery rate of added cTnT was about 98 percent. By this assay, the serum level of cTnT (0.68±0.17 ng/ml) was higher in 35 patients with acute myocardial ischemic diseases than in 53 normal subjects (0.20±0.03 ng/ml) (P<0.01). Conclusion This assay is sensitive, specific and stable, and is of value in the diagnosis of acute myocardial ischemic diseases.
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Key words: troponin; myocardium; streptavidiv; biotin; ELISA
人心肌肌钙蛋白T(cTnT)是心肌兴奋-收缩耦联过程中重要的调节蛋白，是肌钙蛋白的亚单位之一。近年来，国外学者[1、3]通过检测人血清cTnT来早期诊断急性心肌损伤程度、范围，评估心肌细胞功能状态，预测缺血性心肌疾病的远期预后。由于其诊断心肌损伤的高特异性、高敏感性及诊断时间窗口长等特点，优于现行的磷酸肌酸激酶(CPK)及同工酶(CK-MB)[4]，已成为20世纪90年代诊断急性心肌梗死、不稳定型心绞痛及心脏介入治疗后心肌缺血新的标志[5]。我们在成功纯化人cTnT及制备抗cTnT单克隆抗体的基础上，建立了链酶亲和素-生物素双抗体夹心酶联免疫法，检测人血清cTnT含量并初步用于临床，其特异性、敏感性和稳定性已基本达到临床诊断要求。
1 材料与方法
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1.1 主要试剂和仪器
酰化生物素与链酶亲和素-HRP(SA-HRP)，Sigma产品；牛血清白蛋白购自上海生化所；条排酶标板，Nunc产品；Bio-RAD Model 550酶联检测仪，LKB产品；GrammaBind Plus Sepharose，Sweden产品。
1.2 cTnT抗原
从志愿者捐献遗体的心脏中提取纯化[6]。
1.3 抗cTnT单克隆抗体制备
首先采用脾内注射快速免疫法，制备出cTnT单克隆抗体细胞株2H8，为IgM[7]，而后采用腹腔内注射免疫法，获取8株抗cTnT单克隆抗体细胞株，经筛选的3F7、3H12分别作为包被抗体和生物素化抗体，均为IgG。
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1.4 抗cTnT单克隆抗体纯化
收集离心去脂及沉淀后的腹水直接上GrammaBind Plus Sepharose层析柱，收集第一峰透析，Lowry法测定蛋白含量，间接ELISA测定抗体效价，SDS-PAGE鉴定纯度。3F7、3H12蛋白含量分别为1.4 mg/ml和0.98 mg/ml，均为电泳纯，抗体效价分别为6.4×10-8，3.2×10-7。
1.5 cTnT酶联免疫检测方法的建立
3F7单克隆抗体用包被液稀释后加入条排板，每孔100 μl，4 ℃ 24 h过夜，洗涤3次，每次5 min；加入1% BSA封闭过夜，洗涤3次，每次5 min，备用。加稀释后样品0～100 ng，每孔100 μl，37 ℃水浴1 h，洗涤3次，加入生物素化3H12，37 ℃1 h，洗涤3次，每次5 min；加入SA-HRP(1:2 000)，37 ℃水浴30 min；加入TMB(3.3’.5.5’-四甲基联苯胺，Tetramethylbenzidine)50 μl，37 ℃10 min。2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪450 nm检测各孔D(λ)值。
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2 结果
2.1 链酶亲和素-生物素化双抗体夹心法最适条件
2.1.1包被条件 选择pH 7.4戊二醛-磷酸盐缓冲液，pH 9.6 0.02 mol/L碳酸盐缓冲液包被第一抗体，以后者包被后吸附效果最佳。包被IgG浓度为10～20 μg/ml，检测灵敏度最高。
2.1.2生物素化标记3H12浓度 将BNSH(酰化生物素，Biotin-N-hydroxysuccinimine)用DMF(二甲苯亚风，Dimethyl sulfoxide)稀释成1 mg/ml后，按质量比(m/m)1∶5、7、10、15、30比例标记，以1:10为最佳标记，(1～2)μg/ml为最佳浓度，标记后加等量甘油，分装， -40 ℃贮存。
2.1.3稀释液 分别配制三种稀释液，A：pH 7.4磷酸缓冲液+1%BSA+0.5‰Tween(吐温-20)；B：pH 7.4磷酸缓冲液+1%BSA+1‰Tween(吐温-20)；C：pH 8.0磷酸缓冲液。经筛选以C为最佳稀释液。
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2.1.4 SA-HRP选择 用矩阵法确定1:2 000的SA-HRP为佳，能使0.15 ng/ml cTnT显色后D(λ)大于本底值的2.1倍，非特异性吸附D(λ)值小于0.05。
2.1.5 最适反应时间 固相单抗4 ℃、18～24 h能最大限度捕获待检样品中的cTnT；加入cTnT后37 ℃、1 h与第一抗体结合最佳；SA-HRP反应30 min可达到理想效果。
2.2 标准曲线
分别用PBS、正常人血清与0～100 ng/ml不同的cTnT配成一定梯度，结果显示0.2～30 ng范围内能形成一线性曲线，如图1所示。
图1 cTnT标准曲线
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Fig.1.Standard curves of cTnT detection
2.3 灵敏度
cTnT浓度0.05～20 ng/ml时所测的D(λ)值的均数分别与本底比较，结果显示：cTnT 0.15 ng/ml为本底的2.1倍(P<0.01)。以此为阳性标准，即为最低检测值。如表1所示。
表1 SAB-ELISA检测cTnT灵敏度
Tab. 1 Sensitivity of SAB-ELISA for detecting cTnT
Zero plate
Negative plate
CTnT(0.15 ng/ml)
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D(λ)
value
0.092±0.006
0.114±0.004
0.138±0.007
Average
-
0.022
0.046
2.4 精确度
对同一样品所测的12个复孔的D(λ)值，计算批内变异系数为3.8%。2个月后对同一样品(-40℃)再次检测，批间变异系数为11.2%。
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2.5 特异性
主要与心肌肌钙蛋白I作交叉反应比较，显示无交叉反应。
2.6 回收率
将10 ng cTnT分别投入PBS、1% BSA、2% BSA及5% BSA，结果为表2所示。在5% BSA中回收率有较明显下降。
表2 SAB-ELISA回收率
Tab 2. Rate of recovery of SAB-ELISA
PBS
1%BSA
2%BSA
5%BSA
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D(λ) value
1.041
1.033
1.027
0.947
Reclamation(%)
100
99.3
98.7
91
2.7 临床初步应用
采用本方法检测53例正常成人血清cTnT含量为(0.20±0.03)ng/ml，35例急性心肌损伤性疾病患者血清cTnT含量为(0.68±0.17) ng/ml。两者比较P<0.01，基本达到临床早期诊断要求。
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3 讨论
将SA-HRP引入ELISA系统，能大大提高灵敏度，同时非特异性显色远比AV低，故已成为检测血清或体液含量极低水平(ng～pg)物质的ELISA方法的重要放大系统[8]。Katus[2]建立的cTnT ELISA 方法中，将SA固相在酶标板上，不但保证其优良的放大效应，而且大大缩短了操作过程时间。但SA价格昂贵，其试剂盒在我国临床广泛应用有一定困难。本方法虽然较Katus方法所需时间多1 h，但灵敏度和稳定性较好，成本较低，适合国内基层医院临床检测和应用。
本方法中制备稳定、高效的单克隆抗体最为关键。2H8为一高效特异的抗cTnT单克隆抗体，但为IgM，不太稳定，故被摒弃。3F7及3H12均为第二次细胞融合获得的高效单克隆抗体，均为IgG，是本方法建立的成功基础。单克隆抗体的纯化有许多方法，我们采用Gramma Bind Plus Sepharose 层析方法，不但省时，更重要的是能使抗体效价稳定不降低，纯度高。
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夹心ELISA方法引进放大系统以后，其稳定性、准确性和降低非特异性显色受多种因素影响，实际操作中工作量极大。我们体会首先确定生物素化抗体浓度后能有助于其他条件的筛选，大大加快方法建立的速度，并且是提高灵敏度、降低本底值的关键之一。
磷酸肌酸激酶(CPK)极其同工酶(CK-MB)曾经被认为是诊断急性心肌梗死等疾病的血清学“金指标”[9]。cTnT、cTnI的ELISA方法的建立和临床应用，表明cTnT、cTnI对急性心肌损伤性疾病诊断的敏感性、特异性较CPK及CK-MB更佳，且诊断时间窗长(2周)，还可对部分亚急性心肌损伤诊断起重要临床参考作用[10]。本方法的建立，使其试剂盒国产化，将有力地提高缺血性心血管疾病的血清学诊断水平。
基金项目：广州市重点攻关项目基金资助(9724806)
作者简介：李志梁(1958-)，男，福建长汀人， 1992年毕业于第二军医大学，硕士，副教授，硕士生导师，电话：85143296
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参考文献：
[1] Katus HA, Remphis A, Looser S, et al. Enzyme linked immunoassay of cardiac troponin T for the determination of acute myocardial infarction in patients[J]. J Mol Cell Cardial, 1989, 21(12):1349-53.
[2] Katus HA, Looser S, Hallermayer K, et al. Development and in vitro characterization of a new immunoassay of cardiac troponin T[J]. Clin Chem, 1992, 38(3):386-93.
[3] Jimenez FL, Goldman L, Sacks D, et al. Prognostic value of cardiac troponin T after noncardiac surgery: 6-month follow-up data[J]. JACC, 1997, 29(6):1241-5.
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[4] Bhayana V, Henderson R. Biochemical markers of myocardial damage[J]. Clin Biochem, 1995, 28(1):1-6.
[5] 杨振华.应考虑在缺血性心脏病使用一些新的生化标记物[J]. 中华心血管病杂志, 1997, 25(5):327-9.
[6] 李志梁，傅朝平，钱学贤.人心肌肌钙蛋白T的纯化和初步鉴定[J].第一军医大学学报, 1996, 16(2):130-1.
[7] 李志梁，傅朝平，陆 青.人心肌肌钙蛋白T的纯化和单克隆抗体制备[J].生物化学和生物物理进展, 1996, 23(5):459-62.
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收稿日期：1999-10-11, http://www.100md.com