砷剂治疗恶性血液病的研究进展
作者：吕书晴 许小平
单位：吕书晴(第二军医大学长海医院血液科上海，200433)；许小平(第二军医大学长海医院血液科上海，200433)
关键词：
临床血液学杂志000426 砷化物治疗肿瘤已有数百年的历史。1865年Lissauer首先用亚砷酸钾治疗慢性粒细胞白血病。哈尔滨医科大学第一附属医院自1992年起单用As2O3治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promye-locytic leukemia，APL)取得良好效果，完全缓解率达65%。对复发、难治病例亦有良好疗效，且与维甲酸(retinoic acid，RA)无交叉耐药〔1〕。
1 砷剂治疗APL的两种作用及其机制
95%以上APL病例有t(15;17)染色体易位。15号染色体上的早幼粒白血病(promyelocytic leukemia,PML)基因编码的PML蛋白是一转录因子，其N-端有3个半胱氨酸富集区,具生长和转化抑制活性，位于核内的PML核小体(nuclear bodies，NBs) 区，免疫荧光染色表明其在核内呈散点状分布。维甲酸α受体(RARα由17号染色体上的RARα基因编码。RARα与RA结合后可启动靶基因转录，促进细胞分化。在APL细胞中，t(15;17)易位产生PML-RARα融合蛋白，免疫荧光染色呈弥漫性微点状分布。PML的特异定位消失阻碍其发挥生长抑制作用，导致细胞增殖失控。体外研究及PML-RARα转基因鼠体内研究证实，PML-RARα融合蛋白可以阻止粒细胞分化、激发白血病〔2〕。
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Chen等〔3～4〕报道As2O3能诱导APL细胞和APL衍生的NB4细胞部分分化，并诱导凋亡。在As2O3浓度为0.1～2.0 μmol/L时都能观察到PML-RARα融合蛋白的迅速下调并降解，推测As2O3的两种作用与PML-RARα融合蛋白降解有关。As2O3对APL细胞的作用具剂量和时间依赖性：在相对高浓度时(0.5～2.0 μmol/L) 诱导凋亡，在低浓度(0.1～0.5 μmol/L) 时诱导其部分分化。在体内，As2O3对APL的治疗作用是两者的结合，白血病细胞在前2周部分分化成熟，随后进入凋亡。那么As2O3是通什么机制实现其诱导分化和凋亡作用的呢?研究表明，PML-RARα不仅能阻断细胞分化，而且可以抑制细胞因子撤退激发的细胞凋亡。体内外研究表明，在APL细胞和NB4细胞中，As2O3能调节APL细胞和NB4细胞中PML/PML-RARα分布，使其恢复正常的散点状分布，并迅速激发PML-RARα及PML蛋白降解。在RA耐药的MR2亚细胞系，As2O3处理后，PML-RARα降解，PML蛋白分布恢复正常，细胞出现分化和凋亡，说明As2O3的作用机制与RA有所不同。RA通过与RARα结合起作用，而As2O3通过与PML蛋白结合起作用， PML蛋白和PML- RARα对As2O3的高度敏感性在于其富含半胱氨酸区能与As2O3高亲和力结合。另外，体外研究表明，As2O3能在mRNA水平和蛋白水平有效下调bcl-2的表达，诱导细胞凋亡。另外，As2O3还可能通过与氨基酸残基的-SH结合而直接影响ICE (IL-1β转化酶)等半胱氨酸蛋白酶活性而诱导凋亡。
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2 As2O3和其它药物的协同作用
2.1 RA和As2O3在治疗APL中的协同作用
Gianni等〔5〕分离到一As2O3耐药的NB4细胞系(NB4-ASR) ，As2O3能诱导NB4-ASR部分分化并抑制其生长，但不能诱导其凋亡。NB4-ASR在含As2O3的培养液中，出现PML-RARα融合蛋白降解，但其bcl-2水平没有如亲本NB4细胞那样下调，另外NB4-ASR和NB4细胞内的As2O3的浓度并无差别，说明NB4-ASR的耐凋亡与细胞摄取As2O3的能力及PML- RARα蛋白无关，而与不能下调bcl-2的表达有关。同样，对RA耐药的细胞系(NB4-R1) ，RA能诱导其PML- RARα蛋白降解并有细胞表面标记的变化，但不能诱导其完全分化成熟。因此As2O3或RA诱导的PML- RARα融合蛋白降解是这两种药物诱导早幼粒细胞凋亡或完全分化的前提条件，但不是充分条件，As2O3诱导的凋亡还与bcl-2下调等因素有关。
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APL细胞对RA的诱导分化作用极其敏感，临床缓解率很高。RA处理APL和NB4细胞后，PML- RARα融合蛋白降解，PML蛋白和其它NBs抗原分布恢复正常。As2O3可有效治疗APL患者，包括RA耐药的病例达到完全缓解。As2O3可诱导凋亡(伴有bcl-2蛋白的显著下调和p21的上调，p21可与周期素依赖的激酶结合而抑制细胞凋亡) ，在低浓度时诱导部分分化。As2O3可靶向作用于PML蛋白和PML-RARα蛋白，使其定位分布于NBs区，并可促使这两种蛋白降解。RA和As2O3分别靶向作用于融合蛋白的RARα和PML蛋白部分，并且都诱导其解降，两者无交叉耐药。RA能诱导NB4和NB4-ASR细胞STAT(信号传导和转录激活因子)1α合成、IFN-α分泌和p21表达上调。NB4-ASR在RA和As2O3联合处理后，分化加速，并且有显著的凋亡。这种凋亡可能与细胞终末分化有关，RA亦可能直接诱导经As2O3预激的细胞凋亡(经RXR介导的凋亡)。As2O3诱导的凋亡在RA耐药的NB4-R1(bcl-2高表达)细胞系中出现得更快，这种凋亡可能与p21表达上调有关。另外，RA和As2O3对NB4细胞在诱导分化和凋亡方面都有协同作用，除了在诱导PML- RARα蛋白降解和调节p21、bcl-2表达水平方面的协同作用，As2O3还能改变RARα和其它涉及RA转导通路的蛋白的磷酸化状态而起协同作用，对一个药物耐药者仍对另一药物敏感，说明两者有联合应用的前景。
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2.2 As2O3和IFN-α在成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)中的协同作用
Bazarbachi等〔6〕报道As2O3和IFN-α协同应用可诱导HTLV-1转化的细胞凋亡。成人T细胞白血病/淋巴瘤 (ATL) 是与HTLV-1转化相关的成熟CD4+T细胞恶性增殖性疾病，因为免疫功能严重受抑，而且白血病细胞对化疗药物原发耐药，所以预后极差。抗病毒药物AZT和IFN-α协同应用对ATL有一定疗效。HTLV-1的转录激活剂，具转化潜能的Tax蛋白特异性地使与PML/NBs相关的int-6蛋白定位分布异常，而PML/NBs的定位分布与抗增殖作用相关， As2O3能靶向性将PML蛋白和PML- RARα导入特异的NBs区，因此考虑As2O3可能对ATL有治疗作用。体外实验证明As2O3 能明显抑制ATL衍生的细胞和新鲜分离的ATL细胞生长，并诱导细胞凋亡；As2O3和IFN-α联合应用有明显的协同作用，其具体作用机制不清，可能原因为 ：IFN-α是PML基因的直接激活剂，能增加PML的表达，而As2O3 靶向促使PML蛋白定位于NBs区，并可能因此纠正int-6的分布。
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2.3 谷胱甘肽氧化还原系统调节As2O3的作用及As2O3和抗坏血酸的协同作用
Dai等〔7〕研究发现细胞内GSH浓度对As2O3诱导的凋亡具决定性作用。GSH、半胱氨酸、二巯基化物如二巯基丙醇等可抵抗As2O3的毒性作用，表明As2O3的毒性来自对调节蛋白的巯基簇的可逆性结合。GSH是细胞内主要的自动氧化物质。GSH可和亚砷酸结合形成短暂的AS(GS3)复合体以阻止砷剂攻击靶目标，因此GSH氧化还原系统可以调节砷剂的作用。亚砷酸盐可诱导CHO细胞凋亡，耐H2O2的CHO细胞系反应较弱，触酶缺乏的CHO细胞系却高度敏感，提示H2O2可能是砷剂诱导凋亡的一个重要介质。As2O3对NB4、su-DHL-4(bcl-2高表达的B细胞淋巴瘤)、HL60细胞的生长抑制和凋亡作用与其细胞内GSH浓度逆相关；而在su-DHL-4中没有观察到bcl-2表达下调，表明As2O3诱导的bcl-2表达下调可能存在细胞特异性。用N-乙酰半胱氨酸或硫辛酸增加细胞内GSH浓度可阻断As2O3诱导的凋亡，而两者并不抑制或仅轻度抑制PML-RARα蛋白的降解，亦说明PML-RARα蛋白的降解不是As2O3诱导凋亡的充分条件。用-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂降低细胞内GSH浓度使细胞对As2O3的敏感性增加。GSH和H2O2之间的平衡决定As2O3对白血病细胞的凋亡作用。
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抗坏血酸能降低HL-60和su-DHL-4细胞内GSH浓度并增强As2O3的生长抑制和诱导凋亡作用。其机制是抗坏血酸的自动氧化导致了H2O2的产生，而H2O2能增强As2O3的作用，触酶能消除抗坏血酸与As2O3的协同作用。As2O3和抗坏血酸对慢性淋巴细胞白血病细胞亦有协同作用。As2O3能抑制两种人乳腺癌细胞系(MDA-MB-468、T47D) 的生长，抗坏血酸能增强As2O3的这种抑制作用；而正常的人乳腺成纤维细胞和人胚胎成纤维细胞对As2O3的耐受性较好，且抗坏血酸与As2O3亦无明显协同作用。为观察As2O3和抗坏血酸对正常造血细胞的作用，将骨髓和外周血单个核细胞在含As2O3、抗坏血酸及As2O3加抗坏血酸的培养液中培养两周，发现1 μmol/L As2O3能抑制约60%的CFU-E，而对CFU-GM和BFU-E的集落形成能力无明显影响，抗坏血酸(<500 μmol/L) 对集落形成无抑制作用，亦不增强As2O3对CFU-GM和BFU-E的抑制作用，但抗坏血酸在500 μmol/L高浓度时能增强As2O3对CFU-E的抑制作用。以上结果表明恶性细胞比正常细胞对As2O3和抗坏血酸的联合处理更敏感。小鼠体内研究亦证实抗坏血酸能增强As2O3的抗淋巴瘤作用，而没有增加毒性。抗坏血酸的这种选择作用可能与一些恶性细胞内触酶浓度较低有关，因此联合应用低浓度的As2O3和抗坏血酸，有可能选择性诱导这些恶性细胞凋亡而对正常组织细胞无严重的毒性作用。细胞内GSH浓度较低或GST酶活性较低的肿瘤细胞对As2O3或As2O3联合应用抗坏血酸更敏感。
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3 As2O3和有机砷Melarsoprol以非PML- RARα依赖方式诱导凋亡
慢性淋巴细胞白血病是西方最常见的成人白血病类型，研究表明，有机砷Melarsoprol能诱导慢性B淋巴细胞白血病细胞凋亡。Melarsoprol主要用于治疗非洲锥虫病，体外研究表明其对白血病细胞有广泛抑制作用，诱导凋亡是其抗白血病的共同特征。K
nig等〔8〕报道Melarsoprol能显著抑制EB病毒转化的B幼淋巴细胞系(JVM-2) 、慢性B淋巴细胞白血病细胞系(183CLL) 和非EB病毒转化的慢性B淋巴细胞系(WSU-CLL) 的生长并诱导凋亡。其机制为在mRNA和蛋白水平下调bcl-2的表达，而As2O3对这些淋巴细胞系无明显作用。另外〔9〕，As2O3和Melarsoprol能广泛抑制NB4、HL60、U937(单核细胞系) 和RA耐药的NB4-306亚克隆(不表达PML- RARα融合蛋白) 的生长并诱导凋亡，Melarsoprol的作用比As2O3更显著。As2O3能促使PML- RARα或PML蛋白恢复至NBs区,并促使两者降解，而Melarsoprol并不改变PML蛋白或PML- RARα的定位。As2O3和Melarsoprol都能在mRNA和蛋白水平下调上述各细胞系的bcl-2水平，而Melarsoprol的作用比As2O3更显著。通过同源重组敲除鼠胚胎成纤维细胞(MEFs) 和骨髓祖细胞的PML基因并检测砷剂的作用，结果发现As2O3和Melarsoprol能同样抑制PML+/+和PML-/-的MEFs细胞系的生长并诱导凋亡；并能同样抑制PML+/+和PML-/-的鼠骨髓祖细胞的CFU-E及CFU-GM的形成。这些实验结果表明As2O3和Melarsoprol能以PML非依赖方式抑制细胞增殖和诱导凋亡。
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Rousselot等〔10〕报道，As2O3和Melarsoprol能抑制骨髓瘤细胞及其衍生的细胞系的生长并诱导凋亡，IL-6不能阻断这种作用。两者都能抑制PWM诱导的正常B细胞向浆细胞的分化，而Melarsoprol的作用较弱。骨髓瘤细胞和PWM诱导的浆细胞中PML蛋白的核定位分布无异常，As2O3能诱导PML蛋白的降解，而Melarsoprol无此作用。实验结果提示这两种药物可用于治疗多发性骨髓瘤。
4 砷剂治疗的毒副作用
砷化物是一种原浆毒，对体内蛋白质和多种氨基酸具有很强的亲和力，可与多种含巯基的酶结合。急慢性砷中毒可引起溶血、再障、休克、昏迷、肝肾功能衰竭乃至死亡。临床上应用亚砷酸注射液治疗APL，所见毒副作用较轻，且为可逆性，主要表现为轻度肝肾功能损害、消化道症状、胸腹水、皮肤色素沉着等，无严重骨髓抑制、治疗相关性出血及慢性砷中毒。临床副作用较轻的原因可能是与每日用量较小、且静脉用药后迅速与红细胞内珠蛋白结合、并可直接从肾脏排出有关，过多的砷蓄积于毛发和指甲，并随其脱落而排出，而体内蓄积较少〔11〕。
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因此，砷剂有可能广泛用于恶性血液病的治疗，而不是仅仅限于APL的治疗，并且没有严重的毒副作用。
参考文献
[1]张鹏，王树叶，胡龙虎，等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志，1996，17:58～60
[2]Brown D,Kogan S,Lagasse E,et al.A PML RAR alpha transgene initiates murine acute promyelocytic leukemia.Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:2551～2558
[3]Chen G Q,Zhu J,Shi X G,et al.In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment of acute promyelocytic leukemia:As2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RAR alpha/PML proteins.Blood,1996，88:1052～1061
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[4]Chen G Q,Shi X G,Tang W,et al.Use of arsenic Trioxide(As2O3) in the treatment of acute prom-yelocytic leukemia(APL):I.As2O3 Exerts Dose-Dependent Dual Effects on APL cells.Blood,1997，89:3345～3353
[5]Gianni M,Koken M H M, Chelbi-Alix M K,et al.Combined arsenic and retinoic acid treatment enhances differentiation and apoptosis in arsenic-resistant NB4 cells.Blood,1998,91:4300～4310
[6]Bazarbachi A, el-Sabban M E, Nasr R,et al. Arsenic Trioxide and Interferon-α synergize to induce cell cycle arrest and apoptosis in human T-cell Lymphotropic virus type-I transformed cells. Blood,1999,93:278～283
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[7]Dai J, Weinberg R, Waxman S,et al.Maligant cells can be sensitized to undergo growth inhibition and apoptosis by arsenic trioxide through modulation of the glutathione redox system .Blood,1999,93:268～277
[8]König A,Wrazel L,Warrell-J R Rp,et al.Comparative activity of melarsoprol and arsenic trioxide in chronic B-cell leukemia lines.Blood,1997,90:562～570
[9]Wang Z G,Rivi R,Delva L,et al.Arsenic trioxide and melarsoprol induce programmed cell death in myeloid leukemia cell lines and function in a PML and PML-RAR α independent Manner.Blood,1998,92:1497～1504
[10]Rousselot P, Labaume S, Marollean Jp,et al.Arsenic trioxide and melarsoprol induce apoptosis in plasma cell lines and in plasma cells from myeloma patients. Cancer Research,1999,59:1041～1048
[11]张鹏，胡龙虎，周晋，等. 三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病的机制研究.白血病,1996，5:131～133
(收稿 2000-02-22), http://www.100md.com
单位：吕书晴(第二军医大学长海医院血液科上海，200433)；许小平(第二军医大学长海医院血液科上海，200433)
关键词：
临床血液学杂志000426 砷化物治疗肿瘤已有数百年的历史。1865年Lissauer首先用亚砷酸钾治疗慢性粒细胞白血病。哈尔滨医科大学第一附属医院自1992年起单用As2O3治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promye-locytic leukemia，APL)取得良好效果，完全缓解率达65%。对复发、难治病例亦有良好疗效，且与维甲酸(retinoic acid，RA)无交叉耐药〔1〕。
1 砷剂治疗APL的两种作用及其机制
95%以上APL病例有t(15;17)染色体易位。15号染色体上的早幼粒白血病(promyelocytic leukemia,PML)基因编码的PML蛋白是一转录因子，其N-端有3个半胱氨酸富集区,具生长和转化抑制活性，位于核内的PML核小体(nuclear bodies，NBs) 区，免疫荧光染色表明其在核内呈散点状分布。维甲酸α受体(RARα由17号染色体上的RARα基因编码。RARα与RA结合后可启动靶基因转录，促进细胞分化。在APL细胞中，t(15;17)易位产生PML-RARα融合蛋白，免疫荧光染色呈弥漫性微点状分布。PML的特异定位消失阻碍其发挥生长抑制作用，导致细胞增殖失控。体外研究及PML-RARα转基因鼠体内研究证实，PML-RARα融合蛋白可以阻止粒细胞分化、激发白血病〔2〕。
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Chen等〔3～4〕报道As2O3能诱导APL细胞和APL衍生的NB4细胞部分分化，并诱导凋亡。在As2O3浓度为0.1～2.0 μmol/L时都能观察到PML-RARα融合蛋白的迅速下调并降解，推测As2O3的两种作用与PML-RARα融合蛋白降解有关。As2O3对APL细胞的作用具剂量和时间依赖性：在相对高浓度时(0.5～2.0 μmol/L) 诱导凋亡，在低浓度(0.1～0.5 μmol/L) 时诱导其部分分化。在体内，As2O3对APL的治疗作用是两者的结合，白血病细胞在前2周部分分化成熟，随后进入凋亡。那么As2O3是通什么机制实现其诱导分化和凋亡作用的呢?研究表明，PML-RARα不仅能阻断细胞分化，而且可以抑制细胞因子撤退激发的细胞凋亡。体内外研究表明，在APL细胞和NB4细胞中，As2O3能调节APL细胞和NB4细胞中PML/PML-RARα分布，使其恢复正常的散点状分布，并迅速激发PML-RARα及PML蛋白降解。在RA耐药的MR2亚细胞系，As2O3处理后，PML-RARα降解，PML蛋白分布恢复正常，细胞出现分化和凋亡，说明As2O3的作用机制与RA有所不同。RA通过与RARα结合起作用，而As2O3通过与PML蛋白结合起作用， PML蛋白和PML- RARα对As2O3的高度敏感性在于其富含半胱氨酸区能与As2O3高亲和力结合。另外，体外研究表明，As2O3能在mRNA水平和蛋白水平有效下调bcl-2的表达，诱导细胞凋亡。另外，As2O3还可能通过与氨基酸残基的-SH结合而直接影响ICE (IL-1β转化酶)等半胱氨酸蛋白酶活性而诱导凋亡。
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2 As2O3和其它药物的协同作用
2.1 RA和As2O3在治疗APL中的协同作用
Gianni等〔5〕分离到一As2O3耐药的NB4细胞系(NB4-ASR) ，As2O3能诱导NB4-ASR部分分化并抑制其生长，但不能诱导其凋亡。NB4-ASR在含As2O3的培养液中，出现PML-RARα融合蛋白降解，但其bcl-2水平没有如亲本NB4细胞那样下调，另外NB4-ASR和NB4细胞内的As2O3的浓度并无差别，说明NB4-ASR的耐凋亡与细胞摄取As2O3的能力及PML- RARα蛋白无关，而与不能下调bcl-2的表达有关。同样，对RA耐药的细胞系(NB4-R1) ，RA能诱导其PML- RARα蛋白降解并有细胞表面标记的变化，但不能诱导其完全分化成熟。因此As2O3或RA诱导的PML- RARα融合蛋白降解是这两种药物诱导早幼粒细胞凋亡或完全分化的前提条件，但不是充分条件，As2O3诱导的凋亡还与bcl-2下调等因素有关。
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APL细胞对RA的诱导分化作用极其敏感，临床缓解率很高。RA处理APL和NB4细胞后，PML- RARα融合蛋白降解，PML蛋白和其它NBs抗原分布恢复正常。As2O3可有效治疗APL患者，包括RA耐药的病例达到完全缓解。As2O3可诱导凋亡(伴有bcl-2蛋白的显著下调和p21的上调，p21可与周期素依赖的激酶结合而抑制细胞凋亡) ，在低浓度时诱导部分分化。As2O3可靶向作用于PML蛋白和PML-RARα蛋白，使其定位分布于NBs区，并可促使这两种蛋白降解。RA和As2O3分别靶向作用于融合蛋白的RARα和PML蛋白部分，并且都诱导其解降，两者无交叉耐药。RA能诱导NB4和NB4-ASR细胞STAT(信号传导和转录激活因子)1α合成、IFN-α分泌和p21表达上调。NB4-ASR在RA和As2O3联合处理后，分化加速，并且有显著的凋亡。这种凋亡可能与细胞终末分化有关，RA亦可能直接诱导经As2O3预激的细胞凋亡(经RXR介导的凋亡)。As2O3诱导的凋亡在RA耐药的NB4-R1(bcl-2高表达)细胞系中出现得更快，这种凋亡可能与p21表达上调有关。另外，RA和As2O3对NB4细胞在诱导分化和凋亡方面都有协同作用，除了在诱导PML- RARα蛋白降解和调节p21、bcl-2表达水平方面的协同作用，As2O3还能改变RARα和其它涉及RA转导通路的蛋白的磷酸化状态而起协同作用，对一个药物耐药者仍对另一药物敏感，说明两者有联合应用的前景。
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2.2 As2O3和IFN-α在成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)中的协同作用
Bazarbachi等〔6〕报道As2O3和IFN-α协同应用可诱导HTLV-1转化的细胞凋亡。成人T细胞白血病/淋巴瘤 (ATL) 是与HTLV-1转化相关的成熟CD4+T细胞恶性增殖性疾病，因为免疫功能严重受抑，而且白血病细胞对化疗药物原发耐药，所以预后极差。抗病毒药物AZT和IFN-α协同应用对ATL有一定疗效。HTLV-1的转录激活剂，具转化潜能的Tax蛋白特异性地使与PML/NBs相关的int-6蛋白定位分布异常，而PML/NBs的定位分布与抗增殖作用相关， As2O3能靶向性将PML蛋白和PML- RARα导入特异的NBs区，因此考虑As2O3可能对ATL有治疗作用。体外实验证明As2O3 能明显抑制ATL衍生的细胞和新鲜分离的ATL细胞生长，并诱导细胞凋亡；As2O3和IFN-α联合应用有明显的协同作用，其具体作用机制不清，可能原因为 ：IFN-α是PML基因的直接激活剂，能增加PML的表达，而As2O3 靶向促使PML蛋白定位于NBs区，并可能因此纠正int-6的分布。
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2.3 谷胱甘肽氧化还原系统调节As2O3的作用及As2O3和抗坏血酸的协同作用
Dai等〔7〕研究发现细胞内GSH浓度对As2O3诱导的凋亡具决定性作用。GSH、半胱氨酸、二巯基化物如二巯基丙醇等可抵抗As2O3的毒性作用，表明As2O3的毒性来自对调节蛋白的巯基簇的可逆性结合。GSH是细胞内主要的自动氧化物质。GSH可和亚砷酸结合形成短暂的AS(GS3)复合体以阻止砷剂攻击靶目标，因此GSH氧化还原系统可以调节砷剂的作用。亚砷酸盐可诱导CHO细胞凋亡，耐H2O2的CHO细胞系反应较弱，触酶缺乏的CHO细胞系却高度敏感，提示H2O2可能是砷剂诱导凋亡的一个重要介质。As2O3对NB4、su-DHL-4(bcl-2高表达的B细胞淋巴瘤)、HL60细胞的生长抑制和凋亡作用与其细胞内GSH浓度逆相关；而在su-DHL-4中没有观察到bcl-2表达下调，表明As2O3诱导的bcl-2表达下调可能存在细胞特异性。用N-乙酰半胱氨酸或硫辛酸增加细胞内GSH浓度可阻断As2O3诱导的凋亡，而两者并不抑制或仅轻度抑制PML-RARα蛋白的降解，亦说明PML-RARα蛋白的降解不是As2O3诱导凋亡的充分条件。用-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂降低细胞内GSH浓度使细胞对As2O3的敏感性增加。GSH和H2O2之间的平衡决定As2O3对白血病细胞的凋亡作用。
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抗坏血酸能降低HL-60和su-DHL-4细胞内GSH浓度并增强As2O3的生长抑制和诱导凋亡作用。其机制是抗坏血酸的自动氧化导致了H2O2的产生，而H2O2能增强As2O3的作用，触酶能消除抗坏血酸与As2O3的协同作用。As2O3和抗坏血酸对慢性淋巴细胞白血病细胞亦有协同作用。As2O3能抑制两种人乳腺癌细胞系(MDA-MB-468、T47D) 的生长，抗坏血酸能增强As2O3的这种抑制作用；而正常的人乳腺成纤维细胞和人胚胎成纤维细胞对As2O3的耐受性较好，且抗坏血酸与As2O3亦无明显协同作用。为观察As2O3和抗坏血酸对正常造血细胞的作用，将骨髓和外周血单个核细胞在含As2O3、抗坏血酸及As2O3加抗坏血酸的培养液中培养两周，发现1 μmol/L As2O3能抑制约60%的CFU-E，而对CFU-GM和BFU-E的集落形成能力无明显影响，抗坏血酸(<500 μmol/L) 对集落形成无抑制作用，亦不增强As2O3对CFU-GM和BFU-E的抑制作用，但抗坏血酸在500 μmol/L高浓度时能增强As2O3对CFU-E的抑制作用。以上结果表明恶性细胞比正常细胞对As2O3和抗坏血酸的联合处理更敏感。小鼠体内研究亦证实抗坏血酸能增强As2O3的抗淋巴瘤作用，而没有增加毒性。抗坏血酸的这种选择作用可能与一些恶性细胞内触酶浓度较低有关，因此联合应用低浓度的As2O3和抗坏血酸，有可能选择性诱导这些恶性细胞凋亡而对正常组织细胞无严重的毒性作用。细胞内GSH浓度较低或GST酶活性较低的肿瘤细胞对As2O3或As2O3联合应用抗坏血酸更敏感。
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3 As2O3和有机砷Melarsoprol以非PML- RARα依赖方式诱导凋亡
慢性淋巴细胞白血病是西方最常见的成人白血病类型，研究表明，有机砷Melarsoprol能诱导慢性B淋巴细胞白血病细胞凋亡。Melarsoprol主要用于治疗非洲锥虫病，体外研究表明其对白血病细胞有广泛抑制作用，诱导凋亡是其抗白血病的共同特征。K
nig等〔8〕报道Melarsoprol能显著抑制EB病毒转化的B幼淋巴细胞系(JVM-2) 、慢性B淋巴细胞白血病细胞系(183CLL) 和非EB病毒转化的慢性B淋巴细胞系(WSU-CLL) 的生长并诱导凋亡。其机制为在mRNA和蛋白水平下调bcl-2的表达，而As2O3对这些淋巴细胞系无明显作用。另外〔9〕，As2O3和Melarsoprol能广泛抑制NB4、HL60、U937(单核细胞系) 和RA耐药的NB4-306亚克隆(不表达PML- RARα融合蛋白) 的生长并诱导凋亡，Melarsoprol的作用比As2O3更显著。As2O3能促使PML- RARα或PML蛋白恢复至NBs区,并促使两者降解，而Melarsoprol并不改变PML蛋白或PML- RARα的定位。As2O3和Melarsoprol都能在mRNA和蛋白水平下调上述各细胞系的bcl-2水平，而Melarsoprol的作用比As2O3更显著。通过同源重组敲除鼠胚胎成纤维细胞(MEFs) 和骨髓祖细胞的PML基因并检测砷剂的作用，结果发现As2O3和Melarsoprol能同样抑制PML+/+和PML-/-的MEFs细胞系的生长并诱导凋亡；并能同样抑制PML+/+和PML-/-的鼠骨髓祖细胞的CFU-E及CFU-GM的形成。这些实验结果表明As2O3和Melarsoprol能以PML非依赖方式抑制细胞增殖和诱导凋亡。, http://www.100md.com
Rousselot等〔10〕报道，As2O3和Melarsoprol能抑制骨髓瘤细胞及其衍生的细胞系的生长并诱导凋亡，IL-6不能阻断这种作用。两者都能抑制PWM诱导的正常B细胞向浆细胞的分化，而Melarsoprol的作用较弱。骨髓瘤细胞和PWM诱导的浆细胞中PML蛋白的核定位分布无异常，As2O3能诱导PML蛋白的降解，而Melarsoprol无此作用。实验结果提示这两种药物可用于治疗多发性骨髓瘤。
4 砷剂治疗的毒副作用
砷化物是一种原浆毒，对体内蛋白质和多种氨基酸具有很强的亲和力，可与多种含巯基的酶结合。急慢性砷中毒可引起溶血、再障、休克、昏迷、肝肾功能衰竭乃至死亡。临床上应用亚砷酸注射液治疗APL，所见毒副作用较轻，且为可逆性，主要表现为轻度肝肾功能损害、消化道症状、胸腹水、皮肤色素沉着等，无严重骨髓抑制、治疗相关性出血及慢性砷中毒。临床副作用较轻的原因可能是与每日用量较小、且静脉用药后迅速与红细胞内珠蛋白结合、并可直接从肾脏排出有关，过多的砷蓄积于毛发和指甲，并随其脱落而排出，而体内蓄积较少〔11〕。
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因此，砷剂有可能广泛用于恶性血液病的治疗，而不是仅仅限于APL的治疗，并且没有严重的毒副作用。
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(收稿 2000-02-22), http://www.100md.com