心功能不全大鼠心肌诱生型一氧化氮合酶基因的表达
作者：韩福生 周令望 于维汉 刘阳 曾宪惠 曾绍娟
单位：哈尔滨医科大学 克山病研究所，黑龙江 哈尔滨 150086
关键词：诱生型一氧化氮合酶；基因表达；心功能不全
中国地方病学杂志000406 [摘要] 目的 探讨心功能不全大鼠心肌一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性变化的机制。方法 复制容量超负荷心功能不全大鼠模型，用原位核酸分子杂交技术检测心肌诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA的表达，用免疫组化技术检测心肌iNOS。结果 容量超负荷心功能不全大鼠心肌iNOS基因异常表达。结论 心功能不全心肌一氧化氮合酶活性增高主要是由于心肌iNOS基因异常表达所致,提示iNOS基因异常表达可能参与了心功能不全的发病机制。
[中图分类号]R541.6+1 [文献标识码] A
, http://www.100md.com
[文章编号]1000-4955(2000)04-254-03
Expression of iNOS gene in myocardium of rats with cardiac dysfunction
HAN Fu-sheng, ZHOU Ling-wang, YU Wei-han, et al
(Institute of Keshan Disease, Harbin Medical University, Harbin 150086, China)
Abstract： Objective To study the mechanism of NOS activity change in myocardium with cardiac dysfunction.Methods A model of rat with cardiac dysfunction caused by volume-overload was duplicated in this paper.The expression of iNOS mRNA in myocardium was detected by in situ hybridization,and the iNOS was tested by immunohistochemistry assay.Results The iNOS gene was expressed abnormally in myocardium of rats with cardiac dysfunction caused by volume-overload.Conclusions The increase of the NOS activity in myocardium of rats with cardiac dysfunction was mainly attributed to abnormal expression of iNOS gene,and it was also suggested that the abnormal expression of iNOS in myocardium may be involved in the pathogenesis of cardiac dysfunction.
, 百拇医药
Key words：iNOS; Gene expression; Cardiac dysfunction
曾报道容量超负荷心功能不全大鼠心肌一氧化氮合酶活性增高[1]。本研究用原位核酸分子杂交及免疫组化技术，分别对容量超负荷心功能不全大鼠心肌诱生型一氧化氮合酶mRNA及蛋白进行了检测，以期探讨心功能不全心肌一氧化氮合酶活性改变的机制。
1 材料与方法
1.1 复制容量超负荷心功能不全大鼠模型[1] 健康SD大鼠，雌雄各半，体重150～180 g，随机分为心功能不全(cardiac dysfunction,CD)组及假手术(sham-operation,SO)组，参照Garvcia等人的方法加以改进，行腹主动脉-后腔静脉造瘘术，SO组分离腹主动脉、后腔静脉，但不造瘘。术后常规饲养、观察。10周后，以RM-6000型8道生理记录仪、MFV-1200型电磁血流量计检测心功能。
, 百拇医药
1.2 留取心肌标本 摘取心功能测定证实的心功能不全大鼠及假手术组大鼠心脏，以0.1 mol/L PBS(DEPC处理水配置，pH=7.3)冲洗干净，4%多聚甲醛(用DEPC处理过的0.1 mol/L PBS配制,pH=7.3)4℃固定过夜，常规石蜡包埋备检。
1.3 原位核酸分子杂交检测心肌iNOS mRNA piNOS L3(iNOS pUC19,6.0 kb,Hinc Ⅱ/Ssp Ⅰ)
由西安第四军医大学基因诊断所郭晏海博士惠赠。质粒行BamH Ⅰ、Hinc Ⅱ酶切，琼脂糖电泳分析并回收654 bp DNA片段，缺口平移法标记生物素iNOS cDNA探针。原位核酸分子杂交主要步骤[2]5 μm心肌组织石蜡切片，蛋白酶K(1μg/ml)37℃消化30 min；预杂交，42℃，1 h；杂交，42℃，12 h；卵白素-碱性磷酸酶(1∶500)室温处理1 h；加NBT和BCIP，室温，暗处显色3 h,20 mmol/L EDTA pH=8.0终止反应；甲基绿复染，系列乙醇脱水，二甲苯透明，光学树脂封片，显微镜下观察，阳性结果为胞浆着蓝黑色。对照实验：①不加iNOS cDNA探针；②杂交前用RNase A(200 mg/L)处理。
, 百拇医药
1.4 免疫组化(S-P)法检测心肌iNOS 5μm厚心肌组织石蜡切片，经脱蜡、水化、3%H2O2灭活内源性过氧化物酶后，加1∶500兔抗鼠iNOS抗体(Zymde),37℃,30 min;加生物素标记的羊抗兔第二抗体、过氧化物酶标记的链霉菌抗生物素蛋白(S-P)，37℃，30 min;DAB显色，甲基绿复染，脱水、透明、光学树脂封片，镜下观察，阳性结果为胞浆呈现棕黄色颗粒。阴性对照：以PBS代替第一抗体。
2 结果
2.1 大鼠心肌iNOS mRNA的表达 细胞内呈现均匀一致分布的蓝黑色颗粒者即为iNOS mRNA阳性表达的细胞。结果显示，iNOS cDNA-mRNA杂交阳性信号在心肌组织呈灶状分布，主要表达在心肌细胞，血管平滑肌细胞未见阳性信号；CD组32例中有27例呈现阳性(84.4%)，而SO组均为阴性，2个组阳性杂交率之间差异有非常显著意义(P<0.005)。见表1，图1，图2。
, 百拇医药
2.2 大鼠心肌iNOS免疫组化染色 结果显示，iNOS主要表达在心肌细胞，血管平滑肌未见表达，心肌组织中iNOS染色阳性的心肌细胞呈灶状分布；SO组有1例阳性染色(7.1%)，CD组32例均为染色阴性(100%)，2个组免疫组化染色阳性率差异有非常显著意义(P<0.005)见表1，图3，图4。
表1 大鼠心肌原位核酸分子杂交和
iNOS免疫组化检测结果 组别
例数
原位核酸分子杂交
免疫组化
阳性数
阳性率(%)
阳性数
, 百拇医药
阳性率(%)
假手术组
心功能不全组
14
32
0
27
0
84.4
1
32
7.1
100
, 百拇医药
图1 SO组心肌组织iNOS mRNA表达阴性，原位杂交甲基绿复染 ×66
图2 SO组心肌组织iNOS mRNA表达阳性，心肌细胞胞浆内
显示蓝黑色颗粒状阳性信号 原位杂交 甲基绿复染 ×66
图3 SO组心肌组织iNOS免疫组化染色阴性
S-P法，甲基绿复染 ×66
图4 CD组心肌组织iNOS免疫组化染色阳性，心肌细胞
, 百拇医药
胞浆内显示深色颗粒 S-P法，甲基绿复染 ×66
3 讨论
iNOS基因在正常心肌中不表达，只有在病理情况下才表达。Haywood等[3]用RT-PCR、免疫组化法对移植心脏进行研究，发现非心脏病患者无iNOS基因表达，而无论原发病为何，只要有心功能不全，其心肌就高丰度表达iNOS。在CVB3致小鼠急性心肌炎模型中，病毒接种早期，用RT-PCR及免疫组化进行检测，发现心脏iNOS基因的表达与炎性细胞浸润时期相一致[4]；在大鼠自身免疫性心肌炎模型中也发现心肌表达iNOS，分析认为心肌炎时可逆性心肌收缩功能低下与iNOS基因异常表达有关[5，6]，因为心肌异常表达iNOS可产生过量的NO，后者具有抑制心肌收缩力和损伤心肌细胞的作用。
目前认为，细胞因子对iNOS基因表达起重要的作用。离体实验证实，IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ均可诱导iNOS mRNA表达[7]；也有研究表明，心功能不全患者TNF-α血浓度升高并与心衰程度密切相关；Habib曾报告心肌iNOS基因表达的扩张型心肌病患者，其心脏血管内皮细胞或平滑肌细胞也表达TNF-α[8]。由此可见，心功能不全时心肌iNOS基因表达可能与也在此时表达的TNF-α及白介素等细胞因子诱导有关。
, http://www.100md.com
心功能不全组大鼠心肌表达iNOS mRNA及其蛋白，其表达部位主要在心肌细胞，因而认为CD组心肌NOS活性升高，主要是心肌细胞的iNOS活性增高所致。另有研究报道，心脏移植后心肌活检标本中，iNOS基因在心肌细胞及血管平滑肌细胞均表达，而左室功能低下者心肌表达频度尤高[9]，本实验中心脏血管内皮细胞未见到iNOS表达，其原因有待进一步探讨。
[作者简介]韩福生(1965-)，男，医学博士。
参考文献
[1] 韩福生，邢东琦，于维汉，等.容量超负荷心功能不全大鼠心肌一氧化氮合酶的变化[J].中国地方病学杂志，1999，18(6)：408-410.
[2] 姜 泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法[M].北京：人民军医出版社，1996，128-143.
, 百拇医药
[3] Haywood GA,Tsao PS,von der Leyen HE,et al.Expression of inducible nitric oxide synthase in human heart failure[J].Circulation,1996,93(6):1087-1094.
[4] Mikami S,Kawashima S,Kanazawa K,et al.Expression of nitric oxide synthase in a murine model of viral myocarditis induced by coxsackievirus B3[J].Biochem Biophys Res Commun,1996,220(3):983-989.
[5] Ishiyama S,Hiroe M,Nishikawa T,et al.Nitric oxide contributes to the progression of myocardial damage in experimental autoimmune myocarditis in rats[J].Circulation,1997,95(2):489-496.
, 百拇医药
[6] Hirono S,Islam MO,Nakazawa M,et al.Expression of inducible nitric oxide synthase in rat experimental autoimmune myocarditis with special reference to changes in cardiac hemodynamics[J].Circ Res,1997,80(1):11-20.
[7] Nathan C,Xie QW.Regulation of biosynthesis of nitric oxide[J].J Biol Chem,1994,269(19):13725-13728.
[8] Habib FM,Springall DR,Davies GJ,et al.Tumour necrosis factor and inducible nitric oxide synthase in dilated cardiomyopathy[J].Lancet,1996,347(9009):1151-1155.
[9] Ishida H,Ichimori K,Hirota Y,et al.Peroxynitrite-induced cardiac myocyte injury[J].Free Radic Biol Med,1996,20(3):343-350.
[收稿日期]2000-01-13;[修订日期]2000-03-01, http://www.100md.com
单位：哈尔滨医科大学 克山病研究所，黑龙江 哈尔滨 150086
关键词：诱生型一氧化氮合酶；基因表达；心功能不全
中国地方病学杂志000406 [摘要] 目的 探讨心功能不全大鼠心肌一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性变化的机制。方法 复制容量超负荷心功能不全大鼠模型，用原位核酸分子杂交技术检测心肌诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA的表达，用免疫组化技术检测心肌iNOS。结果 容量超负荷心功能不全大鼠心肌iNOS基因异常表达。结论 心功能不全心肌一氧化氮合酶活性增高主要是由于心肌iNOS基因异常表达所致,提示iNOS基因异常表达可能参与了心功能不全的发病机制。
[中图分类号]R541.6+1 [文献标识码] A
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[文章编号]1000-4955(2000)04-254-03
Expression of iNOS gene in myocardium of rats with cardiac dysfunction
HAN Fu-sheng, ZHOU Ling-wang, YU Wei-han, et al
(Institute of Keshan Disease, Harbin Medical University, Harbin 150086, China)
Abstract： Objective To study the mechanism of NOS activity change in myocardium with cardiac dysfunction.Methods A model of rat with cardiac dysfunction caused by volume-overload was duplicated in this paper.The expression of iNOS mRNA in myocardium was detected by in situ hybridization,and the iNOS was tested by immunohistochemistry assay.Results The iNOS gene was expressed abnormally in myocardium of rats with cardiac dysfunction caused by volume-overload.Conclusions The increase of the NOS activity in myocardium of rats with cardiac dysfunction was mainly attributed to abnormal expression of iNOS gene,and it was also suggested that the abnormal expression of iNOS in myocardium may be involved in the pathogenesis of cardiac dysfunction.
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Key words：iNOS; Gene expression; Cardiac dysfunction
曾报道容量超负荷心功能不全大鼠心肌一氧化氮合酶活性增高[1]。本研究用原位核酸分子杂交及免疫组化技术，分别对容量超负荷心功能不全大鼠心肌诱生型一氧化氮合酶mRNA及蛋白进行了检测，以期探讨心功能不全心肌一氧化氮合酶活性改变的机制。
1 材料与方法
1.1 复制容量超负荷心功能不全大鼠模型[1] 健康SD大鼠，雌雄各半，体重150～180 g，随机分为心功能不全(cardiac dysfunction,CD)组及假手术(sham-operation,SO)组，参照Garvcia等人的方法加以改进，行腹主动脉-后腔静脉造瘘术，SO组分离腹主动脉、后腔静脉，但不造瘘。术后常规饲养、观察。10周后，以RM-6000型8道生理记录仪、MFV-1200型电磁血流量计检测心功能。
, 百拇医药
1.2 留取心肌标本 摘取心功能测定证实的心功能不全大鼠及假手术组大鼠心脏，以0.1 mol/L PBS(DEPC处理水配置，pH=7.3)冲洗干净，4%多聚甲醛(用DEPC处理过的0.1 mol/L PBS配制,pH=7.3)4℃固定过夜，常规石蜡包埋备检。
1.3 原位核酸分子杂交检测心肌iNOS mRNA piNOS L3(iNOS pUC19,6.0 kb,Hinc Ⅱ/Ssp Ⅰ)
由西安第四军医大学基因诊断所郭晏海博士惠赠。质粒行BamH Ⅰ、Hinc Ⅱ酶切，琼脂糖电泳分析并回收654 bp DNA片段，缺口平移法标记生物素iNOS cDNA探针。原位核酸分子杂交主要步骤[2]5 μm心肌组织石蜡切片，蛋白酶K(1μg/ml)37℃消化30 min；预杂交，42℃，1 h；杂交，42℃，12 h；卵白素-碱性磷酸酶(1∶500)室温处理1 h；加NBT和BCIP，室温，暗处显色3 h,20 mmol/L EDTA pH=8.0终止反应；甲基绿复染，系列乙醇脱水，二甲苯透明，光学树脂封片，显微镜下观察，阳性结果为胞浆着蓝黑色。对照实验：①不加iNOS cDNA探针；②杂交前用RNase A(200 mg/L)处理。
, 百拇医药
1.4 免疫组化(S-P)法检测心肌iNOS 5μm厚心肌组织石蜡切片，经脱蜡、水化、3%H2O2灭活内源性过氧化物酶后，加1∶500兔抗鼠iNOS抗体(Zymde),37℃,30 min;加生物素标记的羊抗兔第二抗体、过氧化物酶标记的链霉菌抗生物素蛋白(S-P)，37℃，30 min;DAB显色，甲基绿复染，脱水、透明、光学树脂封片，镜下观察，阳性结果为胞浆呈现棕黄色颗粒。阴性对照：以PBS代替第一抗体。
2 结果
2.1 大鼠心肌iNOS mRNA的表达 细胞内呈现均匀一致分布的蓝黑色颗粒者即为iNOS mRNA阳性表达的细胞。结果显示，iNOS cDNA-mRNA杂交阳性信号在心肌组织呈灶状分布，主要表达在心肌细胞，血管平滑肌细胞未见阳性信号；CD组32例中有27例呈现阳性(84.4%)，而SO组均为阴性，2个组阳性杂交率之间差异有非常显著意义(P<0.005)。见表1，图1，图2。
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2.2 大鼠心肌iNOS免疫组化染色 结果显示，iNOS主要表达在心肌细胞，血管平滑肌未见表达，心肌组织中iNOS染色阳性的心肌细胞呈灶状分布；SO组有1例阳性染色(7.1%)，CD组32例均为染色阴性(100%)，2个组免疫组化染色阳性率差异有非常显著意义(P<0.005)见表1，图3，图4。
表1 大鼠心肌原位核酸分子杂交和
iNOS免疫组化检测结果 组别
例数
原位核酸分子杂交
免疫组化
阳性数
阳性率(%)
阳性数
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阳性率(%)
假手术组
心功能不全组
14
32
0
27
0
84.4
1
32
7.1
100
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图1 SO组心肌组织iNOS mRNA表达阴性，原位杂交甲基绿复染 ×66
图2 SO组心肌组织iNOS mRNA表达阳性，心肌细胞胞浆内
显示蓝黑色颗粒状阳性信号 原位杂交 甲基绿复染 ×66
图3 SO组心肌组织iNOS免疫组化染色阴性
S-P法，甲基绿复染 ×66
图4 CD组心肌组织iNOS免疫组化染色阳性，心肌细胞
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胞浆内显示深色颗粒 S-P法，甲基绿复染 ×66
3 讨论
iNOS基因在正常心肌中不表达，只有在病理情况下才表达。Haywood等[3]用RT-PCR、免疫组化法对移植心脏进行研究，发现非心脏病患者无iNOS基因表达，而无论原发病为何，只要有心功能不全，其心肌就高丰度表达iNOS。在CVB3致小鼠急性心肌炎模型中，病毒接种早期，用RT-PCR及免疫组化进行检测，发现心脏iNOS基因的表达与炎性细胞浸润时期相一致[4]；在大鼠自身免疫性心肌炎模型中也发现心肌表达iNOS，分析认为心肌炎时可逆性心肌收缩功能低下与iNOS基因异常表达有关[5，6]，因为心肌异常表达iNOS可产生过量的NO，后者具有抑制心肌收缩力和损伤心肌细胞的作用。
目前认为，细胞因子对iNOS基因表达起重要的作用。离体实验证实，IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ均可诱导iNOS mRNA表达[7]；也有研究表明，心功能不全患者TNF-α血浓度升高并与心衰程度密切相关；Habib曾报告心肌iNOS基因表达的扩张型心肌病患者，其心脏血管内皮细胞或平滑肌细胞也表达TNF-α[8]。由此可见，心功能不全时心肌iNOS基因表达可能与也在此时表达的TNF-α及白介素等细胞因子诱导有关。
, http://www.100md.com
心功能不全组大鼠心肌表达iNOS mRNA及其蛋白，其表达部位主要在心肌细胞，因而认为CD组心肌NOS活性升高，主要是心肌细胞的iNOS活性增高所致。另有研究报道，心脏移植后心肌活检标本中，iNOS基因在心肌细胞及血管平滑肌细胞均表达，而左室功能低下者心肌表达频度尤高[9]，本实验中心脏血管内皮细胞未见到iNOS表达，其原因有待进一步探讨。
[作者简介]韩福生(1965-)，男，医学博士。
参考文献
[1] 韩福生，邢东琦，于维汉，等.容量超负荷心功能不全大鼠心肌一氧化氮合酶的变化[J].中国地方病学杂志，1999，18(6)：408-410.
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, 百拇医药
[3] Haywood GA,Tsao PS,von der Leyen HE,et al.Expression of inducible nitric oxide synthase in human heart failure[J].Circulation,1996,93(6):1087-1094.
[4] Mikami S,Kawashima S,Kanazawa K,et al.Expression of nitric oxide synthase in a murine model of viral myocarditis induced by coxsackievirus B3[J].Biochem Biophys Res Commun,1996,220(3):983-989.
[5] Ishiyama S,Hiroe M,Nishikawa T,et al.Nitric oxide contributes to the progression of myocardial damage in experimental autoimmune myocarditis in rats[J].Circulation,1997,95(2):489-496.
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[6] Hirono S,Islam MO,Nakazawa M,et al.Expression of inducible nitric oxide synthase in rat experimental autoimmune myocarditis with special reference to changes in cardiac hemodynamics[J].Circ Res,1997,80(1):11-20.
[7] Nathan C,Xie QW.Regulation of biosynthesis of nitric oxide[J].J Biol Chem,1994,269(19):13725-13728.
[8] Habib FM,Springall DR,Davies GJ,et al.Tumour necrosis factor and inducible nitric oxide synthase in dilated cardiomyopathy[J].Lancet,1996,347(9009):1151-1155.
[9] Ishida H,Ichimori K,Hirota Y,et al.Peroxynitrite-induced cardiac myocyte injury[J].Free Radic Biol Med,1996,20(3):343-350.
[收稿日期]2000-01-13;[修订日期]2000-03-01, http://www.100md.com