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编号:10219254
人鼻咽癌细胞株和组织中Kappa样蛋白的检测
http://www.100md.com 《中国现代医学杂志》 2000年第4期
     作者:胡维新 何莉芳

    单位:湖南医科大学分子生物学研究中心 长沙 410078

    关键词:人鼻咽癌(NPC);免疫球蛋白Kappa(IgK)基因;Western免疫印迹;免疫组化

    中国现代医学杂志000412目的:为进一步研究免疫球蛋白Kappa基因在鼻咽癌(NPC)细胞中的表达,对NPC细胞株CNE2、NPC活检标本及石蜡切片中的Kappa样蛋白进行了检测。方法:从NPC细胞株、NPC活检标本得到蛋白抽提物,用Western免疫印迹法进行分析,信号通过生物素-抗生物素蛋白与生物素-辣根过氧物酶系统放大,然后再用ECL化学发光试剂盒进行检测,NPC石蜡切片用免疫组化进行检测。结果:NPC细胞株CNE2中检测到一31 Kd的Kappa样蛋白,使用兔抗人Kappa轻链抗体在NPC活检标本中得到一个特别信号,而使用兔抗人Lambda轻链抗体在同样样品中未见信号,在NPC石蜡切片中使用抗Kappa抗体时,有大约10%的细胞为阳性,而使用抗Lambda抗体没有细胞呈阳性信号。结论:一个与Ig Kappa C区基因有关的蛋白质存在于NPC细胞株和NPC活检标本中,Ig Kappa在NPC中基因的表达是特异的,并且可能与NPC致癌有关。
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    分类号 R739.63

    DETECTION OF KAPPA-LIKE PROTEIN IN HUMAN

    NPC CELL LINE AND NPC BIOPSIES

    Hu Weixin He Lifang

    (Molecular Biology Research Center and Department of Biology,Hunan Medical University, Changsha, Hunan 410078)

    Objective: In order to further understand Ig kappa gene expression in NPC cells, the Ig kappa-like protein in NPC cell line CNE2, NPC biopsies and NPC paraffin sections were detected. Methods: Protein extracts from NPC cell line CNE2 and NPC biopsies were detected by Western blot analysis. The signals were amplified by biotin-avidin/biotin-HRP system and detected by Amersham ECL chemiluminescent kit. NPC paraffin sections were detected by immunohistochemistry techniques. Results: A 31kd of kappa-like protein was detectd in NPC cell line CNE2 and a specific signal was detected in NPC biopsies by rabbit anti-human kappa light chain. No signal was detected by rabbit ’anti-human lambda light chain in the same samples. About 10% of cells in NPC paraffin sections were positive when using rabbit ’anti-human kappa light chain. No cells in NPC paraffin sections were positive with rabbit ’anti-human lambda light chain. Conclusions: A protein related to Ig kappa constant region gene exist in NPC cell line and NPC biopsies. Ig kappa gene expression in NPC is specific and may related to NPC carcinogenesis.
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    Key words: Human nasopharyngeal carcinoma (NPC); Immunoglobulin kappa (Ig K) gene; Western blot analysis; Imminohistochemistry

    几年来对人类鼻咽癌发病分子机理的研究,取得了很大的进展。发现癌细胞中c-H-ras和c-myc原癌基因活化[1],p53基因过表达[2]及EB病毒癌基因EBNA-5,EZLF1的表达。这些基因的表达和鼻咽癌的发生又与某些化学致癌物和EB病毒的感染有关[3]。令人感兴趣的是,曹亚等从中国人鼻咽癌细胞株CNE2中克隆了一段有转化活性的DNA序列[4],并将这段DNA序列称之为Tx基因。胡维新等对Tx基因进行了进一步的研究,包括对Tx基因的核苷酸序列分析,Tx基因与免疫球蛋白Kappa基因的同源性比较研究[5,6]。现已基本明确,先前在鼻咽癌细胞株中发现的Tx基因,实际上就是免疫球蛋白轻链Kappa基因。Northern印迹杂交及原位分子杂交分析证明,Kappa基因在几株鼻咽癌细胞株中均表达[6]。为进一步研究Kappa基因的表达状态,本文运用Westren免疫印迹、免疫组化方法,对CNE2、鼻咽癌活检标本及石蜡切片中Kappa基因和Lambda基因同时进行检测,得到了有意义的结果。
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    1 材料与方法

    1.1 材料

    人鼻咽癌细胞株CNE2系Dr.Lee LM(美国 NCI)惠赠,39例鼻咽癌活检标本及石蜡切片来自湖南省肿瘤医院,病理检查均为低分化鳞癌。试剂:兔抗人Kappa轻链及Lambda轻链,HRP连接的猪抗兔IgG均购自DAKO(丹麦),ECL Western免疫印迹试剂盒购自Amersham (英国),硝酸纤维膜购自Millipore(美国),低分子量蛋白质标志物购自Bio-Rad(美国)。

    1.2 方法

    1.2.1 Western免疫印迹 将新鲜活检组织约0.2 g,用PBS洗三次,加150 μl蛋白抽提液(含0.5% NP-40,0.1%SDS,10 μg/ml Leupeptin,1 mM PMSF,10 mM DTT),剪碎组织,制成匀浆,再加150 μl样品缓冲液(100 mM Tris pH6.8,200 mM DTT,4% SDS,0.2%溴酚蓝,20%甘油),超声处理,离心收集上清备用。细胞株CNE2生长到50%覆盖率时,去掉培养基,PBS洗三次,加入蛋白抽提液,用刮子刮下,再加样品缓冲液超声处理。加样前于100 ℃加热10 min,加30 μl样品于SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳,使用Tris-甘氨酸缓冲液,电压恒定在150 V。当溴酚蓝迁移到凝胶底部1 cm处时,停止电泳,把胶浸泡到转膜缓冲液中,轻轻摇动20 min,以除去电泳缓冲液中的盐及去污剂。然后用Bio-Rad的Trans-Blot SD半干型电泳转移槽,将蛋白质转移到硝酸纤维膜上,转移完成后,用考马斯亮兰R-250染色凝胶,以观察凝胶上是否有蛋白质残留。将膜浸泡于阻断液中(含4%去脂干奶粉和1%BSA),轻轻摆动,室温过夜。信号检测按如下步骤进行:一抗(兔抗人Kappa或Lambda抗体)按1∶1 000稀释,加到膜上,室温2h,洗去一抗后加生物素标记的二抗(羊抗兔,1∶1 000稀释),室温1 h,洗去二抗,加入Avidin(抗生物素蛋白),生物素连接的HRP(辣根过氧化物酶),室温30~60 min,使二抗、Avidin、生物素连接的HRP充分结合。洗去游离的HRP后,立即用ECL化学发光剂进行信号检测,X光片直接曝光。
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    1.2.2 免疫组织化学 鼻咽癌石蜡切片经脱蜡、水化后,用含0.3%H2O2的甲醇处理30 min。水洗数次,PBS洗5 min。加1%猪血清,30 min后吸去猪血清,加1∶1 000的一抗(免抗人Kappa或Lambda),4 ℃过夜。加HRP标记的猪抗免IgG于室温30 min,PBS洗二次,用DAB.H2O2显色5~30 min,自来水冲洗,然后衬染、脱水、透明、封片。

    1.2.3 HE染色 按常规进行。

    2 结果

    2.1 人鼻咽癌细胞株

    人鼻咽癌细胞株CNE2的蛋白提取物,分别加样10 μg,20 μg,30 μg于SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳,以生物素标记的SDS-PAGE蛋白质分子量标志物为标准共同电泳,进行Western免疫印迹分析,用抗Kappa抗体进行检测,在31 Kd处可见到一条特异的蛋白质带,而相同的样品,使用抗Lambda抗体,则未见到这一特异带型(图1)。
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    图1 鼻咽癌细胞株CNE2中Kappa样蛋白的检测

    1:10 μg;2:20 μg;3:30 μg

    A:兔抗人Kappa抗体;B:兔抗人Lambda抗体

    2.2 鼻咽癌活检标本

    加样50 μg蛋白质于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,Western免疫印迹进行分析,用抗Kappa抗体检测时,在31 Kd处也检测到一条特异带,而用抗Lambda抗体,在相同标本中未检测到阳性信号(图2)。

    图2 鼻咽癌活检标本中Kappa样蛋白的检测

    1~7号为不同的鼻咽癌活检标本
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    A:兔抗人Kappa抗体;B:兔抗人Lambda抗体

    2.3 鼻咽癌切片标本

    免疫组化分析结果显示,在鼻咽癌石蜡切片中,低分化鳞癌组织中部分癌细胞抗Kappa抗体呈阳性,阳性信号定位清晰,呈棕色细颗粒状,约占癌细胞总数的10%,绝大多数细胞呈阴性。而使用抗Lambda抗体,所有细胞均呈阴性(图3)。

    图3 鼻咽癌石蜡切片的免疫组化研究

    A:兔抗人Kappa抗体;B:兔抗人Lambda抗体;C:阴性对照

    3 讨论

    通过对人鼻咽癌发病的分子机理研究,发现了一系列与鼻咽癌有关的基因表达异常,包括某些原癌基因与肿瘤抑制基因。曹亚等早先报道的从鼻咽癌细胞株CNE2中克隆的,与鼻咽癌有关的转化基因Tx,经过DNA序列分析,同源性比较,证实了Tx基因就是免疫球蛋白轻链Kappa基因。Northern印迹杂交分析,可以检测到一条1.3 Kb的mRNA杂交带。原位分子杂交在鼻咽癌细胞株中检测到阳性信号,而Hela细胞则没有阳性信号。为了检测鼻咽癌细胞株和鼻咽癌组织中是否存在Kappa蛋白,同时也是为了检测在上述组织、细胞中是否还有别的免疫球蛋白轻链基因(如Lambda基因)的表达,本文用抗Kappa蛋白和抗Lambda蛋白抗体,使用Western免疫印迹和免疫组化技术,分别对上述样品进行了检测。结果如图1、图2及图3所示。不管是Western免疫印迹还是免疫组化,这些样品中都只检测到Kappa蛋白的存在,而未见到Lambda蛋白阳性信号,表明在鼻咽癌细胞中并非所有的免疫球蛋白基因都异常表达。我们还检测到鼻咽癌细胞中Kappa蛋白的分子量为31 Kd。
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    在多发性骨髓瘤中,常常见到免疫球蛋白基因的异常表达。在这类患者的血清及尿液中检测到的Bence-Jones蛋白,实际上就是免疫球蛋白轻链的表达产物,包括Kappa和Lambda两种轻链蛋白[7]。Bence-Jones蛋白的分子量为24Kd,而在鼻咽癌细胞株中检测到的Kappa样蛋白的分子量为31Kd,明显大于Bence-Jones蛋白,表明鼻咽癌细胞中的这种蛋白不是单纯的Kappa基因表达产物,而可能是Kappa基因C区与其它基因融合后的蛋白产物。由于所用抗体对免疫球蛋白的轻链C区是特异的,故用抗Kappa抗体能检测到特异的信号。

    从鼻咽癌组织石蜡切片的免疫组化研究中,只检测到癌组织中约10%的细胞呈阳性反应,所检测的鼻咽癌切片标本均为低分化鳞癌。一种可能的解释是,Kappa基因的表达可能仅发生在这些癌细胞的细胞周期某一时相,故呈阳性反应,而大多数细胞仍处于其它时相,故呈阴性。现在很难断定哪一时相表达这种蛋白质。

    致谢
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    本工作得到Dr.Gazitt Y(University of Texas Health Science Center at San Antonio,Texas,USA)的大力支持与帮助,在此表示诚致的谢意。

    参 考 文 献

    1,Sun Y.Molecular oncology of human nasophanyngeal carcinoma.The cancer Journal,1995;8:325

    2,谢 奕,姚开泰,胡维新.鼻咽癌、宫颈癌和肺癌中p53基因突变和表达的对比研究.中华病理学杂志,1997;26:229

    3,Schmidt CW,Micko IS.The ecology and pathology of epstein Barr virus.Immol cell Biol,1995;73:489
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    4,Cao Y,et al.Isolation and partial characterization of a transformation-associated sequence from human nasopharyngeal carcinoma.Mol Carcinogenesis,1991;4:297

    5,胡维新,曹 亚,黎民敬,等.人类鼻咽癌细胞株CNE2的转化基因Tx的一个EcoRI片段的核苷酸序列分析.生物化学杂志,1993;9:331

    6,胡维新,曹 亚,李晓艳,等.Tx基因Ig K基因的同源性研究及其在不同细胞株的表达.生物化学,生物物理学报,1995;27:215

    7,Makoto Tsunenaga,et al.Unpolidng and refolidng of a type K immunoglobulin light chain and its variable and constant fragments.Biochemistry,1987;26:6044

    收稿1999-09-11, http://www.100md.com