低Se低VE诱导肝细胞凋亡及相关基因所起的作用
作者：邵宗俊 井玲 李广生 孙波 邹亚斌
单位：白求恩医科大学 应用基础医学研究所，吉林 长春 130021
关键词：硒；维生素E；凋亡；相关基因
中国地方病学杂志000407 [摘要]目的 研究低硒(Se)低维生素E(VE)能否诱导大鼠肝细胞凋亡及相关基因p53、bcl-2和c-myc所起的作用。方法 以天然的和人工半合成的低Se低VE饲料喂养大鼠17周，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)检测肝细胞凋亡，采用免疫组化法检测肝细胞p53、bcl-2和c-myc蛋白。结果 与补Se和VE组大鼠相比，低Se低VE组大鼠肝细胞凋亡显著增加；p53和c-myc蛋白增加，而bcl-2蛋白则仅见少量表达。结论 微量营养素Se和VE缺乏可诱导大鼠肝细胞凋亡；p53、bcl-2和c-myc可能参与这类细胞凋亡的调控。
, 百拇医药 [中图分类号]R591 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4955(2000)04-257-03
Hepatocyte apoptosis induced by selenium and vitamin E deficiency and the role of bcl-2 and c-myc in the apoptotic process
SHAO Zong-jun, JING Ling, LI Guang-sheng, et al
(Institute of Preclinical Sciences, Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021, China)
, 百拇医药 Abstract： Objective To study whether dietary deficiency of selenium (Se) and vitamine E(VE) can induce hepatocyte apoptosis and what is the role of p53,bcl-2 and c-myc in the apoptotic process.Methods The experiment was performed on rats kept on natural or semisynthetic diet deficient in Se and VE for 17 weeks.The hepatocyte apoptosis was detected by using TUNEL in rats.The p53,bcl-2 and c-myc proteins were detected by immunohistochemistry in hepatocytes.Results As compared with Se and VE supplemented group,hepatocyte apoptosis was obviously increased in rats kept on Se and VE deficient diet,accompanied with an increased expression of p53 and c-myc protein but a lower expression of bcl-2 protein in hepatocytes.Conclusions The dietary deficiency of Se and VE can induce hepatocyte apoptosis in rats;p53,bcl-2 and c-myc may be involved in the regulation of the apoptotic process.
, http://www.100md.com
Key words：Selenium; Vitamin E; Apoptosis
诱发肝细胞凋亡的因素很多，但Se和VE缺乏诱导肝细胞凋亡报导很少[1]，凋亡相关基因p53、bcl-2和c-myc在Se和VE缺乏诱导肝细胞凋亡中的作用国内外尚未见报导。本文进一步探讨Se和VE缺乏确可诱导大鼠肝细胞凋亡及凋亡相关基因p53、bcl-2和c-myc在这类凋亡发生中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物和饲料 实验用体重90～130 g雌性Wistar大鼠，分别用2种饲料喂养。天然低Se低VE饲料用吉林省克山病病区粮食配制(endemic grains,EG),Se含量为0.013 mg/kg饲料，VE(α-Toco)为2.18 mg/kg饲料。对照组饲料用非病区粮配制(Non-EG)，其中Se含量为0.030 mg/kg饲料，VE为4.88 mg/kg饲料。人工半合成饲料以低Se酵母(Torula yeast)及低Se玉米淀粉为主要成分配成[2]，其中Se和VE含量分别为Se 0.0146 mg/kg饲料，VE(α-Toco) 5.24 mg/kg饲料，实验期限为17周。
, 百拇医药
1.2 肝细胞凋亡检测 采用TUNEL检测(用德国Boehringer Mannheim 试剂盒)。
1.3 凋亡相关蛋白检测 采用免疫组化法检测p53、bcl-2和c-myc蛋白。蛋白抗体均由北京中山生物制品公司提供。①常规石蜡包埋组织切片，贴于涂有0.1%多聚赖氨酸的载玻片上，脱蜡，水化。②3% H2O2灭活内源性酶。③用20 μg/ml蛋白酶K 37℃15 min。④滴加50 μl第一抗体(p53用工作液，bcl-2 1∶20稀释，c-myc 1∶40稀释)，4℃过夜。⑤滴加50 μl生物素标记的第二抗体，37℃湿盒中40 min。⑥滴加50 μl链亲合素—过氧化物酶溶液，37℃湿盒中30 min。⑦0.04% DAB室温避光显色5～15 min,1.0% 甲基绿复染10 min,脱水，透明，封片。
1.4 统计方法 采用单因素方差分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 TUNEL法检测细胞凋亡
2.1.1 天然饲料实验 TUNEL染色阳性细胞表现为核呈棕褐色，核形状不规则，核膜增厚，主要分布在血管周围。采用日本Luzex-F型图像分析仪，选取血管周围视野及非血管周围视野各5个，每个视野计数100个肝细胞，计算TUNEL阳性细胞百分率(凋亡指数，表1)。与Non EG组相比，偏食低Se低VE组(EG组)TUNEL阳性肝细胞百分率明显增加(P<0.01)；联合补充Se和VE组与EG组相比，TUNEL阳性细胞百分率明显下降(P<0.01)。
2.1.2 人工半合成饲料实验 低Se低VE组TUNEL阳性肝细胞百分率明显高于补充Se和VE组(P<0.05)；但与分别补Se或VE组比较，差异不显著(表2)。
2.2 肝组织中凋亡相关蛋白的表达
, http://www.100md.com
2.2.1 p53蛋白的表达 2种饲料实验的各组中均以低Se低VE组p53蛋白表达阳性细胞较多，阳性细胞多分布在血管周围，主要表现为胞浆呈褐色(图1，图2)，少数见核呈褐色。
2.2.2 bcl-2蛋白的表达 2种饲料实验低Se低VE组均只有少量bcl-2蛋白表达，补Se及VE可使表达增多(图3，图4)。用图像分析仪计数bcl-2蛋白染色阳性细胞百分率(计数方法同TUNEL)，结果可见补硒或VE均使bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.01)，见表3，表4。
表1 TUNEL法检测肝细胞凋亡指数(天然饲料实验) 组别
动物数
肝细胞凋亡指数(%，
±s)
, http://www.100md.com EG
EG+Se#
EG+VE△
EG+Se+VE
Non-EG
5
5
5
5
5
34.3±5.8
25.8±11.2
22.9±10.4
, http://www.100md.com
17.3±5.4**
15.4±3.8**
注：与低硒低VE的EG组比较，**P<0.01；#补Se量为0.1mg/kg饲料；△补VE量为100mg/kg饲料表2 TUNEL法检测肝细胞凋亡指数(半合成饲料实验) 组别
动物数
肝细胞凋亡指数(%，±s)
Se↓VE↓
Se↑VE↓#
Se↓VE↑△
, 百拇医药
Se↑VE↑
5
5
5
5
35.3±4.6
23.0±12.6
26.0±8.9
20.8±6.4*
注：与Se↓VE↓组比较，*P<0.05；#补Se量为0.2mg/kg饲料；△补VE量为250mg/kg饲料表3 bcl-2阳性肝细胞百分率(天然饲料实验) 组别
动物数
, 百拇医药
bcl-2阳性肝细胞(%，±s)
EG
EG+Se
EG+VE
EG+Se+VE
Non-EG
5
5
5
5
5
2.9±1.1
, 百拇医药
10.8±4.6**
12.0±1.1**
14.6±3.6**
4.9±1.8
注：与低硒低VE的EG组比较，**P<0.01表4 bcl-2阳性肝细胞百分率(半合成饲料实验) 组别
动物数
bcl-2阳性肝细胞(%，±s)
Se↓VE↓
Se↑VE↓#
, 百拇医药
Se↓VE↑△
Se↑VE↑
5
5
5
5
5.1±2.2
10.4±1.2**
12.8±3.1**
13.0±2.7**
注：与Se↓VE↓组比较，**P<0.01
, 百拇医药
图1 天然饲料实验，低硒低VE组大鼠p53蛋白染色(×200)
图2 人工半合成饲料实验，低硒低VE组大鼠p53蛋白染色(×200)
图3 天然饲料实验，补硒补VE组大鼠bcl-2蛋白染色(×200)
图4 人工半合成饲料实验，补硒补VE组大鼠bcl-2蛋白染色(×200)
2.2.3 c-myc蛋白的表达：2种饲料实验低Se低VE组c-myc蛋白表达均明显增加，表现为核及浆型2种，既有核内褐色的阳性细胞，也有胞浆为褐色的阳性细胞(图5)。
图5 天然饲料实验，低硒低VE组大鼠c-myc蛋白染色(×200)
, http://www.100md.com
3 讨论
细胞凋亡的调控因素很多，与细胞凋亡相关的基因越来越受到人们的重视。目前研究较多的凋亡调控基因有p53、bcl-2、c-myc等。我们的结果表明Se和VE缺乏可诱导大鼠肝细胞凋亡。在Se和VE缺乏诱导的肝细胞凋亡中这些基因是否参与调控很值得进一步研究。
正常p53基因即野生型p53基因的主要生物学功能是引起细胞周期阻滞、诱导凋亡及抑制肿瘤[3，4];突变型p53基因导致肿瘤发生。一般认为野生型p53半衰期短[5]，免疫组化法不容易检测到，而突变型p53半衰期延长至4～8 h，免疫组化法可以检测到。但值得注意的是病毒癌蛋白可使p53稳定性增加，因此免疫组化法阳性并不一定代表p53基因突变。更有甚者某些p53基因的突变，使其产物半衰期延长，但其功能仍旧是野生型的，称假突变[5]。p53蛋白是一种转录因子，只有位于核内才能发挥作用，但在一部分肿瘤及癌旁组织中也检测到胞浆型p53[6，7]。
, 百拇医药
我们采用免疫组化法检测p53蛋白，结果显示无论天然饲料还是人工半合成饲料，低Se低VE组p53蛋白表达均增加，但p53蛋白阳性染色多位于胞浆，仅偶见核着色，其机理有待进一步研究。
bcl-2是凋亡的抑制基因，bcl-2基因产物可以通过调节抗氧化途径阻止一系列氧化侵袭诱导的凋亡。我们用免疫组化法检测bcl-2蛋白，结果表明，无论天然饲料还是人工半合成饲料，补Se和VE均可使bcl-2蛋白表达增加。说明补Se和VE可通过促进bcl-2蛋白表达而抑制细胞凋亡。
c-myc作为癌基因，同时具有促进与抑制细胞凋亡的作用。我们用免疫组化法检测c-myc蛋白，结果表明，无论天然饲料还是人工半合成饲料，低Se低VE组c-myc蛋白表达均增加。c-myc基因产物本身也是一个转录基因，也应定位于核内，但我们实验中发现c-myc既有核内表达，也有胞浆表达，其意义有待进一步研究。
[基金来源]国家“八五”科技攻关专题资助(85-917-01-01)
, 百拇医药
[作者简介]邵宗俊(1962-)，女，副教授，博士。
参考文献
[1] 邵宗俊，井 玲，李广生.微量营养素缺乏对大鼠肝细胞凋亡影响的初步研究[J].白求恩医科大学学报，1998，24(2)：137-138.
[2] 李广生.低硒及相关因素与克山病[M].长春：吉林科学技术出版社，1997，140.
[3] Gottied TM,Oren M.p53 in growth control and neoplasia[J].Biochem Biophys Acta,1996,1287:77.
[4] Slagle BL,Zhou YZ,Butel JS.Hepatitis B virus integration event in human chromosome 179 near the p53 gene identifies the region of the chromosome commonly delated in virus-positive hepatocellular carcinomas[J].Cancer Res,1991,51:49.
, 百拇医药
[5] 郑 杰，吴秉铨.p53研究的新进展[J].中华病理学杂志，1997，26(4)：251-254.
[6] Chang F,Syrjanen S,Syrjanen K.Implications of the p53 tumor-suppressor gene in clinical oncology[J].J Clin Oncol,1995,13:1009.
[7] 罗 丹，刘启福，Gore C，等.肝癌组织中N-ras基因突变和p53蛋白表达[J].临床实验病理学杂志，1997，13(1)：1-3.
[收稿日期]1999-05-04;[修订日期]2000-04-25, 百拇医药
单位：白求恩医科大学 应用基础医学研究所，吉林 长春 130021
关键词：硒；维生素E；凋亡；相关基因
中国地方病学杂志000407 [摘要]目的 研究低硒(Se)低维生素E(VE)能否诱导大鼠肝细胞凋亡及相关基因p53、bcl-2和c-myc所起的作用。方法 以天然的和人工半合成的低Se低VE饲料喂养大鼠17周，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)检测肝细胞凋亡，采用免疫组化法检测肝细胞p53、bcl-2和c-myc蛋白。结果 与补Se和VE组大鼠相比，低Se低VE组大鼠肝细胞凋亡显著增加；p53和c-myc蛋白增加，而bcl-2蛋白则仅见少量表达。结论 微量营养素Se和VE缺乏可诱导大鼠肝细胞凋亡；p53、bcl-2和c-myc可能参与这类细胞凋亡的调控。
, 百拇医药 [中图分类号]R591 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4955(2000)04-257-03
Hepatocyte apoptosis induced by selenium and vitamin E deficiency and the role of bcl-2 and c-myc in the apoptotic process
SHAO Zong-jun, JING Ling, LI Guang-sheng, et al
(Institute of Preclinical Sciences, Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021, China)
, 百拇医药 Abstract： Objective To study whether dietary deficiency of selenium (Se) and vitamine E(VE) can induce hepatocyte apoptosis and what is the role of p53,bcl-2 and c-myc in the apoptotic process.Methods The experiment was performed on rats kept on natural or semisynthetic diet deficient in Se and VE for 17 weeks.The hepatocyte apoptosis was detected by using TUNEL in rats.The p53,bcl-2 and c-myc proteins were detected by immunohistochemistry in hepatocytes.Results As compared with Se and VE supplemented group,hepatocyte apoptosis was obviously increased in rats kept on Se and VE deficient diet,accompanied with an increased expression of p53 and c-myc protein but a lower expression of bcl-2 protein in hepatocytes.Conclusions The dietary deficiency of Se and VE can induce hepatocyte apoptosis in rats;p53,bcl-2 and c-myc may be involved in the regulation of the apoptotic process.
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Key words：Selenium; Vitamin E; Apoptosis
诱发肝细胞凋亡的因素很多，但Se和VE缺乏诱导肝细胞凋亡报导很少[1]，凋亡相关基因p53、bcl-2和c-myc在Se和VE缺乏诱导肝细胞凋亡中的作用国内外尚未见报导。本文进一步探讨Se和VE缺乏确可诱导大鼠肝细胞凋亡及凋亡相关基因p53、bcl-2和c-myc在这类凋亡发生中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物和饲料 实验用体重90～130 g雌性Wistar大鼠，分别用2种饲料喂养。天然低Se低VE饲料用吉林省克山病病区粮食配制(endemic grains,EG),Se含量为0.013 mg/kg饲料，VE(α-Toco)为2.18 mg/kg饲料。对照组饲料用非病区粮配制(Non-EG)，其中Se含量为0.030 mg/kg饲料，VE为4.88 mg/kg饲料。人工半合成饲料以低Se酵母(Torula yeast)及低Se玉米淀粉为主要成分配成[2]，其中Se和VE含量分别为Se 0.0146 mg/kg饲料，VE(α-Toco) 5.24 mg/kg饲料，实验期限为17周。
, 百拇医药
1.2 肝细胞凋亡检测 采用TUNEL检测(用德国Boehringer Mannheim 试剂盒)。
1.3 凋亡相关蛋白检测 采用免疫组化法检测p53、bcl-2和c-myc蛋白。蛋白抗体均由北京中山生物制品公司提供。①常规石蜡包埋组织切片，贴于涂有0.1%多聚赖氨酸的载玻片上，脱蜡，水化。②3% H2O2灭活内源性酶。③用20 μg/ml蛋白酶K 37℃15 min。④滴加50 μl第一抗体(p53用工作液，bcl-2 1∶20稀释，c-myc 1∶40稀释)，4℃过夜。⑤滴加50 μl生物素标记的第二抗体，37℃湿盒中40 min。⑥滴加50 μl链亲合素—过氧化物酶溶液，37℃湿盒中30 min。⑦0.04% DAB室温避光显色5～15 min,1.0% 甲基绿复染10 min,脱水，透明，封片。
1.4 统计方法 采用单因素方差分析。
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2 结果
2.1 TUNEL法检测细胞凋亡
2.1.1 天然饲料实验 TUNEL染色阳性细胞表现为核呈棕褐色，核形状不规则，核膜增厚，主要分布在血管周围。采用日本Luzex-F型图像分析仪，选取血管周围视野及非血管周围视野各5个，每个视野计数100个肝细胞，计算TUNEL阳性细胞百分率(凋亡指数，表1)。与Non EG组相比，偏食低Se低VE组(EG组)TUNEL阳性肝细胞百分率明显增加(P<0.01)；联合补充Se和VE组与EG组相比，TUNEL阳性细胞百分率明显下降(P<0.01)。
2.1.2 人工半合成饲料实验 低Se低VE组TUNEL阳性肝细胞百分率明显高于补充Se和VE组(P<0.05)；但与分别补Se或VE组比较，差异不显著(表2)。
2.2 肝组织中凋亡相关蛋白的表达
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2.2.1 p53蛋白的表达 2种饲料实验的各组中均以低Se低VE组p53蛋白表达阳性细胞较多，阳性细胞多分布在血管周围，主要表现为胞浆呈褐色(图1，图2)，少数见核呈褐色。
2.2.2 bcl-2蛋白的表达 2种饲料实验低Se低VE组均只有少量bcl-2蛋白表达，补Se及VE可使表达增多(图3，图4)。用图像分析仪计数bcl-2蛋白染色阳性细胞百分率(计数方法同TUNEL)，结果可见补硒或VE均使bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.01)，见表3，表4。
表1 TUNEL法检测肝细胞凋亡指数(天然饲料实验) 组别
动物数
肝细胞凋亡指数(%，
±s), http://www.100md.com EG
EG+Se#
EG+VE△
EG+Se+VE
Non-EG
5
5
5
5
5
34.3±5.8
25.8±11.2
22.9±10.4
, http://www.100md.com
17.3±5.4**
15.4±3.8**
注：与低硒低VE的EG组比较，**P<0.01；#补Se量为0.1mg/kg饲料；△补VE量为100mg/kg饲料表2 TUNEL法检测肝细胞凋亡指数(半合成饲料实验) 组别
动物数
肝细胞凋亡指数(%，
±s)Se↓VE↓
Se↑VE↓#
Se↓VE↑△
, 百拇医药
Se↑VE↑
5
5
5
5
35.3±4.6
23.0±12.6
26.0±8.9
20.8±6.4*
注：与Se↓VE↓组比较，*P<0.05；#补Se量为0.2mg/kg饲料；△补VE量为250mg/kg饲料表3 bcl-2阳性肝细胞百分率(天然饲料实验) 组别
动物数
, 百拇医药
bcl-2阳性肝细胞(%，
±s)EG
EG+Se
EG+VE
EG+Se+VE
Non-EG
5
5
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5
2.9±1.1
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10.8±4.6**
12.0±1.1**
14.6±3.6**
4.9±1.8
注：与低硒低VE的EG组比较，**P<0.01表4 bcl-2阳性肝细胞百分率(半合成饲料实验) 组别
动物数
bcl-2阳性肝细胞(%，
±s)Se↓VE↓
Se↑VE↓#
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Se↓VE↑△
Se↑VE↑
5
5
5
5
5.1±2.2
10.4±1.2**
12.8±3.1**
13.0±2.7**
注：与Se↓VE↓组比较，**P<0.01
, 百拇医药
图1 天然饲料实验，低硒低VE组大鼠p53蛋白染色(×200)
图2 人工半合成饲料实验，低硒低VE组大鼠p53蛋白染色(×200)
图3 天然饲料实验，补硒补VE组大鼠bcl-2蛋白染色(×200)
图4 人工半合成饲料实验，补硒补VE组大鼠bcl-2蛋白染色(×200)
2.2.3 c-myc蛋白的表达：2种饲料实验低Se低VE组c-myc蛋白表达均明显增加，表现为核及浆型2种，既有核内褐色的阳性细胞，也有胞浆为褐色的阳性细胞(图5)。
图5 天然饲料实验，低硒低VE组大鼠c-myc蛋白染色(×200)
, http://www.100md.com
3 讨论
细胞凋亡的调控因素很多，与细胞凋亡相关的基因越来越受到人们的重视。目前研究较多的凋亡调控基因有p53、bcl-2、c-myc等。我们的结果表明Se和VE缺乏可诱导大鼠肝细胞凋亡。在Se和VE缺乏诱导的肝细胞凋亡中这些基因是否参与调控很值得进一步研究。
正常p53基因即野生型p53基因的主要生物学功能是引起细胞周期阻滞、诱导凋亡及抑制肿瘤[3，4];突变型p53基因导致肿瘤发生。一般认为野生型p53半衰期短[5]，免疫组化法不容易检测到，而突变型p53半衰期延长至4～8 h，免疫组化法可以检测到。但值得注意的是病毒癌蛋白可使p53稳定性增加，因此免疫组化法阳性并不一定代表p53基因突变。更有甚者某些p53基因的突变，使其产物半衰期延长，但其功能仍旧是野生型的，称假突变[5]。p53蛋白是一种转录因子，只有位于核内才能发挥作用，但在一部分肿瘤及癌旁组织中也检测到胞浆型p53[6，7]。
, 百拇医药
我们采用免疫组化法检测p53蛋白，结果显示无论天然饲料还是人工半合成饲料，低Se低VE组p53蛋白表达均增加，但p53蛋白阳性染色多位于胞浆，仅偶见核着色，其机理有待进一步研究。
bcl-2是凋亡的抑制基因，bcl-2基因产物可以通过调节抗氧化途径阻止一系列氧化侵袭诱导的凋亡。我们用免疫组化法检测bcl-2蛋白，结果表明，无论天然饲料还是人工半合成饲料，补Se和VE均可使bcl-2蛋白表达增加。说明补Se和VE可通过促进bcl-2蛋白表达而抑制细胞凋亡。
c-myc作为癌基因，同时具有促进与抑制细胞凋亡的作用。我们用免疫组化法检测c-myc蛋白，结果表明，无论天然饲料还是人工半合成饲料，低Se低VE组c-myc蛋白表达均增加。c-myc基因产物本身也是一个转录基因，也应定位于核内，但我们实验中发现c-myc既有核内表达，也有胞浆表达，其意义有待进一步研究。
[基金来源]国家“八五”科技攻关专题资助(85-917-01-01)
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[作者简介]邵宗俊(1962-)，女，副教授，博士。
参考文献
[1] 邵宗俊，井 玲，李广生.微量营养素缺乏对大鼠肝细胞凋亡影响的初步研究[J].白求恩医科大学学报，1998，24(2)：137-138.
[2] 李广生.低硒及相关因素与克山病[M].长春：吉林科学技术出版社，1997，140.
[3] Gottied TM,Oren M.p53 in growth control and neoplasia[J].Biochem Biophys Acta,1996,1287:77.
[4] Slagle BL,Zhou YZ,Butel JS.Hepatitis B virus integration event in human chromosome 179 near the p53 gene identifies the region of the chromosome commonly delated in virus-positive hepatocellular carcinomas[J].Cancer Res,1991,51:49.
, 百拇医药
[5] 郑 杰，吴秉铨.p53研究的新进展[J].中华病理学杂志，1997，26(4)：251-254.
[6] Chang F,Syrjanen S,Syrjanen K.Implications of the p53 tumor-suppressor gene in clinical oncology[J].J Clin Oncol,1995,13:1009.
[7] 罗 丹，刘启福，Gore C，等.肝癌组织中N-ras基因突变和p53蛋白表达[J].临床实验病理学杂志，1997，13(1)：1-3.
[收稿日期]1999-05-04;[修订日期]2000-04-25, 百拇医药