动脉压力感受器的离子通道机制
作者：武宇明 何瑞荣
单位：(河北医科大学基础医学研究所生理学研究室(石家庄 050017))
关键词：动脉压力感受器；机械感受器；感受器,感觉；离子通道；钙通道；钾通道；氯化物通道
河北医科大学学报000431
中图号 R331.33
动脉压力感受器反射在维持血压稳定和调节心血管活动中发挥着重要作用。自1924年Hering首次阐述颈动脉压力感受器反射功能以来,有关动脉压力感受器的生理学研究已有大量报道。动脉压力感受器是位于颈动脉窦和主动脉弓部位的慢适应性机械感受器。它们在动脉壁受跨壁压牵张时兴奋,诱发动脉压力感受器反射。传入冲动的发放同压力感受器所在部位血管壁牵张程度呈线性相关。颈动脉窦和主动脉弓压力感受器的传入神经分别为窦神经和主动脉神经(统称为缓冲神经),由有髓(A类)和无髓(C类)两类纤维组成,其神经元胞体分别位于岩神经节(petrosal ganglion)和结状神经节(nodose ganglion)中。动脉压力感受器神经元末梢所在的血管壁上,并不存在类似于外周化学感受器丝球细胞这样的辅助结构,因此初级感受神经元的神经末梢可能就是发生冲动的部位。在动脉壁外膜中,有配列得相当复杂的感觉末梢,感觉信号看来起自这些末梢的变形(deformation)。关于神经末梢是如何感受牵引刺激并产生冲动,即感受器的机-电换能(mechanoelectric transduction)或机-电耦联(mechanoelectric coupling)机制的研究,是近年来比较热点的问题。
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1 压力感受器的感受器电位和机械敏感性离子通道
1.1 感受器电位(generator potential):有学者根据猫肌梭或螯虾牵张感受器这样一些慢适应感受器所得的资料进行外推,认为动脉压力感受器同其它机械感受器一样,当动脉壁变形时感受神经末梢膜对Na+和K+通透性增高,也可能对Ca2+通透性增高。也就是无选择地激活神经元细胞膜上的阳离子电流,产生1个发生器电位,再引发传入神经的放电。Matsuura从颈动脉压力感受器记录到对河豚毒素不敏感的慢电位,有Na+依赖性。细胞外Na+浓度降低5 %(约7 mmol/L)可升高阈压并降低增益,这一发现与细胞兴奋时Na+内流一致。而增加细胞外的K+,则可降低压力感受器的阈压。改变胞外的Ca2+和应用不同的钙通道阻断剂的实验结果是与Ca2+表面电荷效应相符的,而与Ca2+内流后可能导致除极化的结果是相反的。Cl-则不能影响压力感受器放电。看来,压力感受器受到变形引起的膜电流主要由1价阳离子介导。
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1.2 机械敏感性离子通道(mechanosensitive ion channels,MS):1984年Guharay和Sachs在骨骼肌的电压钳实验中首先对MS通道作了报道。MS包括牵引敏感性离子通道(stretch-sensitive channels),移位敏感性通道(displacement-sensitive channels)和剪应力敏感性通道(shear-stress-sensitive channels)。其中牵张敏感性离子通道包括牵张激活性通道(stretch-activated channels,SAC)和牵张失活性通道(stretch-inactivated channels,SIC)。在SAC通道中有:①阴离子,特别是CI-通过的SAAn,②多种阳离子通过的SACat,③K+及类似物通透的SAK,④阴阳离子无选择性SANon,⑤选择性Ca2+通透的SACa。一般认为SIC仅允许K+及类似物通过。即使在某一类型的单个细胞,也往往有多种SAC,它们在电压-电流关系或对离子和阻断剂的敏感性方面各有所不同[1]。已有研究表明,在各类细胞上普遍存在着MS通道。一些组织包括无脊髓动物牵张感受器神经元、鸡心肌细胞、大鼠内皮细胞、肾小管细胞等均存在MS通道。Tavernarakis等最近已克隆出MS通道。MS通道参与调节多种功能,如引起血管内皮细胞释放活性物质,诱发骨骼肌细胞的生长,调控细胞容积以及影响特殊感受器的活动等。
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MS通道具有以下特点:①大多数对阴离子通过有选择性,而对阳离子的通过无选择性,这与文献所述细胞外阳离子浓度变化对动脉压力感受器活动的影响相符;②这种MS通道在膜片微吸管内吸引压达到一定阈值时才开放,这与动脉压力感受器需达阈压才发生冲动相一致;③通道开放机率取决于吸引压,两者之间的关系呈“S”形,这与动脉压力感受器的压力-放电频率之间关系相吻合;④在膜张力增高1个梯级时,通道激活的始动呈“S”形,有 0.5 s延迟[2]。
不少研究表明,动脉压力感受器神经元细胞膜上确实存在MS。在体隔离灌流家兔颈动脉窦的研究发现,MS通道存在于窦神经末梢。当窦内压升高时这些通道开放,Gd3+(1种公认的MS通道阻断剂)可阻断压力刺激所引发的窦神经兴奋[3]。而Andresen和Yang根据对大鼠主动脉弓神经元的研究提出,MS通道介导动脉压力感受器的机-电换能,但Gd3+不能阻断此通道[4]。Hajduczok等则认为,上述实验中Gd3+之所以未能阻断MS通道,可能与观察Gd3+作用的时间较短,抑或有另外1种对Gd3+不敏感的MS通道存在有关。
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Cunningham等应用全细胞电压钳技术发现,大鼠主动脉弓神经元(结状神经节神经元)上有MS通道,低渗造成的膜牵张刺激可明显增加神经元的电流,此电流可被Gd3+阻断[5]。在离体培养的大鼠主动脉弓神经元细胞上观察到,用玻璃微电极机械刺激或向神经元胞体内注射液体,由此对膜造成牵张刺激,可引起神经元细胞膜上的Ca2+内流增加,且由Gd3+敏感的离子通道所介导,而与电压-门控Ca2+通道无关[6]。Ca2+内流量取决于刺激的强度和血管变形的持续时间,同等程度的刺激所引起Ca2+内流量相同。因此,机械刺激所致Ca2+内流增多是不依赖于电压-门控Ca2+通道,而是由机械敏感的SAC介导的[7]。随后,Cunningham等又作了进一步的研究,他们为了使研究更接近生理状态,采用机械刺激神经元轴突方法而不是刺激胞体。将荧光染料carbocyanine dye Dil(1,1'-dioley 1-3,3,3',3'-tetramenthylindocarbocyanine methanesul-phonate)涂布于麻醉大鼠主动脉弓上,1周之后,Dil已从神经末梢经轴浆逆向运输至神经元胞体。取出Dil标记而呈红色的结状神经节细胞,分离培养2～3 d。当神经元上长出轴突后,应用全细胞电压钳技术完成1个极为精密的实验:在实验中考虑到对细胞体的机械刺激常招致高阻封接的破坏和干扰电压的记录,特意向与细胞体相距50～100 μmol/L的轴突作机械刺激。先选择好1个标记的神经元,再将1支充有浸浴溶液、用作刺激的微吸管(尖端直径50～100 μm)推近到刚接触细胞体,随即将吸管自细胞体处退出50 μm,并向外侧移动50～100 μm,使之刚好位于轴突上。再将1个气道注射装置与注射用微吸管相连。在作用时间50 ms、压力5～15 psi条件下注射浸浴液,以引起轴突的变形而受刺激。实验结果表明:机械刺激压力感受器神经元轴突,可引起胞体的内向阳离子流,且此电流随刺激强度而异,并可被Gd3+(20 μmol/L)阻断。如将可与肌动蛋白微丝结合的鬼笔环肽(phalloidin,10 μmol/L)孵育神经元12 h,也可使内向电流阻断。由此得出的结论是:压力感受器神经元轴突的变形,可在细胞体引发1个机械刺激敏感的内向电流,而构成细胞骨架的肌动蛋白微丝则参与此电流的形成[8]。最近,Kraske等对培养的大鼠主动脉压力感受器神经元进行了深入的研究,获得颇为令人信服的实验结果。他们采用细胞贴附式膜片钳技术,记录了结状神经节中压力感受器神经元的单通道电流。实验表明,在用负压吸引神经元时,可激活MS通道;去除负压后,通道迅速关闭。通道激活的频率随负压的加大而增高,即通道开放机率与所作用的负压呈函数关系。在负压达30 mmHg时,通道的开放机率明显增高。该通道的特性为:电压-电流关系呈线性,其斜率电导为114 ps,反转电位接近于0 mV;且此通道不受K+通道阻断剂(TEA和4-AP)、选择性Ca2+激活K+通道抑制剂(charybdotoxin)以及N型Ca2+通道拮抗剂(ω-conotoxin GVIA)的影响。这些特性均为非特异性阳离子电导相符。通道电流的振幅在吸引压达60 mmHg时不再改变。通道的开放并不随测试电压的变动而有明显变化,说明此类通道的激活无电压依赖性。应用Gd3+(20 μmol/L)则可使大多数膜片中的通道被阻断,由此进一步证实Gd3+能阻断主动脉神经元的MS通道。此外,还观察到1个引人注意的问题:在培养的主动脉压力感受器神经元上MS通道的表达,受培养条件的明显影响。当此种神经元单独培养时,所能测得的MS通道为数较少;如果将此类神经元与血管内皮细胞联合培养(采用跨孔培养平板),则可在膜片上测得较多的MS通道,提示内皮细胞可能释放1种可扩散物质,有利于MS通道蛋白的表达。他们还提出,MS通道可能是不均一地分布在整个神经细胞膜,以神经末梢上MS通道的表达最为集中[9]。
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有学者提出,DEG/ENaC蛋白家族的成员(DEG-1,MEC-4,MEC-10,UNC-105和UNC-8)可能起MS通道的作用。Drummond等据此首先对MS通道进行了基因水平的研究。他们发现,ENaC的γ亚单位定位于主动脉弓和颈动脉窦压力感受器神经末梢的机电换能部位上。进而还观察到,在培养的结状神经节压力感受器神经元有γ ENaC的表达。应用抑制DEG/ENaC通道的氨氯吡嗪咪(amiloride,100nM)则可抑制此类通道。以上结果提示,ENaC亚单位可能是压力感受器机电换能装置的功能域,并有可能为深入地阐明血压调节和高血压的机制指明方向[10]。
概括地说,压力感受器兴奋的主要机制是当血压变化引起血管变形时,激活感受器神经元细胞膜上MS通道,引起一些阳离子流动,介导感受器的机-电换能作用。
2 压力感受器神经元的离子流
根据电生理学特性,可将岩神经结和结状神经结的神经元分为两类,即A类和C类。A类神经元发出有髓神经纤维,C类神经元发出无髓神经纤维。A类神经元与C类神经元相比,具有动作电位时程短、峰电位频率快的特点。
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有关A类与C类神经元上离子通道的研究已有不少报道。支配压力感受器的神经末梢是否也存在这些离子通道,乃是1个关键问题。近年来,随着酶分离和电生理技术的进展,已能分离培养单个压力感受器神经元,并应用电压钳技术记录全细胞和单通道离子流。
Schild等[11]对大鼠结状神经节的压力感受器神经元的离子流进行了研究,发现此类神经元上有2种Na+电流通道,即快INaf通道和慢INas通道。快INaf通道存在于A类神经元上,河豚毒素(TTX)能阻断此通道;慢INas通道存在于C类神经元上,TTX不能使其阻断。快INaf通道在膜电位为-50 mV时激活,Na+离子快速内流,使细胞外Na+离子浓度约降低1/3。INas通道在膜电位为-30 mV时激活,其激活速度较慢。最新研究也证明,C类纤维末梢上有对TTX不敏感的INas通道。这说明Na+通道对压力感受器有特殊作用。
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Mendelowitz和Kunge在大鼠结状神经节的感觉神经元上记录到2种Ca2+电流,即短暂的ICa.t和持久的ICa.n2种。ICa.t在膜电位为-70 mV时激活,快速失活,可产生的最大电流为150 μA;而ICa.n在膜电位-30 mV时快速激活,其失活又可分为快慢2个成分。2种电流对双氢吡啶类药物不敏感,但ICa.n可被ω-conotoxin GIVA(1 μmol/L)部分阻断[12]。
一些学者研究了大鼠结状神经节中压力感受器神经元的K+电流。他们观察到,此类神经元上有3型K+电流,即短暂K+电流(IA)、延迟整流K+电流(IK)和Ca2+激活性K+电流(IK(Ca))[11,13]。IK在膜电位为-30 mV时激活(在-10 mV时τ＝5.4～9.2 ms),无明显的失活,4-AP和TEA均可阻断此电流。IA在膜电位为-50 mV时激活,激活速度快(在-10 mV时τ＝1.0～1.5 ms),经10～30 ms后失活,应用4-AP可阻断IA电流。IA电流决定着动脉压升高时压力感受器的适应水平[14,15]。IK(Ca)在胞内Ca2+离子浓度达0.01 μmol/L时激活,是维持静息膜电位的主要离子流,调节神经元的兴奋性[16]。
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3 旁分泌和自分泌物对压力感受器神经元活动的调变作用
压力感受器神经活动还受旁分泌和自分泌物的调控。前列环素和NO均可调节动脉压力感受器的敏感性。
3.1 前列环素(prostaglandin I2,PGI2):前列环素由血管内皮细胞产生,它可作为旁分泌物引起邻近的血管平滑肌舒张。向在体隔离灌流家兔颈动脉窦内注射PGI2,在不引起血管扩张的情况下即可反射地增加腰交感传出神经的活动。据Chen等(1990年)的报道,PGI2可提高颈动脉窦压力感受器的敏感性,易化压力感受器反射。而Hirooka等在将PGI2作用于家兔主动脉弓压力感受器时,肾交感神经放电活动未发生反射性变化。最近,李智等[17]应用全细胞电压钳技术,研究PGI2的类似物Carbacyclin(较PGI2稳定)对培养的大鼠结状神经节中的主动脉弓压力感受器神经元的影响。实验结果显示,在Carbacyclin作用于此类神经元时,可显著地抑制稳态K+电流,且呈剂量依赖性。这种K+电流的抑制并不是胞浆内Ca2+浓度变化间接引起的。应用Ca2+激活K+通道选择性阻断剂Charybdotoxin(ChTX,10-7mol/L),也可抑制这种K+电流。在除去Ca2+或有ChTX存在时,Carbacyclin就不能抑制这种K+电流。应用8-bromo-cAMP(1种可通透膜的c-AMP类似物)或细胞内注射G-蛋白激活剂GTPγS,则可模拟Carbacyclin对K+电流的抑制作用;而G-蛋白阻断剂GDPβS或PKA的肽抑制剂PKI5-24,又可消除上述抑制作用。根据以上结果,他们认为Carbacyclin通过c-AMP依赖性蛋白激酶的G-蛋白偶联激活,对压力感受器神经元中ChTX-敏感性IK(Ca)通道有选择性抑制作用。这些结果从分子水平上解释了PGI2对压力感受器的易化作用,即PGI2通过抑制IK(Ca)而提高压力感受器的兴奋性。
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3.2 一氧化氮(nitric oxide,NO):血管内皮细胞在受压力的牵张刺激或各种化学因素作用时可释放舒血管因子NO。NO由多种细胞(包括神经元)产生。在结状神经节和岩神经节的神经元中均在NO合酶(neuron nitric oxide synthase,nNOS),因而可产生NO。本实验室的研究表明,颈动脉窦区的内源性NO对颈动脉窦压力感受器反射有抑制作用[18]。向兔颈动脉窦内注入NO时,压力感受器传入纤维的放电频率减慢。最近,李智等[19]沿用Dil标记后分离培养的主动脉弓压力感受器神经元标本,观察了NO对此类神经元Na+电流的影响。实验证实,结状神经节中压力感受器神经元上有2种Na+电流,其中1种为对河豚毒素敏感的Na+电流,即INa-s;另1种为该毒素不敏感的Na+电流,即INa-I。当应用NO供体papa-NONOate(1 mmol/L)或nitrosocysteine(0.1～0.5 mmol/L)作用于压力感受器神经元时,上述2种Na+电流均受到抑制。NO供体对Na+电流的抑制效应可被NO清除剂血红蛋白所阻断。以膜可通透的c-GMP类似物8-bromo-cGMP(2 mmol/L)或c-GMP依赖性蛋白激酶的选择性肽抑制剂CG-PKI(360 μmol/L)作预处理后,NO供体依然能抑制压力感受器神经元的INa。烷基化物质N-乙基马来酰亚胺(NEM,2-5 mmol/L)单独作用神经元时并不能改变INa,但能消除NO供体对神经元INa的抑制效应。以上结果说明,NO供体对INa的抑制不依赖于细胞内的c-GMP机制,而是由INa通道的S-亚硝基化(S-nitrosylation)来实现的。进而还由细胞免疫化学染色法显示,结状神经节中一部分压力感受器神经元对nNOS的免疫反应呈阳性,且由化学发光法监测到NO。根据以上各项实验结果,他们提出NO对压力感受器的神经元的INa起1种自分泌调节物作用。
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4 结 语
应当指出,以上大多数研究出自Iowa大学Abboud所领导的实验室,还有待其它研究室加以论证。随着电生理学和分子生物学技术的进展,动脉压力感受器的机-电转换机制的研究迄今已在细胞和分子水平上取得令人瞩目的成果。这对动脉压力感受器作用机制以及高血压发病的深入研究,无疑将揭开新的一页。
参考文献
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(1999-11-25 收稿), 百拇医药
单位：(河北医科大学基础医学研究所生理学研究室(石家庄 050017))
关键词：动脉压力感受器；机械感受器；感受器,感觉；离子通道；钙通道；钾通道；氯化物通道
河北医科大学学报000431
中图号 R331.33
动脉压力感受器反射在维持血压稳定和调节心血管活动中发挥着重要作用。自1924年Hering首次阐述颈动脉压力感受器反射功能以来,有关动脉压力感受器的生理学研究已有大量报道。动脉压力感受器是位于颈动脉窦和主动脉弓部位的慢适应性机械感受器。它们在动脉壁受跨壁压牵张时兴奋,诱发动脉压力感受器反射。传入冲动的发放同压力感受器所在部位血管壁牵张程度呈线性相关。颈动脉窦和主动脉弓压力感受器的传入神经分别为窦神经和主动脉神经(统称为缓冲神经),由有髓(A类)和无髓(C类)两类纤维组成,其神经元胞体分别位于岩神经节(petrosal ganglion)和结状神经节(nodose ganglion)中。动脉压力感受器神经元末梢所在的血管壁上,并不存在类似于外周化学感受器丝球细胞这样的辅助结构,因此初级感受神经元的神经末梢可能就是发生冲动的部位。在动脉壁外膜中,有配列得相当复杂的感觉末梢,感觉信号看来起自这些末梢的变形(deformation)。关于神经末梢是如何感受牵引刺激并产生冲动,即感受器的机-电换能(mechanoelectric transduction)或机-电耦联(mechanoelectric coupling)机制的研究,是近年来比较热点的问题。
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1 压力感受器的感受器电位和机械敏感性离子通道
1.1 感受器电位(generator potential):有学者根据猫肌梭或螯虾牵张感受器这样一些慢适应感受器所得的资料进行外推,认为动脉压力感受器同其它机械感受器一样,当动脉壁变形时感受神经末梢膜对Na+和K+通透性增高,也可能对Ca2+通透性增高。也就是无选择地激活神经元细胞膜上的阳离子电流,产生1个发生器电位,再引发传入神经的放电。Matsuura从颈动脉压力感受器记录到对河豚毒素不敏感的慢电位,有Na+依赖性。细胞外Na+浓度降低5 %(约7 mmol/L)可升高阈压并降低增益,这一发现与细胞兴奋时Na+内流一致。而增加细胞外的K+,则可降低压力感受器的阈压。改变胞外的Ca2+和应用不同的钙通道阻断剂的实验结果是与Ca2+表面电荷效应相符的,而与Ca2+内流后可能导致除极化的结果是相反的。Cl-则不能影响压力感受器放电。看来,压力感受器受到变形引起的膜电流主要由1价阳离子介导。
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1.2 机械敏感性离子通道(mechanosensitive ion channels,MS):1984年Guharay和Sachs在骨骼肌的电压钳实验中首先对MS通道作了报道。MS包括牵引敏感性离子通道(stretch-sensitive channels),移位敏感性通道(displacement-sensitive channels)和剪应力敏感性通道(shear-stress-sensitive channels)。其中牵张敏感性离子通道包括牵张激活性通道(stretch-activated channels,SAC)和牵张失活性通道(stretch-inactivated channels,SIC)。在SAC通道中有:①阴离子,特别是CI-通过的SAAn,②多种阳离子通过的SACat,③K+及类似物通透的SAK,④阴阳离子无选择性SANon,⑤选择性Ca2+通透的SACa。一般认为SIC仅允许K+及类似物通过。即使在某一类型的单个细胞,也往往有多种SAC,它们在电压-电流关系或对离子和阻断剂的敏感性方面各有所不同[1]。已有研究表明,在各类细胞上普遍存在着MS通道。一些组织包括无脊髓动物牵张感受器神经元、鸡心肌细胞、大鼠内皮细胞、肾小管细胞等均存在MS通道。Tavernarakis等最近已克隆出MS通道。MS通道参与调节多种功能,如引起血管内皮细胞释放活性物质,诱发骨骼肌细胞的生长,调控细胞容积以及影响特殊感受器的活动等。
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MS通道具有以下特点:①大多数对阴离子通过有选择性,而对阳离子的通过无选择性,这与文献所述细胞外阳离子浓度变化对动脉压力感受器活动的影响相符;②这种MS通道在膜片微吸管内吸引压达到一定阈值时才开放,这与动脉压力感受器需达阈压才发生冲动相一致;③通道开放机率取决于吸引压,两者之间的关系呈“S”形,这与动脉压力感受器的压力-放电频率之间关系相吻合;④在膜张力增高1个梯级时,通道激活的始动呈“S”形,有 0.5 s延迟[2]。
不少研究表明,动脉压力感受器神经元细胞膜上确实存在MS。在体隔离灌流家兔颈动脉窦的研究发现,MS通道存在于窦神经末梢。当窦内压升高时这些通道开放,Gd3+(1种公认的MS通道阻断剂)可阻断压力刺激所引发的窦神经兴奋[3]。而Andresen和Yang根据对大鼠主动脉弓神经元的研究提出,MS通道介导动脉压力感受器的机-电换能,但Gd3+不能阻断此通道[4]。Hajduczok等则认为,上述实验中Gd3+之所以未能阻断MS通道,可能与观察Gd3+作用的时间较短,抑或有另外1种对Gd3+不敏感的MS通道存在有关。
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Cunningham等应用全细胞电压钳技术发现,大鼠主动脉弓神经元(结状神经节神经元)上有MS通道,低渗造成的膜牵张刺激可明显增加神经元的电流,此电流可被Gd3+阻断[5]。在离体培养的大鼠主动脉弓神经元细胞上观察到,用玻璃微电极机械刺激或向神经元胞体内注射液体,由此对膜造成牵张刺激,可引起神经元细胞膜上的Ca2+内流增加,且由Gd3+敏感的离子通道所介导,而与电压-门控Ca2+通道无关[6]。Ca2+内流量取决于刺激的强度和血管变形的持续时间,同等程度的刺激所引起Ca2+内流量相同。因此,机械刺激所致Ca2+内流增多是不依赖于电压-门控Ca2+通道,而是由机械敏感的SAC介导的[7]。随后,Cunningham等又作了进一步的研究,他们为了使研究更接近生理状态,采用机械刺激神经元轴突方法而不是刺激胞体。将荧光染料carbocyanine dye Dil(1,1'-dioley 1-3,3,3',3'-tetramenthylindocarbocyanine methanesul-phonate)涂布于麻醉大鼠主动脉弓上,1周之后,Dil已从神经末梢经轴浆逆向运输至神经元胞体。取出Dil标记而呈红色的结状神经节细胞,分离培养2～3 d。当神经元上长出轴突后,应用全细胞电压钳技术完成1个极为精密的实验:在实验中考虑到对细胞体的机械刺激常招致高阻封接的破坏和干扰电压的记录,特意向与细胞体相距50～100 μmol/L的轴突作机械刺激。先选择好1个标记的神经元,再将1支充有浸浴溶液、用作刺激的微吸管(尖端直径50～100 μm)推近到刚接触细胞体,随即将吸管自细胞体处退出50 μm,并向外侧移动50～100 μm,使之刚好位于轴突上。再将1个气道注射装置与注射用微吸管相连。在作用时间50 ms、压力5～15 psi条件下注射浸浴液,以引起轴突的变形而受刺激。实验结果表明:机械刺激压力感受器神经元轴突,可引起胞体的内向阳离子流,且此电流随刺激强度而异,并可被Gd3+(20 μmol/L)阻断。如将可与肌动蛋白微丝结合的鬼笔环肽(phalloidin,10 μmol/L)孵育神经元12 h,也可使内向电流阻断。由此得出的结论是:压力感受器神经元轴突的变形,可在细胞体引发1个机械刺激敏感的内向电流,而构成细胞骨架的肌动蛋白微丝则参与此电流的形成[8]。最近,Kraske等对培养的大鼠主动脉压力感受器神经元进行了深入的研究,获得颇为令人信服的实验结果。他们采用细胞贴附式膜片钳技术,记录了结状神经节中压力感受器神经元的单通道电流。实验表明,在用负压吸引神经元时,可激活MS通道;去除负压后,通道迅速关闭。通道激活的频率随负压的加大而增高,即通道开放机率与所作用的负压呈函数关系。在负压达30 mmHg时,通道的开放机率明显增高。该通道的特性为:电压-电流关系呈线性,其斜率电导为114 ps,反转电位接近于0 mV;且此通道不受K+通道阻断剂(TEA和4-AP)、选择性Ca2+激活K+通道抑制剂(charybdotoxin)以及N型Ca2+通道拮抗剂(ω-conotoxin GVIA)的影响。这些特性均为非特异性阳离子电导相符。通道电流的振幅在吸引压达60 mmHg时不再改变。通道的开放并不随测试电压的变动而有明显变化,说明此类通道的激活无电压依赖性。应用Gd3+(20 μmol/L)则可使大多数膜片中的通道被阻断,由此进一步证实Gd3+能阻断主动脉神经元的MS通道。此外,还观察到1个引人注意的问题:在培养的主动脉压力感受器神经元上MS通道的表达,受培养条件的明显影响。当此种神经元单独培养时,所能测得的MS通道为数较少;如果将此类神经元与血管内皮细胞联合培养(采用跨孔培养平板),则可在膜片上测得较多的MS通道,提示内皮细胞可能释放1种可扩散物质,有利于MS通道蛋白的表达。他们还提出,MS通道可能是不均一地分布在整个神经细胞膜,以神经末梢上MS通道的表达最为集中[9]。
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有学者提出,DEG/ENaC蛋白家族的成员(DEG-1,MEC-4,MEC-10,UNC-105和UNC-8)可能起MS通道的作用。Drummond等据此首先对MS通道进行了基因水平的研究。他们发现,ENaC的γ亚单位定位于主动脉弓和颈动脉窦压力感受器神经末梢的机电换能部位上。进而还观察到,在培养的结状神经节压力感受器神经元有γ ENaC的表达。应用抑制DEG/ENaC通道的氨氯吡嗪咪(amiloride,100nM)则可抑制此类通道。以上结果提示,ENaC亚单位可能是压力感受器机电换能装置的功能域,并有可能为深入地阐明血压调节和高血压的机制指明方向[10]。
概括地说,压力感受器兴奋的主要机制是当血压变化引起血管变形时,激活感受器神经元细胞膜上MS通道,引起一些阳离子流动,介导感受器的机-电换能作用。
2 压力感受器神经元的离子流
根据电生理学特性,可将岩神经结和结状神经结的神经元分为两类,即A类和C类。A类神经元发出有髓神经纤维,C类神经元发出无髓神经纤维。A类神经元与C类神经元相比,具有动作电位时程短、峰电位频率快的特点。
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有关A类与C类神经元上离子通道的研究已有不少报道。支配压力感受器的神经末梢是否也存在这些离子通道,乃是1个关键问题。近年来,随着酶分离和电生理技术的进展,已能分离培养单个压力感受器神经元,并应用电压钳技术记录全细胞和单通道离子流。
Schild等[11]对大鼠结状神经节的压力感受器神经元的离子流进行了研究,发现此类神经元上有2种Na+电流通道,即快INaf通道和慢INas通道。快INaf通道存在于A类神经元上,河豚毒素(TTX)能阻断此通道;慢INas通道存在于C类神经元上,TTX不能使其阻断。快INaf通道在膜电位为-50 mV时激活,Na+离子快速内流,使细胞外Na+离子浓度约降低1/3。INas通道在膜电位为-30 mV时激活,其激活速度较慢。最新研究也证明,C类纤维末梢上有对TTX不敏感的INas通道。这说明Na+通道对压力感受器有特殊作用。
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Mendelowitz和Kunge在大鼠结状神经节的感觉神经元上记录到2种Ca2+电流,即短暂的ICa.t和持久的ICa.n2种。ICa.t在膜电位为-70 mV时激活,快速失活,可产生的最大电流为150 μA;而ICa.n在膜电位-30 mV时快速激活,其失活又可分为快慢2个成分。2种电流对双氢吡啶类药物不敏感,但ICa.n可被ω-conotoxin GIVA(1 μmol/L)部分阻断[12]。
一些学者研究了大鼠结状神经节中压力感受器神经元的K+电流。他们观察到,此类神经元上有3型K+电流,即短暂K+电流(IA)、延迟整流K+电流(IK)和Ca2+激活性K+电流(IK(Ca))[11,13]。IK在膜电位为-30 mV时激活(在-10 mV时τ＝5.4～9.2 ms),无明显的失活,4-AP和TEA均可阻断此电流。IA在膜电位为-50 mV时激活,激活速度快(在-10 mV时τ＝1.0～1.5 ms),经10～30 ms后失活,应用4-AP可阻断IA电流。IA电流决定着动脉压升高时压力感受器的适应水平[14,15]。IK(Ca)在胞内Ca2+离子浓度达0.01 μmol/L时激活,是维持静息膜电位的主要离子流,调节神经元的兴奋性[16]。
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3 旁分泌和自分泌物对压力感受器神经元活动的调变作用
压力感受器神经活动还受旁分泌和自分泌物的调控。前列环素和NO均可调节动脉压力感受器的敏感性。
3.1 前列环素(prostaglandin I2,PGI2):前列环素由血管内皮细胞产生,它可作为旁分泌物引起邻近的血管平滑肌舒张。向在体隔离灌流家兔颈动脉窦内注射PGI2,在不引起血管扩张的情况下即可反射地增加腰交感传出神经的活动。据Chen等(1990年)的报道,PGI2可提高颈动脉窦压力感受器的敏感性,易化压力感受器反射。而Hirooka等在将PGI2作用于家兔主动脉弓压力感受器时,肾交感神经放电活动未发生反射性变化。最近,李智等[17]应用全细胞电压钳技术,研究PGI2的类似物Carbacyclin(较PGI2稳定)对培养的大鼠结状神经节中的主动脉弓压力感受器神经元的影响。实验结果显示,在Carbacyclin作用于此类神经元时,可显著地抑制稳态K+电流,且呈剂量依赖性。这种K+电流的抑制并不是胞浆内Ca2+浓度变化间接引起的。应用Ca2+激活K+通道选择性阻断剂Charybdotoxin(ChTX,10-7mol/L),也可抑制这种K+电流。在除去Ca2+或有ChTX存在时,Carbacyclin就不能抑制这种K+电流。应用8-bromo-cAMP(1种可通透膜的c-AMP类似物)或细胞内注射G-蛋白激活剂GTPγS,则可模拟Carbacyclin对K+电流的抑制作用;而G-蛋白阻断剂GDPβS或PKA的肽抑制剂PKI5-24,又可消除上述抑制作用。根据以上结果,他们认为Carbacyclin通过c-AMP依赖性蛋白激酶的G-蛋白偶联激活,对压力感受器神经元中ChTX-敏感性IK(Ca)通道有选择性抑制作用。这些结果从分子水平上解释了PGI2对压力感受器的易化作用,即PGI2通过抑制IK(Ca)而提高压力感受器的兴奋性。
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3.2 一氧化氮(nitric oxide,NO):血管内皮细胞在受压力的牵张刺激或各种化学因素作用时可释放舒血管因子NO。NO由多种细胞(包括神经元)产生。在结状神经节和岩神经节的神经元中均在NO合酶(neuron nitric oxide synthase,nNOS),因而可产生NO。本实验室的研究表明,颈动脉窦区的内源性NO对颈动脉窦压力感受器反射有抑制作用[18]。向兔颈动脉窦内注入NO时,压力感受器传入纤维的放电频率减慢。最近,李智等[19]沿用Dil标记后分离培养的主动脉弓压力感受器神经元标本,观察了NO对此类神经元Na+电流的影响。实验证实,结状神经节中压力感受器神经元上有2种Na+电流,其中1种为对河豚毒素敏感的Na+电流,即INa-s;另1种为该毒素不敏感的Na+电流,即INa-I。当应用NO供体papa-NONOate(1 mmol/L)或nitrosocysteine(0.1～0.5 mmol/L)作用于压力感受器神经元时,上述2种Na+电流均受到抑制。NO供体对Na+电流的抑制效应可被NO清除剂血红蛋白所阻断。以膜可通透的c-GMP类似物8-bromo-cGMP(2 mmol/L)或c-GMP依赖性蛋白激酶的选择性肽抑制剂CG-PKI(360 μmol/L)作预处理后,NO供体依然能抑制压力感受器神经元的INa。烷基化物质N-乙基马来酰亚胺(NEM,2-5 mmol/L)单独作用神经元时并不能改变INa,但能消除NO供体对神经元INa的抑制效应。以上结果说明,NO供体对INa的抑制不依赖于细胞内的c-GMP机制,而是由INa通道的S-亚硝基化(S-nitrosylation)来实现的。进而还由细胞免疫化学染色法显示,结状神经节中一部分压力感受器神经元对nNOS的免疫反应呈阳性,且由化学发光法监测到NO。根据以上各项实验结果,他们提出NO对压力感受器的神经元的INa起1种自分泌调节物作用。
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4 结 语
应当指出,以上大多数研究出自Iowa大学Abboud所领导的实验室,还有待其它研究室加以论证。随着电生理学和分子生物学技术的进展,动脉压力感受器的机-电转换机制的研究迄今已在细胞和分子水平上取得令人瞩目的成果。这对动脉压力感受器作用机制以及高血压发病的深入研究,无疑将揭开新的一页。
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(1999-11-25 收稿), 百拇医药