潘生丁对KB细胞株多药耐药逆转作用的实验研究
作者：梅晓冬 包明红 夏淮玲 陈哲生 任晓琴 秋山坤
单位：梅晓冬 包明红 夏淮玲(安徽省立医院内科 合肥市 230001)；陈哲生 任晓琴 秋山坤(日本鹿儿岛大学医学院肿瘤研究所 鹿儿岛市)
关键词：多药耐药；潘生丁；逆转；KB细胞
肿瘤防治杂志000404
【摘要】目的：观察了潘生丁对KB细胞株多药耐药的逆转作用并对其作用机制进行探讨。方法：使用MTT法检测比较KB母细胞和耐药细胞株对长春新碱(VCR)的药物敏感度并观察潘生丁对耐药的逆转程度；用3H标记的VCR检测细胞内药物浓度的变化。结果：潘生丁作用下，KB母细胞和耐药细胞株的药物敏感度均有增高并呈剂量相关关系，有MRP表达的耐药细胞株对VCR的敏感度比母细胞株高17倍。母细胞株和耐药细胞株细胞内的药物蓄积均有明显增加。结论：潘生丁能通过增加细胞内的VCR蓄积，显著提高KB细胞对药物的敏感度；耐药细胞株与母细胞株相比，有较大程度的逆转，可能与MRP的表达有关，有待进一步探讨。
, http://www.100md.com
中图分类号：R73-31(52) 文献标识码：E
文章编号：1009-4571(2000)04-0346-02
Reversal Effect of Dipyridamole on KB Carcinoma Cells in Vitro
MEI Xiao-dong,BAO Min-hong,XIA Huai-ling,et al.
(Internal Mewdicine,Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001)
【Abstract】Objective:This study is aim at investigating the reversal effect of dipyridamole and its mechanism.Methods:The enhancement of chemosensitity of KB cells to vincristine(VCR) by dipyridamole in different concentrations was analysed with MTT method.The accumulation of 33H-VCR in cells is measured.Results:The chemosensitivity to vincristine is enhanced in a dosedependent way and 3 H-VCR accumulation is raised by dipyridamole in both cell lines while there is a higher reversal effect in MRP expressing resistant cells.Conclusions:Dipyridamole can increase VCR accumulation and reverse the resistance to VCR in KB cells.The effect of MRP might be involved.
, 百拇医药
【Key words】dipyridamole;KB cells;multi-drug resistance
肿瘤多药耐药是化疗失败的重要原因，细胞内药物浓度的下降是产生多药耐药的机理之一。细胞内药物浓度的下降与细胞膜上异常活跃的具有药物泵作用的蛋白质有关，细胞膜糖蛋白(P170)、多药耐药相关蛋白(MRP)等能“泵出”细胞内的化疗药物，使某些药物的细胞毒作用下降。潘生丁是临床常用的抗血小板凝集药物，有报道其能逆转由P170介导的多药耐药。本文就潘生丁对KB肿瘤细胞株多药耐药的逆转作用及其逆转机理进行研究。
1 材料与方法
1.1 细胞株
人上皮细胞癌KB-3-1由美国国立卫生院Dr.Am.Gottesman提供。KB-MRP为KB细胞导入MRP基团稳定表达MRP的多药耐药细胞株，由九州大学提供。细胞培养使用含有10%小牛血清的MEME培养液(Nissui seiyaku,Co.Tokyo)，其中含有青霉素50 IU，谷氨酰胺50 μg/ml，碳酸氢钠2 g/500 ml。培养条件37℃、5% CO2湿度饱和。
, 百拇医药
1.2 试剂
潘生丁购于睚和光纯药工业株式会社，NCS购自Cell culture lab(cleveland OH)。3H-VCR购自Amershan International Ltd。MTT购自Sigma公司。
1.3 细胞药物敏感试验
采用噻唑蓝(MTT)法。将对数生长期的细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，加培养液充分混匀，按170 μV孔、KB-3-1细胞300个/孔、KB-3-1细胞5 000个/孔浓度种于96孔板，培养24 h，加入潘生丁10 μl(终浓度10 μM)，培养2～4 h后加入化疗药物20 μl，继续培养72 h，加入MTT 50 μl(1 mg/ml)，培养2～4 h，吸去培养液，加入100 μl二甲基亚砜，立即摇匀，置酶联仪(MRP-4Ai,Tosoh,Tokyo)，在570 μM波长读数，计算细胞的半抑制浓度IC50。
, 百拇医药
1.4 药物蓄积试验
将对数生长期的细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，加入培养液充分混匀，按每孔10×104个细胞/ml种于24孔板，培养24～48 h细胞生长至亚融合状态时，更换含有或不含有潘生丁的培养液，培养24 h后，加入3H-VCR继续培养1 h后，吸去培养液，冷PBS洗3次，加入含有1%Triton-X100和0.2% SDS的pH 7.4的PBS裂解液，收集后测定各样品的放射性活度。
1.5 统计学处理
各试验均重复3次，取其均值，用t检验比较母细胞和耐药细胞在使用逆转剂后的IC50改变。
2 结果
2.1 药敏试验
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KB-MRP与KB-3-1细胞相比对VCR有10倍的耐药。加用潘生丁时，两种细胞的IC50均有下降，潘生丁对母细胞株和耐药细胞株均有不同程度的毒性增强作用且呈剂量依赖型关系。在潘生丁10 μM时，KB-3-1细胞约逆转5倍，KB-MRP逆转22倍，KB-MPR的逆转程度比KB-3-1细胞高药17倍，两者相比有统计学意义(P<0.05)(表1)。
表1 不同潘生丁浓度时两种细胞株对VCR的敏感度(IC50) 细胞株
0
5
10
30(μM)
KB-3-1
25.0±2.2
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14.8±2.5
5.1±0.9
1.0±0.3
KB-MRP
263.7±19.8
97.7±16.7
12.2±3.9
6.1±0.8
2.2 药物蓄积试验
与对照相比，使用潘生丁30 μM时母细胞和耐药细胞株内的3H-VCR浓度均明显增加。耐药细胞株比母细胞高，但两者之间的差异不显著(表2)。表2 两种细胞对3H-VCR的蓄积(DPM/104)细胞 细胞株
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对照
潘生丁(30μM)
KB-3-1
44.5±6.9
247.7±25.5
KB-MRP
27.5±3.1
166.4±18.6
3 讨论
多药耐药是临床肿瘤化疗失败的主要原因，其发生机制目前尚不十分清楚，一般认为与肿瘤细胞的结构和功能的变化有关，包括细胞膜蛋白的表达如糖蛋白P170、多药耐药相关蛋白(MRP)、细胞内肺耐药蛋白(LRP)表达以及细胞内酶的变化有关[1]。MRP是近年发现的一种ATP依赖型跨膜蛋白，其功能尚不十分清楚，一般认为其能够水解ATP获得能量将与其非特异性结合的药物“泵出”细胞外，从而降低细胞内药物的蓄积，产生对化疗药物的耐药[2]。寻找安全有效的耐药逆转剂是增加化疗效果的一个重要课题。已发现一些药物如异博定，CoA等能逆转由MDR介导的多药耐药[3]，但由于这些药物本身对人体有较大的副作用，难以临床应用。潘生丁是临床常用的抗血小板凝聚药物。近年来发现其能增强化疗药物的肿瘤细胞毒性作用[4]，可作用于P170而增加细胞内药物的蓄积、增加药物的毒性[5]。潘生丁还可能增加耐药细胞株细胞内Vp-16的积蓄，对终细胞株也有增强作用，其作用机理目前尚不清楚[6]。本研究中潘生丁对母细胞株和有MRP表达的耐药细胞株细胞株均有作用并且呈剂量依赖型关系。两种细胞株的IC50均有明显下降，对耐药细胞株逆转化母细胞株高17倍，两种细胞株之间的差异有统计学意义(P<0.050)。提示潘生丁对肿瘤化疗药物具有协同作用，对耐药细胞株有逆转作用。蓄积试验显示两种细胞株的细胞内药物浓度均有明显增高，说明潘生丁的作用是通过增加细胞内化疗药物的浓度而发挥作用，对耐药细胞株的逆转作用可能与MRP有关，其机制有待进一步研究。
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基金项目：本课题为卫生部日中川医学奖金第22期项目资助
参考文献：
[1]Endicott JAa,Ling V.The biochemistry of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance[J].Ann Rev Biochem,1989,58(1):137～171.
[2]Cole SPC,Bhardwaj G,Gerlach JH,et al.Over-expression of a transporter gene in a multidrug resistant human lung cancer cell line[J].Science,1992,258:1650～1654.
[3]张荣河，何三光.异博定对乳腺癌细胞多药耐药性逆转作用的研究[J].中国医大学报，1999，28(6)：426～427.
, 百拇医药
[4]Curtin and Turner RN.Dipyridamole-mediated reversal of multidrug resistance in MRP orerexpressing human lung carcinoma cells in vitro[J].European Joumal of Cancer,1999,35(6):1020～1026.
[5]Asoh KI,Yoshio SI et al Potentiation of some anticancer agents by dipyridanole against drug-sensitive and drug-resistant cancer cell lines[J].Jpn Cancer Res,1990,80(2):475～481.
[6]Turner RN,Curtin NJ,Dipyridamole increases Vp-16 growth inhibition,accumulation and retention in parental and multdrug-resistance CHO cells[J].R J Cancre,1996,73(1):856～890.
收稿日期：2000-01-25
修回日期：2000-03-10, http://www.100md.com
单位：梅晓冬 包明红 夏淮玲(安徽省立医院内科 合肥市 230001)；陈哲生 任晓琴 秋山坤(日本鹿儿岛大学医学院肿瘤研究所 鹿儿岛市)
关键词：多药耐药；潘生丁；逆转；KB细胞
肿瘤防治杂志000404
【摘要】目的：观察了潘生丁对KB细胞株多药耐药的逆转作用并对其作用机制进行探讨。方法：使用MTT法检测比较KB母细胞和耐药细胞株对长春新碱(VCR)的药物敏感度并观察潘生丁对耐药的逆转程度；用3H标记的VCR检测细胞内药物浓度的变化。结果：潘生丁作用下，KB母细胞和耐药细胞株的药物敏感度均有增高并呈剂量相关关系，有MRP表达的耐药细胞株对VCR的敏感度比母细胞株高17倍。母细胞株和耐药细胞株细胞内的药物蓄积均有明显增加。结论：潘生丁能通过增加细胞内的VCR蓄积，显著提高KB细胞对药物的敏感度；耐药细胞株与母细胞株相比，有较大程度的逆转，可能与MRP的表达有关，有待进一步探讨。
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中图分类号：R73-31(52) 文献标识码：E
文章编号：1009-4571(2000)04-0346-02
Reversal Effect of Dipyridamole on KB Carcinoma Cells in Vitro
MEI Xiao-dong,BAO Min-hong,XIA Huai-ling,et al.
(Internal Mewdicine,Anhui Provincial Hospital,Hefei 230001)
【Abstract】Objective:This study is aim at investigating the reversal effect of dipyridamole and its mechanism.Methods:The enhancement of chemosensitity of KB cells to vincristine(VCR) by dipyridamole in different concentrations was analysed with MTT method.The accumulation of 33H-VCR in cells is measured.Results:The chemosensitivity to vincristine is enhanced in a dosedependent way and 3 H-VCR accumulation is raised by dipyridamole in both cell lines while there is a higher reversal effect in MRP expressing resistant cells.Conclusions:Dipyridamole can increase VCR accumulation and reverse the resistance to VCR in KB cells.The effect of MRP might be involved.
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【Key words】dipyridamole;KB cells;multi-drug resistance
肿瘤多药耐药是化疗失败的重要原因，细胞内药物浓度的下降是产生多药耐药的机理之一。细胞内药物浓度的下降与细胞膜上异常活跃的具有药物泵作用的蛋白质有关，细胞膜糖蛋白(P170)、多药耐药相关蛋白(MRP)等能“泵出”细胞内的化疗药物，使某些药物的细胞毒作用下降。潘生丁是临床常用的抗血小板凝集药物，有报道其能逆转由P170介导的多药耐药。本文就潘生丁对KB肿瘤细胞株多药耐药的逆转作用及其逆转机理进行研究。
1 材料与方法
1.1 细胞株
人上皮细胞癌KB-3-1由美国国立卫生院Dr.Am.Gottesman提供。KB-MRP为KB细胞导入MRP基团稳定表达MRP的多药耐药细胞株，由九州大学提供。细胞培养使用含有10%小牛血清的MEME培养液(Nissui seiyaku,Co.Tokyo)，其中含有青霉素50 IU，谷氨酰胺50 μg/ml，碳酸氢钠2 g/500 ml。培养条件37℃、5% CO2湿度饱和。
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1.2 试剂
潘生丁购于睚和光纯药工业株式会社，NCS购自Cell culture lab(cleveland OH)。3H-VCR购自Amershan International Ltd。MTT购自Sigma公司。
1.3 细胞药物敏感试验
采用噻唑蓝(MTT)法。将对数生长期的细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，加培养液充分混匀，按170 μV孔、KB-3-1细胞300个/孔、KB-3-1细胞5 000个/孔浓度种于96孔板，培养24 h，加入潘生丁10 μl(终浓度10 μM)，培养2～4 h后加入化疗药物20 μl，继续培养72 h，加入MTT 50 μl(1 mg/ml)，培养2～4 h，吸去培养液，加入100 μl二甲基亚砜，立即摇匀，置酶联仪(MRP-4Ai,Tosoh,Tokyo)，在570 μM波长读数，计算细胞的半抑制浓度IC50。
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1.4 药物蓄积试验
将对数生长期的细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，加入培养液充分混匀，按每孔10×104个细胞/ml种于24孔板，培养24～48 h细胞生长至亚融合状态时，更换含有或不含有潘生丁的培养液，培养24 h后，加入3H-VCR继续培养1 h后，吸去培养液，冷PBS洗3次，加入含有1%Triton-X100和0.2% SDS的pH 7.4的PBS裂解液，收集后测定各样品的放射性活度。
1.5 统计学处理
各试验均重复3次，取其均值，用t检验比较母细胞和耐药细胞在使用逆转剂后的IC50改变。
2 结果
2.1 药敏试验
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KB-MRP与KB-3-1细胞相比对VCR有10倍的耐药。加用潘生丁时，两种细胞的IC50均有下降，潘生丁对母细胞株和耐药细胞株均有不同程度的毒性增强作用且呈剂量依赖型关系。在潘生丁10 μM时，KB-3-1细胞约逆转5倍，KB-MRP逆转22倍，KB-MPR的逆转程度比KB-3-1细胞高药17倍，两者相比有统计学意义(P<0.05)(表1)。
表1 不同潘生丁浓度时两种细胞株对VCR的敏感度(IC50) 细胞株
0
5
10
30(μM)
KB-3-1
25.0±2.2
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14.8±2.5
5.1±0.9
1.0±0.3
KB-MRP
263.7±19.8
97.7±16.7
12.2±3.9
6.1±0.8
2.2 药物蓄积试验
与对照相比，使用潘生丁30 μM时母细胞和耐药细胞株内的3H-VCR浓度均明显增加。耐药细胞株比母细胞高，但两者之间的差异不显著(表2)。表2 两种细胞对3H-VCR的蓄积(DPM/104)细胞 细胞株
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对照
潘生丁(30μM)
KB-3-1
44.5±6.9
247.7±25.5
KB-MRP
27.5±3.1
166.4±18.6
3 讨论
多药耐药是临床肿瘤化疗失败的主要原因，其发生机制目前尚不十分清楚，一般认为与肿瘤细胞的结构和功能的变化有关，包括细胞膜蛋白的表达如糖蛋白P170、多药耐药相关蛋白(MRP)、细胞内肺耐药蛋白(LRP)表达以及细胞内酶的变化有关[1]。MRP是近年发现的一种ATP依赖型跨膜蛋白，其功能尚不十分清楚，一般认为其能够水解ATP获得能量将与其非特异性结合的药物“泵出”细胞外，从而降低细胞内药物的蓄积，产生对化疗药物的耐药[2]。寻找安全有效的耐药逆转剂是增加化疗效果的一个重要课题。已发现一些药物如异博定，CoA等能逆转由MDR介导的多药耐药[3]，但由于这些药物本身对人体有较大的副作用，难以临床应用。潘生丁是临床常用的抗血小板凝聚药物。近年来发现其能增强化疗药物的肿瘤细胞毒性作用[4]，可作用于P170而增加细胞内药物的蓄积、增加药物的毒性[5]。潘生丁还可能增加耐药细胞株细胞内Vp-16的积蓄，对终细胞株也有增强作用，其作用机理目前尚不清楚[6]。本研究中潘生丁对母细胞株和有MRP表达的耐药细胞株细胞株均有作用并且呈剂量依赖型关系。两种细胞株的IC50均有明显下降，对耐药细胞株逆转化母细胞株高17倍，两种细胞株之间的差异有统计学意义(P<0.050)。提示潘生丁对肿瘤化疗药物具有协同作用，对耐药细胞株有逆转作用。蓄积试验显示两种细胞株的细胞内药物浓度均有明显增高，说明潘生丁的作用是通过增加细胞内化疗药物的浓度而发挥作用，对耐药细胞株的逆转作用可能与MRP有关，其机制有待进一步研究。
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基金项目：本课题为卫生部日中川医学奖金第22期项目资助
参考文献：
[1]Endicott JAa,Ling V.The biochemistry of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance[J].Ann Rev Biochem,1989,58(1):137～171.
[2]Cole SPC,Bhardwaj G,Gerlach JH,et al.Over-expression of a transporter gene in a multidrug resistant human lung cancer cell line[J].Science,1992,258:1650～1654.
[3]张荣河，何三光.异博定对乳腺癌细胞多药耐药性逆转作用的研究[J].中国医大学报，1999，28(6)：426～427.
, 百拇医药
[4]Curtin and Turner RN.Dipyridamole-mediated reversal of multidrug resistance in MRP orerexpressing human lung carcinoma cells in vitro[J].European Joumal of Cancer,1999,35(6):1020～1026.
[5]Asoh KI,Yoshio SI et al Potentiation of some anticancer agents by dipyridanole against drug-sensitive and drug-resistant cancer cell lines[J].Jpn Cancer Res,1990,80(2):475～481.
[6]Turner RN,Curtin NJ,Dipyridamole increases Vp-16 growth inhibition,accumulation and retention in parental and multdrug-resistance CHO cells[J].R J Cancre,1996,73(1):856～890.
收稿日期：2000-01-25
修回日期：2000-03-10, http://www.100md.com