小鼠病毒性心肌炎细胞凋亡相关蛋白的表达
作者：钱素娟 于心语 于祖熙 于维汉
单位：钱素娟 于维汉(哈尔滨医科大学 克山病研究所，黑龙江 哈尔滨 150086)；于心语 于祖熙(NIH,Bethesda,MD 20892)
关键词：心肌炎；细胞凋亡；穿孔素
中国地方病学杂志000403 [摘要] 目的 探讨嗜鼠心肌Coxsackie B3病毒(CVB3m)诱导的BALB/C小鼠病毒性心肌炎(VMC)细胞凋亡的机制。方法 给BALB/C小鼠腹腔接种0.1 ml 100 TCD50 CVB3m，感染后分批断脊处死小鼠。应用双重荧光染色技术、原位末端标记法(TUNEL)和共聚焦显微镜对小鼠心肌细胞凋亡及部分相关蛋白表达进行检测。结果 CVB3m可诱发小鼠VMC。感染病毒后9～12 d病变达到高峰，检出率达100%。TUNEL法检测发现，感染后7～15 d，小鼠心肌中可见明显的心肌及炎细胞凋亡，50 d时可见少数散在的凋亡的心肌细胞。感染鼠心肌可见穿孔素(perforin)、granzyme B、caspase-8和Bax蛋白异常表达。阳性细胞分布区域与凋亡细胞分布区域基本一致，表达量的动态改变与炎性损伤程度一致。双重荧光染色显示，病灶内部分Bax阳性炎细胞可见凋亡染色。结论 穿孔素和granzyme B在VMC小鼠心肌炎性损伤过程中表达并参与细胞凋亡的调节。caspase-8及Bax/Bcl-2比值升高与细胞凋亡有关。
, http://www.100md.com
[中图分类号]R542.2+1;Q255 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4955(2000)04-245-03
Expression of apoptosis related proteins perforin,granzyme B and caspase-8 in experimental viral myocarditis of mice
QIAN Su-juan, YU Xin-yu, YU Zu-xi, et al
(Keshan Disease Institute, Harbin Medical University, Harbin 150086, China)
Abstract： Objective To explore the mechanisms of apoptosis in mice myocaditis induced by CVB3m.Methods BALB/C mice were inoculated with 0.1ml 100 TCD50 CVB3m and batch sacrificed later.Histologic,immunohistochemical observations including TUNEL labeling method,and dual fluorescent labeling techniques were performed on mice hearts,and the results were detected by a confocal laser scanning microscopy.Results The myocarditis were detected from all 100% CVB3m infected mice and were most severe at 7～12 days.Apoptosis also increased markedly in inflammatory cells and myocyted at 9～15 days after infection.Immunoreactivities for perforin,granzyme B,caspase-8 and Bax increased considerably in myocardium after infection,and decreased gradually after 20 days,as inflammation subsided.No significant differences were observed in hearts of infected mouse as compared to controls for Bcl-2.Double staining for Bax demonstrated apoptosis in some inflammatory cells.Conclusions The perforin and granzyme B take part in the regulation of myocyte damage and apoptosis in mice myocarditis.Our data suggest that increases of reaction of Caspase-8 and Bax/Bcl-2 was related to apoptosis.
, 百拇医药
Key words：Myocarditis; Apoptosis; Perforin
细胞凋亡是一种细胞自发的死亡方式，许多因素可以诱导细胞凋亡。诱导因素不同，细胞死亡途径亦不完全相同。目前已经发现很多种细胞凋亡相关蛋白，但caspase的表达是各种细胞凋亡的最后共同通路[1]。本实验用CVB3m诱发BALB/C小鼠VMC，通过对心肌中细胞凋亡及相关蛋白穿孔素、granzyme B、caspase-8、Bcl-2及Bax的表达进行检测，利用共聚焦显微镜观察结果，以探讨小鼠VMC细胞凋亡的机制。
1 材料与方法
1.1 VMC动物模型的建立[2] 给纯系5周龄雄性BALB/C小鼠腹腔接种0.1 ml 100 TCD50 CVB3m建立小鼠急性VMC模型。心脏标本于光学显微镜下进行常规组织形态学观察。
, 百拇医药
1.2 荧光染色 第一抗体来源见表1；第二抗体为FITC(绿色荧光)标记的兔抗羊或羊抗兔IgG，核染为含4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI，蓝色荧光)的Vectashield,均由Vector公司生产。TUNEL法检测细胞凋亡试剂盒由Oncon公司生产。
表1 第一抗体来源 第一抗体
类型
来源
工作浓度(μg/ml)
Bcl-2
Bax
Perforin
Granzyme B
, 百拇医药
Caspase-8
RP
RP
GP
RP
RP
Oncogene
Oncogene
Santa Cruz Biotechnology
Santa Cruz Biotechnology
Santa Cruz Biotechnology
, 百拇医药 10
10
10
10
10
注：RP：兔抗鼠多克隆抗体；GP：羊抗鼠多克隆抗体
1.3 单荧光染色操作步骤 石蜡切片常规脱蜡、水化后，微波炉法修复抗原15 min,再与5%相应正常封闭血清室温反应30 min。拭去组织上多余液体，加工作浓度的第一抗体于4℃过夜。用0.01 mol/L pH7.4的PBS清洗(5 min,x3)后，与10 μg/ml FITC标记的第二抗体室温反应2 h，最后用含DAPI的Vectashield封片。
1.4 细胞凋亡与Bax双重荧光染色操作步骤 先进行Bax单荧光染色，详细步骤同上。20 μg/ml蛋白酶K消化15 min后，加平衡缓冲液反应5 min。再与TdT酶于37℃反应1 h，加终止反应液室温反应10 min。与工作浓度的Rhodamine(红色荧光)标记的抗地高辛抗体室温反应30 min。最后用含DAPI的Vectashield封片。
, 百拇医药
所有荧光染色标本均应用Leica TCS-4D共聚焦显微镜(装备有紫外和氩氪混合气体激光光源)观察结果。
2 结果
2.1 常规组织形态学检查 CVB3m可诱发小鼠VMC。感染病毒后9～12 d病变达到高峰，检出率达100%。15 d后,病变逐渐修复。至30～50 d，无明显炎性损伤。
2.2 TUNEL法检测[2，3] 感染鼠心肌中可见心肌及炎细胞凋亡，于感染后7～15 d最明显，50 d时仍可见少数散在的心肌细胞凋亡。
2.3 免疫荧光染色结果 对照组小鼠除了部分血管壁细胞可见较弱的Bax阳性反应外，未见穿孔素、granzyme B及caspase-8阳性染色。感染病毒小鼠心肌中可见穿孔素、granzyme B及caspase-8异常染色。穿孔素主要呈线状分布于病灶内部分炎细胞和病灶周围的心肌细胞膜；granzyme B分布于与表达穿孔素蛋白同区域的细胞浆内；caspase-8主要分布于部分炎细胞浆内；一些浸润的炎细胞可见较强的Bax阳性反应，心脏血管壁亦可见Bax中等程度的荧光反应(见插页图A，B，C，D，E，F)。以上各种蛋白的表达程度与心肌炎性损伤的动态改变基本一致。双重荧光染色发现，部分Bax阳性的炎性细胞同时可见凋亡阳性染色(见插页图G，H)。感染及正常对照组小鼠心肌中均未见Bcl-2阳性染色。
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3 讨论
在我们以前所发表的文章中，对CVB3m诱导BALB/C小鼠心肌损伤及心肌细胞凋亡已经有过比较详尽的描述[2，3]，本篇主要是对穿孔素、caspase-8及Bax/Bcl-2与细胞凋亡的关系进行探讨。
穿孔素是一种管型蛋白，主要存在于细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞浆的颗粒中。它可以在自身及靶细胞膜造成穿透性孔道，以便于某些细胞活性物质或毒性丝氨酸蛋白酶(如granzyme B)进入靶细胞，引起靶细胞坏死及凋亡[4]。
caspase是一个含有半胱氨酸活性的胞浆蛋白酶家族，与线虫细胞凋亡诱导基因ced-3高度同源，目前发现最少有13种。研究认为，各种凋亡诱导因素最后都通过caspase起作用，caspase-8和caspase-9被认为是caspase系统的始动环节，caspase-3是终末步骤，起“刽子手”作用。本实验结果显示，在感染鼠心肌中有穿孔素、granzyme B及caspase-8的异常表达，并与凋亡细胞的分布有一定关系。穿孔素主要表达于炎细胞及病灶周围心肌细胞膜，阳性细胞分布范围广，并与炎性损伤的程度基本一致，而凋亡细胞相对较少，提示穿孔素可能为granzyme B提供通道，使其进入靶细胞，启动caspase系统，诱导细胞凋亡。同时，可使病原在细胞间转移，炎性介质浸入心肌细胞，引起细胞坏死。caspase-8主要表达于病灶内的炎细胞浆内，心肌细胞表达不明显，这与小鼠病毒性心肌炎细胞凋亡的表现基本一致。虽然由于实验条件的限制，我们没能进行caspase-8与细胞凋亡的双重染色，但连续切片结果显示，caspase-8与病毒性心肌炎细胞凋亡密切相关。另外，我们也进行了caspase-3的检测，但得到阴性结果，这可能与抗体的敏感性及组织特异性有关。
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Bcl-2是第一个被发现的凋亡抑制因子，对多种细胞凋亡起重要调控作用[5，6]。进一步研究发现，Bcl-2属于一个多基因家族，并不是单独起作用，而是与同家族中其它一些具有诱导细胞凋亡作用的基因协同作用，目前研究较多的是Bax/Bcl-2，结果取决于哪种蛋白活性占优势。Bcl-2家族最后也是通过调控caspase系统而起作用。尽管在本实验中，感染鼠心肌Bcl-2无明显变化，但其家族中的另一种作用相反的Bax蛋白表达明显增多，Bax/Bcl-2的比值增高，而且，一些炎细胞可见Bax和凋亡的双重阳性染色，提示Bax/Bcl-2参与小鼠VMC细胞凋亡的诱导，尤其与炎细胞凋亡密切相关。
细胞凋亡是一个多因素、多机制诱导的细胞自发死亡的方式，虽然在多种疾病发生、发展过程中起重要作用，但不同细胞相关机制不完全相同，本研究结果提示，在小鼠病毒性心肌炎发生发展过程中，心肌中的细胞凋亡可被穿孔素，granzyme B,caspase-8诱导，并受Bax/Bcl-2比值的调节。而通过调控细胞凋亡来实现临床的治疗目的还需要进一步深入研究。
, 百拇医药
、图示:共聚焦显微镜照片显示正常(A、C、E和C)和病毒感染9d后的(B、D、F和H)小鼠心肌组织的免疫组化反应结果。细胞核为DAPI(蓝色荧光)复染，放大倍数为650×
A和B：穿孔素单荧光染色结果，感染小鼠(B)心肌细胞膜阳性反应(绿色荧光；箭头)。
C和D：Granzsyme B单荧光染色，感染小鼠(D)心肌及炎细胞浆呈现阳性染色(绿色荧光；箭头)。
E和F：Caspase-8单荧光染色，浸润炎细胞浆呈阳性反应(绿色荧光；箭头)。
G和H：Bax与细胞凋亡对重荧光染色，可见间质内双染的炎细胞(Bax为绿色荧光，主要在细胞质；调亡为红色荧光，在细胞核)
[作者简介]钱素娟(1966-)，女，医学博士。
, http://www.100md.com
参考文献
[1] Salvesen GS,Dixit VM.Caspase activation:The induced-proximity model[J].PNAS,1999,96(20):10964.
[2] 钱素娟，曾宪惠，于维汉.细胞凋亡与小鼠病毒性心肌炎发生发展的关系[J].中国地方病学杂志，1997，16(4)：203.
[3] 钱素娟，万汇娟，于维汉.感染Coxsakie B3m病毒小鼠心肌NOSⅡ蛋白的表达[J].中国地方病学杂志，1998,17(5):303.
[4] Kawai C.From myocarditis to cardiomyopathy:mechanisms of inflammation and cell death:learning from the past for the future[J].Circulation,1999,99(8):1091.
, 百拇医药
[5] Krajewski S,Krajewski M,Shabaik A,et al.Immunohistochem-
ical determination of in vivo distribution of Bax,a dominant inhibitor of Bce-2[J].Am J Pathol,1994,145:1323.
[6] Goping IS,Gross A,Lavoie JN,et al.Regulated targeting of Bax to mitochondria[J].J Cell Biol,1998,143:207.
[收稿日期]1999-12-10;[修订日期]1999-12-21, 百拇医药
单位：钱素娟 于维汉(哈尔滨医科大学 克山病研究所，黑龙江 哈尔滨 150086)；于心语 于祖熙(NIH,Bethesda,MD 20892)
关键词：心肌炎；细胞凋亡；穿孔素
中国地方病学杂志000403 [摘要] 目的 探讨嗜鼠心肌Coxsackie B3病毒(CVB3m)诱导的BALB/C小鼠病毒性心肌炎(VMC)细胞凋亡的机制。方法 给BALB/C小鼠腹腔接种0.1 ml 100 TCD50 CVB3m，感染后分批断脊处死小鼠。应用双重荧光染色技术、原位末端标记法(TUNEL)和共聚焦显微镜对小鼠心肌细胞凋亡及部分相关蛋白表达进行检测。结果 CVB3m可诱发小鼠VMC。感染病毒后9～12 d病变达到高峰，检出率达100%。TUNEL法检测发现，感染后7～15 d，小鼠心肌中可见明显的心肌及炎细胞凋亡，50 d时可见少数散在的凋亡的心肌细胞。感染鼠心肌可见穿孔素(perforin)、granzyme B、caspase-8和Bax蛋白异常表达。阳性细胞分布区域与凋亡细胞分布区域基本一致，表达量的动态改变与炎性损伤程度一致。双重荧光染色显示，病灶内部分Bax阳性炎细胞可见凋亡染色。结论 穿孔素和granzyme B在VMC小鼠心肌炎性损伤过程中表达并参与细胞凋亡的调节。caspase-8及Bax/Bcl-2比值升高与细胞凋亡有关。
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[中图分类号]R542.2+1;Q255 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4955(2000)04-245-03
Expression of apoptosis related proteins perforin,granzyme B and caspase-8 in experimental viral myocarditis of mice
QIAN Su-juan, YU Xin-yu, YU Zu-xi, et al
(Keshan Disease Institute, Harbin Medical University, Harbin 150086, China)
Abstract： Objective To explore the mechanisms of apoptosis in mice myocaditis induced by CVB3m.Methods BALB/C mice were inoculated with 0.1ml 100 TCD50 CVB3m and batch sacrificed later.Histologic,immunohistochemical observations including TUNEL labeling method,and dual fluorescent labeling techniques were performed on mice hearts,and the results were detected by a confocal laser scanning microscopy.Results The myocarditis were detected from all 100% CVB3m infected mice and were most severe at 7～12 days.Apoptosis also increased markedly in inflammatory cells and myocyted at 9～15 days after infection.Immunoreactivities for perforin,granzyme B,caspase-8 and Bax increased considerably in myocardium after infection,and decreased gradually after 20 days,as inflammation subsided.No significant differences were observed in hearts of infected mouse as compared to controls for Bcl-2.Double staining for Bax demonstrated apoptosis in some inflammatory cells.Conclusions The perforin and granzyme B take part in the regulation of myocyte damage and apoptosis in mice myocarditis.Our data suggest that increases of reaction of Caspase-8 and Bax/Bcl-2 was related to apoptosis.
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Key words：Myocarditis; Apoptosis; Perforin
细胞凋亡是一种细胞自发的死亡方式，许多因素可以诱导细胞凋亡。诱导因素不同，细胞死亡途径亦不完全相同。目前已经发现很多种细胞凋亡相关蛋白，但caspase的表达是各种细胞凋亡的最后共同通路[1]。本实验用CVB3m诱发BALB/C小鼠VMC，通过对心肌中细胞凋亡及相关蛋白穿孔素、granzyme B、caspase-8、Bcl-2及Bax的表达进行检测，利用共聚焦显微镜观察结果，以探讨小鼠VMC细胞凋亡的机制。
1 材料与方法
1.1 VMC动物模型的建立[2] 给纯系5周龄雄性BALB/C小鼠腹腔接种0.1 ml 100 TCD50 CVB3m建立小鼠急性VMC模型。心脏标本于光学显微镜下进行常规组织形态学观察。
, 百拇医药
1.2 荧光染色 第一抗体来源见表1；第二抗体为FITC(绿色荧光)标记的兔抗羊或羊抗兔IgG，核染为含4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI，蓝色荧光)的Vectashield,均由Vector公司生产。TUNEL法检测细胞凋亡试剂盒由Oncon公司生产。
表1 第一抗体来源 第一抗体
类型
来源
工作浓度(μg/ml)
Bcl-2
Bax
Perforin
Granzyme B
, 百拇医药
Caspase-8
RP
RP
GP
RP
RP
Oncogene
Oncogene
Santa Cruz Biotechnology
Santa Cruz Biotechnology
Santa Cruz Biotechnology
, 百拇医药 10
10
10
10
10
注：RP：兔抗鼠多克隆抗体；GP：羊抗鼠多克隆抗体
1.3 单荧光染色操作步骤 石蜡切片常规脱蜡、水化后，微波炉法修复抗原15 min,再与5%相应正常封闭血清室温反应30 min。拭去组织上多余液体，加工作浓度的第一抗体于4℃过夜。用0.01 mol/L pH7.4的PBS清洗(5 min,x3)后，与10 μg/ml FITC标记的第二抗体室温反应2 h，最后用含DAPI的Vectashield封片。
1.4 细胞凋亡与Bax双重荧光染色操作步骤 先进行Bax单荧光染色，详细步骤同上。20 μg/ml蛋白酶K消化15 min后，加平衡缓冲液反应5 min。再与TdT酶于37℃反应1 h，加终止反应液室温反应10 min。与工作浓度的Rhodamine(红色荧光)标记的抗地高辛抗体室温反应30 min。最后用含DAPI的Vectashield封片。
, 百拇医药
所有荧光染色标本均应用Leica TCS-4D共聚焦显微镜(装备有紫外和氩氪混合气体激光光源)观察结果。
2 结果
2.1 常规组织形态学检查 CVB3m可诱发小鼠VMC。感染病毒后9～12 d病变达到高峰，检出率达100%。15 d后,病变逐渐修复。至30～50 d，无明显炎性损伤。
2.2 TUNEL法检测[2，3] 感染鼠心肌中可见心肌及炎细胞凋亡，于感染后7～15 d最明显，50 d时仍可见少数散在的心肌细胞凋亡。
2.3 免疫荧光染色结果 对照组小鼠除了部分血管壁细胞可见较弱的Bax阳性反应外，未见穿孔素、granzyme B及caspase-8阳性染色。感染病毒小鼠心肌中可见穿孔素、granzyme B及caspase-8异常染色。穿孔素主要呈线状分布于病灶内部分炎细胞和病灶周围的心肌细胞膜；granzyme B分布于与表达穿孔素蛋白同区域的细胞浆内；caspase-8主要分布于部分炎细胞浆内；一些浸润的炎细胞可见较强的Bax阳性反应，心脏血管壁亦可见Bax中等程度的荧光反应(见插页图A，B，C，D，E，F)。以上各种蛋白的表达程度与心肌炎性损伤的动态改变基本一致。双重荧光染色发现，部分Bax阳性的炎性细胞同时可见凋亡阳性染色(见插页图G，H)。感染及正常对照组小鼠心肌中均未见Bcl-2阳性染色。
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3 讨论
在我们以前所发表的文章中，对CVB3m诱导BALB/C小鼠心肌损伤及心肌细胞凋亡已经有过比较详尽的描述[2，3]，本篇主要是对穿孔素、caspase-8及Bax/Bcl-2与细胞凋亡的关系进行探讨。
穿孔素是一种管型蛋白，主要存在于细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞浆的颗粒中。它可以在自身及靶细胞膜造成穿透性孔道，以便于某些细胞活性物质或毒性丝氨酸蛋白酶(如granzyme B)进入靶细胞，引起靶细胞坏死及凋亡[4]。
caspase是一个含有半胱氨酸活性的胞浆蛋白酶家族，与线虫细胞凋亡诱导基因ced-3高度同源，目前发现最少有13种。研究认为，各种凋亡诱导因素最后都通过caspase起作用，caspase-8和caspase-9被认为是caspase系统的始动环节，caspase-3是终末步骤，起“刽子手”作用。本实验结果显示，在感染鼠心肌中有穿孔素、granzyme B及caspase-8的异常表达，并与凋亡细胞的分布有一定关系。穿孔素主要表达于炎细胞及病灶周围心肌细胞膜，阳性细胞分布范围广，并与炎性损伤的程度基本一致，而凋亡细胞相对较少，提示穿孔素可能为granzyme B提供通道，使其进入靶细胞，启动caspase系统，诱导细胞凋亡。同时，可使病原在细胞间转移，炎性介质浸入心肌细胞，引起细胞坏死。caspase-8主要表达于病灶内的炎细胞浆内，心肌细胞表达不明显，这与小鼠病毒性心肌炎细胞凋亡的表现基本一致。虽然由于实验条件的限制，我们没能进行caspase-8与细胞凋亡的双重染色，但连续切片结果显示，caspase-8与病毒性心肌炎细胞凋亡密切相关。另外，我们也进行了caspase-3的检测，但得到阴性结果，这可能与抗体的敏感性及组织特异性有关。
, http://www.100md.com
Bcl-2是第一个被发现的凋亡抑制因子，对多种细胞凋亡起重要调控作用[5，6]。进一步研究发现，Bcl-2属于一个多基因家族，并不是单独起作用，而是与同家族中其它一些具有诱导细胞凋亡作用的基因协同作用，目前研究较多的是Bax/Bcl-2，结果取决于哪种蛋白活性占优势。Bcl-2家族最后也是通过调控caspase系统而起作用。尽管在本实验中，感染鼠心肌Bcl-2无明显变化，但其家族中的另一种作用相反的Bax蛋白表达明显增多，Bax/Bcl-2的比值增高，而且，一些炎细胞可见Bax和凋亡的双重阳性染色，提示Bax/Bcl-2参与小鼠VMC细胞凋亡的诱导，尤其与炎细胞凋亡密切相关。
细胞凋亡是一个多因素、多机制诱导的细胞自发死亡的方式，虽然在多种疾病发生、发展过程中起重要作用，但不同细胞相关机制不完全相同，本研究结果提示，在小鼠病毒性心肌炎发生发展过程中，心肌中的细胞凋亡可被穿孔素，granzyme B,caspase-8诱导，并受Bax/Bcl-2比值的调节。而通过调控细胞凋亡来实现临床的治疗目的还需要进一步深入研究。
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、图示:共聚焦显微镜照片显示正常(A、C、E和C)和病毒感染9d后的(B、D、F和H)小鼠心肌组织的免疫组化反应结果。细胞核为DAPI(蓝色荧光)复染，放大倍数为650×
A和B：穿孔素单荧光染色结果，感染小鼠(B)心肌细胞膜阳性反应(绿色荧光；箭头)。
C和D：Granzsyme B单荧光染色，感染小鼠(D)心肌及炎细胞浆呈现阳性染色(绿色荧光；箭头)。
E和F：Caspase-8单荧光染色，浸润炎细胞浆呈阳性反应(绿色荧光；箭头)。
G和H：Bax与细胞凋亡对重荧光染色，可见间质内双染的炎细胞(Bax为绿色荧光，主要在细胞质；调亡为红色荧光，在细胞核)
[作者简介]钱素娟(1966-)，女，医学博士。
, http://www.100md.com
参考文献
[1] Salvesen GS,Dixit VM.Caspase activation:The induced-proximity model[J].PNAS,1999,96(20):10964.
[2] 钱素娟，曾宪惠，于维汉.细胞凋亡与小鼠病毒性心肌炎发生发展的关系[J].中国地方病学杂志，1997，16(4)：203.
[3] 钱素娟，万汇娟，于维汉.感染Coxsakie B3m病毒小鼠心肌NOSⅡ蛋白的表达[J].中国地方病学杂志，1998,17(5):303.
[4] Kawai C.From myocarditis to cardiomyopathy:mechanisms of inflammation and cell death:learning from the past for the future[J].Circulation,1999,99(8):1091.
, 百拇医药
[5] Krajewski S,Krajewski M,Shabaik A,et al.Immunohistochem-
ical determination of in vivo distribution of Bax,a dominant inhibitor of Bce-2[J].Am J Pathol,1994,145:1323.
[6] Goping IS,Gross A,Lavoie JN,et al.Regulated targeting of Bax to mitochondria[J].J Cell Biol,1998,143:207.
[收稿日期]1999-12-10;[修订日期]1999-12-21, 百拇医药