急性白血病受体基因重排的研究
作者：乌庆超 赵岐刚 马怀青 王伟华 袁立斌 张颖新 王凤菊
单位：乌庆超(聊城市人民医院内科山东聊城，252000)；赵岐刚(聊城市人民医院中心实验室)；马怀青(聊城市人民医院内科山东聊城，252000)；王伟华(聊城市人民医院中心实验室)；袁立斌(聊城市人民医院中心实验室)；张颖新(聊城市人民医院中心实验室)；王凤菊(聊城市人民医院中心实验室)
关键词：白血病；急性；残留病细胞；基因重排
临床血液学杂志000410 摘要 目的：探讨急性白血病微小残留病(MRD)与化疗效应差异及受体基因重排，在急性非淋巴细胞白血病(ANLL)中序列交叉现象及意义。方法：应用聚合酶链反应技术对免疫球蛋白(IgH)及T细胞受体(TCR)基因重排进行定量测定。结果：45例急性淋巴细胞白血病(ALL)中阳性率84.4%(38/45)，完全缓解(CR)后180 d检测，阳性率仍55.6%(25/45)，20例ANLL中5例检测到IgH受体基因重排，观察60 d有复发迹象，但白细胞数持续<1×105，无复发。结论：IgH、TCR基因重排是检测残留白血病的敏感指标，但在ANLL中有失真现象。化疗效应的定量评价，有助于制定个体化的治疗方案。
, 百拇医药
Study on rearrangements of genes in acute leukemia
WU Qing-chao MA Huai-qing
(Department of Internal Medicince,People Hospital Shandong Liaocheng, Shandong Liaocheng 252000)
ZHAO Qi-gang WANG Wei-hua YUAN Li-bin ZHANG Ying-xin WANG Feng-ju
(Department of Laboratory,People Hospital Shandong Liaocheng)
Abstract Objective:To explore minimal residual disease(MRD) of acute leukemia and evaluation of chem otherapy efficiency and the mechanism of infidelity of gene rearrangements in acute nonlymphocytic leukemia.Method:Immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangement were studied in 45 patients with acute leukemia and 20 acute nonlymphocytic leukemia in various stages by polymerase chain reactcon.Result:This method was sensitive to malignancy in a background of 105 normal cells.In 45 Acute lymphocytic leukemia patients the positive rate is 84.4%,which remained 55.6% 180 days after complete remission .Immunoglobulin heavy chain gene rearrangements were detected in 5 of 20 patients,one of whom in complete remission was found to have tendency of relapse 180 days later.In some patients in remission,the amount of leukemia cells persistently under 1×105 without clinical relapse.Conclusion:The IgH and TcR gene rearrangement are highly specific and sensitive indicators of MRD.Lineage infidelity of immunoglobulin gene rearrangements does exist in acute nonlymphocytic leukemia.Quantitative evaluation of the chemotherapy effect is helpful for individualized treatment.
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Key words Leukemia,acute Residual leukemia cell Gene rearrangement
微小残留病(MRD)是急性白血病(AL)缓解后复发的重要原因，检测残留白血病，以采取正确的个体化治疗方案是今后探讨的新课题。国外已进行了敏感的T、B及浆细胞TCR、IgH受体基因检测方法，并发现急性非淋巴细胞白血病(ANLL)中也存在受体基因重排，即失真现象。为此我们应用聚合酶链反应技术对65例患者89份标本进行受体基因重排研究。
1 资料与方法
1.1 病例选择
按FAB分型标准，89份标本中急性淋巴细胞白血病(ALL)45例，其中L118例、L220例、L37例；ANLL20例，其中M13例、M25例、M36例、M43例、M53例。标本取自患者骨髓或外周血，对照组用正常人骨髓标本。
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1.2 DNA提取
经肝素抗凝的新鲜骨髓1～2 ml或外周血2～3 ml，用饱和盐析抽提法提取DNA〔1〕。
1.3 引物及PCR
1.3.1 IgH基因重排引物：为第3互补决定区CDR-Ⅲ靶序列，引物为其VJ端第3框架区保守序列互补的寡核苷酸片段，有义链：5′-TTCAAGGT-
GCGCCTGCAGGA-3′，反义链：5′-AGACAAAG-CAAGGCTTGTAGATGT-3′。
1.3.2 TCR基因重排引物：按Le Franc等〔2〕所
述引物V区，有义链：5′-AGCTGATCCGCGAGC-
, 百拇医药
GCGTG-3′，反义链：5′-CAGCCCTCACAGGCGC-
TGAC-3′。
1.3.3 聚合酶链反应：按Saiki等〔3〕的方法，25 μ1反应体系，加入Taq酶1 U，DNA模板50～100 ng，按94 ℃预变性2 min，92 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。
1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染保存
参照文献〔4〕的方法，取PCR产物8 μl，10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，银染采用乙醇浓缩，硝酸银染色，封膜干燥保存。
2 结果
2.1 IgH及TCR基因重排结果
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45例ALL标本经扩增IgH CDR-Ⅲ后有27例为阳性，阳性率60.0%。阳性的判断标准为经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染后，在80～120 bp左右出现1～2条特异性清晰条带，并有参差不齐现象，表明IgH基因重排的个体差异即多态性。
45例ALL标本中TCR阳性者11例，阳性率24.4%。阳性标准为在400 bp左右有一特异性致密条带。另34例则是模糊、散发性条带，为多克隆重排现象。
20例ANLL患者标本中，出现IgH基因重排5例，占25.0%，其中3例为初治患者。FAB分型为M2、M4、M5各1例，M32例。发生IgH重排的标本表现为PCR产物出现特异性区带，大小约110 bp。不同患者，其区带数目、位置及宽度略有差异，即多态性。
2.2 白血病缓解期治疗效应的定量评价
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32例患者在临床完全缓解后随访时间的中位数为22.5个月(2～32个月)，共收集68份标本，其中35份于缓解后不同时期检测出残留白血病细胞，5例患者持续阳性，观察中位数210 d(180～240 d)，临床复发。在缓解后的早期，临床缓解时PCR检测阴性病例的白血病细胞数目明显低于临床缓解时PCR检测阳性的病例。临床完全缓解时32例PCR阴性检测结果，残留白血病细胞数小于1×105，检测PCR阳性的18例白血病细胞数均大于280×105，而对长期临床缓解的患者，残留白血病细胞数量无显著差异。
3 讨论
MRD是引起白血病复发的主要原因，敏感特异的检测和清除MRD是白血病研究的一大热点。PCR方法由于敏感、特异、重复性好而广泛应用于MRD检测。作为白血病克隆特异性标志的IgH和TCR基因重排，在本组的45例ALL中阳性率为84.4%(38/45)，IgH阳性率(60.0)%明显高于TCR阳性率(24.4%)。在IgH基因重排中，由于V-D-J片段之间重排概率大，加之V区的插入，而呈现多态性〔5〕，即表现在电泳之后阳性条带在80～120 bp上下参差不齐的现象，而在T细胞受体表现不明显，这可能与TCRV区较少有关。正常人IgH及TCR基因呈现多克隆V-D-J重排，电泳后无特异性条带或出现很浅的模糊条带，可见IgH和TCR重排可作为白血病分化标志。
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通常认为，IgH基因重排是B细胞集落的序列和克隆性标志，Ig在B细胞肿瘤中有很高频率(约90%)的基因重排〔6〕。而近年来发现Ig基因重排也可发生于其他分化序列的细胞上，如Ig基因重排可出现在AML中〔7〕，即序列交叉现象。本研究采用PCR方法，检测了不同时期ANLL患者IgH基因重排，结果5例(25.0%)有Ig重排现象，且重排与FAB分型之间无相关性，形成原因可能为交叉重排的细胞起源于多潜能干细胞，它可同时表达几种序列的标志，随着细胞的定向分化，这种重排仍然存在。鉴于这种序列交叉现象，可以认为Ig基因重排可能并不能作为ALL诊断的绝对可靠标志。
诱导缓解治疗的效应对缓解期患者体内的残留白血病细胞数量有明显影响。在诱导缓解治疗阶段白血病细胞负荷消减2～3个对数级，残留白血病细胞>280×105的患者，缓解后早期残留白血病细胞的数量较高，且有较高的复发危险性，PCR检测转阴率较低。而临床缓解后获得5个对数级以上杀伤效应的患者，33.3%的残留白血病细胞检测长期持续阴性且无临床复发，此类患者如果在临床上仍采取较强的化疗方案，可能会给患者带来许多不必要的化疗副反应。大剂量化疗对AL的主要作用是减少白血病细胞负荷，而不能消除MRD〔8〕，但5个对数级以上的负荷清除是可以明显减少MRD量，增加PCR转阴率及减少临床复发机率。故在AL诱导缓解治疗中，应以大剂量、足疗程、密集的方案最大限度地杀灭白血病细胞，以达到5个对数级(残留白血病细胞数小于1×105)以上的杀伤效应，而对于长期持续缓解PCR阴性患者应避免强化疗，宜采用其它对MRD敏感的方法。
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参考文献
[1]Miller S A,Dykes D D,Polesky H F.A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleate cells.Nucleic Acios Res,1988,16:1215～1225
[2]Le Franc M P,Forster A,Baer R,et al.Dirersity and rearrangement of the human T cell rearranging genes,nine geneline variable genes belonging to subgroups cell.Science,1986,45:273～278
[3]Saiki R K,Gelfand D H,Stoffel S,et al.Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.Science.1988,239:487～496
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[4]薛海鹏，朱平，武淑兰，等.聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染及保存.中国优生与遗传学杂志，1996，4：22～35
[5]Daris T H,Rockey C E,Ballk S D,et al.Detetion of clonal immunoglobulin gene roarrangement by polymelse chain reaction amplification and single-strand conformation polymorphism analysis.Am J Pathol,1993,142:1841～1848
[6]Oster W,Konig K L,Iudwig W D,et al,Incidence of Iineage promiscuity in acute myeloblastic leukemia;diagnostic implication of immunoglobulin and T cell receptor gene rearragement analysis and immunological phenotyping.Leuk Res,1988,12:887～893
, 百拇医药
[7]Bernard D,Bignon Y J,Lavenue F,et al.Lineage promiscuity in leukemia studies of T cell receptor and immunological genes.Leuk Res,1993,17:445～457
[8]Dwenger A,Lindemann A,Metelsmann R.Minimal residual disease:detection,clinical relerance,and treatment strategies.J Hematother,1996,5:537～548
(收稿 1999-08-21), 百拇医药
单位：乌庆超(聊城市人民医院内科山东聊城，252000)；赵岐刚(聊城市人民医院中心实验室)；马怀青(聊城市人民医院内科山东聊城，252000)；王伟华(聊城市人民医院中心实验室)；袁立斌(聊城市人民医院中心实验室)；张颖新(聊城市人民医院中心实验室)；王凤菊(聊城市人民医院中心实验室)
关键词：白血病；急性；残留病细胞；基因重排
临床血液学杂志000410 摘要 目的：探讨急性白血病微小残留病(MRD)与化疗效应差异及受体基因重排，在急性非淋巴细胞白血病(ANLL)中序列交叉现象及意义。方法：应用聚合酶链反应技术对免疫球蛋白(IgH)及T细胞受体(TCR)基因重排进行定量测定。结果：45例急性淋巴细胞白血病(ALL)中阳性率84.4%(38/45)，完全缓解(CR)后180 d检测，阳性率仍55.6%(25/45)，20例ANLL中5例检测到IgH受体基因重排，观察60 d有复发迹象，但白细胞数持续<1×105，无复发。结论：IgH、TCR基因重排是检测残留白血病的敏感指标，但在ANLL中有失真现象。化疗效应的定量评价，有助于制定个体化的治疗方案。
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Study on rearrangements of genes in acute leukemia
WU Qing-chao MA Huai-qing
(Department of Internal Medicince,People Hospital Shandong Liaocheng, Shandong Liaocheng 252000)
ZHAO Qi-gang WANG Wei-hua YUAN Li-bin ZHANG Ying-xin WANG Feng-ju
(Department of Laboratory,People Hospital Shandong Liaocheng)
Abstract Objective:To explore minimal residual disease(MRD) of acute leukemia and evaluation of chem otherapy efficiency and the mechanism of infidelity of gene rearrangements in acute nonlymphocytic leukemia.Method:Immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangement were studied in 45 patients with acute leukemia and 20 acute nonlymphocytic leukemia in various stages by polymerase chain reactcon.Result:This method was sensitive to malignancy in a background of 105 normal cells.In 45 Acute lymphocytic leukemia patients the positive rate is 84.4%,which remained 55.6% 180 days after complete remission .Immunoglobulin heavy chain gene rearrangements were detected in 5 of 20 patients,one of whom in complete remission was found to have tendency of relapse 180 days later.In some patients in remission,the amount of leukemia cells persistently under 1×105 without clinical relapse.Conclusion:The IgH and TcR gene rearrangement are highly specific and sensitive indicators of MRD.Lineage infidelity of immunoglobulin gene rearrangements does exist in acute nonlymphocytic leukemia.Quantitative evaluation of the chemotherapy effect is helpful for individualized treatment.
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Key words Leukemia,acute Residual leukemia cell Gene rearrangement
微小残留病(MRD)是急性白血病(AL)缓解后复发的重要原因，检测残留白血病，以采取正确的个体化治疗方案是今后探讨的新课题。国外已进行了敏感的T、B及浆细胞TCR、IgH受体基因检测方法，并发现急性非淋巴细胞白血病(ANLL)中也存在受体基因重排，即失真现象。为此我们应用聚合酶链反应技术对65例患者89份标本进行受体基因重排研究。
1 资料与方法
1.1 病例选择
按FAB分型标准，89份标本中急性淋巴细胞白血病(ALL)45例，其中L118例、L220例、L37例；ANLL20例，其中M13例、M25例、M36例、M43例、M53例。标本取自患者骨髓或外周血，对照组用正常人骨髓标本。
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1.2 DNA提取
经肝素抗凝的新鲜骨髓1～2 ml或外周血2～3 ml，用饱和盐析抽提法提取DNA〔1〕。
1.3 引物及PCR
1.3.1 IgH基因重排引物：为第3互补决定区CDR-Ⅲ靶序列，引物为其VJ端第3框架区保守序列互补的寡核苷酸片段，有义链：5′-TTCAAGGT-
GCGCCTGCAGGA-3′，反义链：5′-AGACAAAG-CAAGGCTTGTAGATGT-3′。
1.3.2 TCR基因重排引物：按Le Franc等〔2〕所
述引物V区，有义链：5′-AGCTGATCCGCGAGC-
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GCGTG-3′，反义链：5′-CAGCCCTCACAGGCGC-
TGAC-3′。
1.3.3 聚合酶链反应：按Saiki等〔3〕的方法，25 μ1反应体系，加入Taq酶1 U，DNA模板50～100 ng，按94 ℃预变性2 min，92 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。
1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染保存
参照文献〔4〕的方法，取PCR产物8 μl，10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，银染采用乙醇浓缩，硝酸银染色，封膜干燥保存。
2 结果
2.1 IgH及TCR基因重排结果
, 百拇医药
45例ALL标本经扩增IgH CDR-Ⅲ后有27例为阳性，阳性率60.0%。阳性的判断标准为经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染后，在80～120 bp左右出现1～2条特异性清晰条带，并有参差不齐现象，表明IgH基因重排的个体差异即多态性。
45例ALL标本中TCR阳性者11例，阳性率24.4%。阳性标准为在400 bp左右有一特异性致密条带。另34例则是模糊、散发性条带，为多克隆重排现象。
20例ANLL患者标本中，出现IgH基因重排5例，占25.0%，其中3例为初治患者。FAB分型为M2、M4、M5各1例，M32例。发生IgH重排的标本表现为PCR产物出现特异性区带，大小约110 bp。不同患者，其区带数目、位置及宽度略有差异，即多态性。
2.2 白血病缓解期治疗效应的定量评价
, http://www.100md.com
32例患者在临床完全缓解后随访时间的中位数为22.5个月(2～32个月)，共收集68份标本，其中35份于缓解后不同时期检测出残留白血病细胞，5例患者持续阳性，观察中位数210 d(180～240 d)，临床复发。在缓解后的早期，临床缓解时PCR检测阴性病例的白血病细胞数目明显低于临床缓解时PCR检测阳性的病例。临床完全缓解时32例PCR阴性检测结果，残留白血病细胞数小于1×105，检测PCR阳性的18例白血病细胞数均大于280×105，而对长期临床缓解的患者，残留白血病细胞数量无显著差异。
3 讨论
MRD是引起白血病复发的主要原因，敏感特异的检测和清除MRD是白血病研究的一大热点。PCR方法由于敏感、特异、重复性好而广泛应用于MRD检测。作为白血病克隆特异性标志的IgH和TCR基因重排，在本组的45例ALL中阳性率为84.4%(38/45)，IgH阳性率(60.0)%明显高于TCR阳性率(24.4%)。在IgH基因重排中，由于V-D-J片段之间重排概率大，加之V区的插入，而呈现多态性〔5〕，即表现在电泳之后阳性条带在80～120 bp上下参差不齐的现象，而在T细胞受体表现不明显，这可能与TCRV区较少有关。正常人IgH及TCR基因呈现多克隆V-D-J重排，电泳后无特异性条带或出现很浅的模糊条带，可见IgH和TCR重排可作为白血病分化标志。
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通常认为，IgH基因重排是B细胞集落的序列和克隆性标志，Ig在B细胞肿瘤中有很高频率(约90%)的基因重排〔6〕。而近年来发现Ig基因重排也可发生于其他分化序列的细胞上，如Ig基因重排可出现在AML中〔7〕，即序列交叉现象。本研究采用PCR方法，检测了不同时期ANLL患者IgH基因重排，结果5例(25.0%)有Ig重排现象，且重排与FAB分型之间无相关性，形成原因可能为交叉重排的细胞起源于多潜能干细胞，它可同时表达几种序列的标志，随着细胞的定向分化，这种重排仍然存在。鉴于这种序列交叉现象，可以认为Ig基因重排可能并不能作为ALL诊断的绝对可靠标志。
诱导缓解治疗的效应对缓解期患者体内的残留白血病细胞数量有明显影响。在诱导缓解治疗阶段白血病细胞负荷消减2～3个对数级，残留白血病细胞>280×105的患者，缓解后早期残留白血病细胞的数量较高，且有较高的复发危险性，PCR检测转阴率较低。而临床缓解后获得5个对数级以上杀伤效应的患者，33.3%的残留白血病细胞检测长期持续阴性且无临床复发，此类患者如果在临床上仍采取较强的化疗方案，可能会给患者带来许多不必要的化疗副反应。大剂量化疗对AL的主要作用是减少白血病细胞负荷，而不能消除MRD〔8〕，但5个对数级以上的负荷清除是可以明显减少MRD量，增加PCR转阴率及减少临床复发机率。故在AL诱导缓解治疗中，应以大剂量、足疗程、密集的方案最大限度地杀灭白血病细胞，以达到5个对数级(残留白血病细胞数小于1×105)以上的杀伤效应，而对于长期持续缓解PCR阴性患者应避免强化疗，宜采用其它对MRD敏感的方法。
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参考文献
[1]Miller S A,Dykes D D,Polesky H F.A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleate cells.Nucleic Acios Res,1988,16:1215～1225
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[3]Saiki R K,Gelfand D H,Stoffel S,et al.Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.Science.1988,239:487～496
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[4]薛海鹏，朱平，武淑兰，等.聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染及保存.中国优生与遗传学杂志，1996，4：22～35
[5]Daris T H,Rockey C E,Ballk S D,et al.Detetion of clonal immunoglobulin gene roarrangement by polymelse chain reaction amplification and single-strand conformation polymorphism analysis.Am J Pathol,1993,142:1841～1848
[6]Oster W,Konig K L,Iudwig W D,et al,Incidence of Iineage promiscuity in acute myeloblastic leukemia;diagnostic implication of immunoglobulin and T cell receptor gene rearragement analysis and immunological phenotyping.Leuk Res,1988,12:887～893
, 百拇医药
[7]Bernard D,Bignon Y J,Lavenue F,et al.Lineage promiscuity in leukemia studies of T cell receptor and immunological genes.Leuk Res,1993,17:445～457
[8]Dwenger A,Lindemann A,Metelsmann R.Minimal residual disease:detection,clinical relerance,and treatment strategies.J Hematother,1996,5:537～548
(收稿 1999-08-21), 百拇医药