聚合酶链反应RFLP与SSCP检测伤寒杆菌DNA旋转酶基因变异
作者：肖永红 王其南
单位：重庆医科大学附属第一医院，重庆 400016
关键词：伤寒杆菌；gyrA；聚合酶链反应；单链构象多态性；限制性片段长度多态性
中国抗生素杂志000413 摘要：DNA旋转酶为喹诺酮类抗菌药物作用靶位，其变异为细菌耐药主要原因之一。本文利用PCR-RFLP、SSCP对伤寒杆菌275(临床分离敏感株)及其自发耐药突变株RG1 DNA旋转酶A亚单位基因(gyrA)耐喹诺酮类决定区进行检测，并以DNA序列分析对该变异进行检测。结果表明，与伤寒杆菌275相比，RG1 gyrA第247位由T变异为G，相应于DNA旋转酶A亚单位第83位氨酸由丝氨酸变为丙氨酸。HinfⅠ对PCR产物酶切分析表明有一GANTC序列变异，SSCP则发现伤寒杆菌275与RG1 DNA电泳图象有明确差异。结果表明PCR-RFLP、SSCP检测伤寒杆菌gyrA变异快速、特异和灵敏。
, 百拇医药
中图分类号：R378.2+3 文献标识码：A
文章编号：1001-8689(2000)04-0286-03
Detection of quinolone resistant mutation in gyrA gene of
Salmonella typhi by PCR-RFLP, SSCP
Xiao Yong-hong and Wang Qi-nan
(The First Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Sciences， Chongqing 400016)
ABSTRACT The mutations of DNA gyrase (the antibacterial target of quinolones) are major reasons of quinolone resistance. The quinolone resistant determining regions (QRDR) of gyrA genes of DNA gyrase subunit A of Salmonella typhi 275 (a clinically isolated quinolone susceptible strain) and its spontaneous mutant RG1 were examined in this study with PCR-RFLP and SSCP. DNA sequence of their gyrA QRDR was also made. Results revealed that the base 274 of gyrA in RG1 had a change from T to G. PCR-RFLP suggested that a hydrolysis point of HinfⅠ disappeared from QRDR of RG1 and the electrophoretogram of PCR-SSCP in RG1 was totally different from that of 275. These results indicatd that PCR-SSCP and RFLP are rapid, sensitive and specific methods in the detection of gyrA mutation in Salmonella typhi.
, 百拇医药
KEY WORDS Salmonella typhi； gyrA； PCR； SSCP； RFLP
伤寒为我国常见传染病，氟喹诺酮类作为主要治疗药物的疗效受到广泛关注。随着该类药物广泛应用，耐药伤寒杆菌已有报道。DNA旋转酶为喹诺酮类药物作用靶位，该酶A亚单位编码基因gyrA变异为喹诺酮类耐药的主要机制。本文体外筛选伤寒杆菌耐喹诺酮类菌株，利用聚合酶链反应(PCR)扩增gyrA基因，结合限制性片段长度多态性(RFLP)及单链构象多态性分析(SSCP)、检测gyrA变异，表明PCR-RFLP与SSCP对检测细菌gyrA变异快速、准确。
1 材料与方法
1.1 菌株
伤寒杆菌275(S275)为我院1996年临床病人血培养分离所得对喹诺酮类敏感菌株，用平板法筛选其耐药变异株RG1。挑取单个S275菌落接于10ml Mueller-Hinton肉汤(MHB，每1000ml含牛肉浸膏5g，水解酪蛋白17.5g，可溶性淀粉1.5g)，过夜培养后，以少许菌液均匀涂布于含4mg/L(2×MIC)萘啶酸(NA)的MH琼脂(MHA)，37℃孵育48h后，得耐药变异株RG1，与S275共同用于下列研究。
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1.2 抗菌药物及主要试剂
氧氟沙星(OFLX)由日本第一制药株式会社提供。环丙沙星(CPLX)为太原制药厂提供。NA购自Sigma公司。
多聚酶链反应(PCR)扩增DNA旋转酶A亚单位基因(gyrA)上游引物为5′-TGTCCGAGATGGC-CTGAAGC -3′，位于大肠埃希氏菌gyrA 108～127位碱基；下游引物为5′-TGCCGTCATAGTTATCA-ACG-3′，与大肠埃希氏菌gyrA 435～454位碱基互补。上述引物委托中国科学院微生物研究所基因工程中心合成，合成仪为Beckman Oligo 1000型。dNTP、Taq酶、限制性内切酶HinfⅠ、Wizard PCR产物纯化试剂盒、DNA银染试剂盒均购自Promega公司；DNA测序用Perkin-Elmer之末端标记试剂盒。
1.3 药敏试验
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以试管双倍稀释法测定抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。过夜生长的细菌，以生理盐水稀释为1.5×108CFU/ml，加入含倍比稀释抗生素的系列MHB中，使最终接种量为104～105CFU/ml，37℃孵育18h后观察结果，以能抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。
1.4 PCR扩增gyrA
参考文献方法进行[1]。1ml过夜培养伤寒杆菌，离心10000r/min，5min收集，以600μl TE缓冲液(pH8.0)混悬，加入10% SDS 30μl，37℃孵育1h后，用等量酚、酚氯仿、氯仿提取后作模板DNA。50μl反应混合物含10mmol/L Tris HCl(pH9.0)、50mmol/L KCl、0.1% Tritom X-100、1.5mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、1UTaq酶、上下游引物各50pmol、DNA模板2μl。 初始循环94℃ 1.5min， 60℃ 2min，72℃3min；后续94℃1min，60℃1min，72℃3min，30循环；最后72℃延伸15min；产物以2%琼脂糖电泳，0.5 mg/L溴化乙锭染色，紫外光下观察结果。
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1.5 gyrA PCR产物RFLP及SSCP分析
RFLP分析反应混合物(20μl)含2.5mmol/L Tris乙酸(pH7.8)、10mmol/L乙酸钾、1mmol/L乙酸镁、0.1mmol/L二硫苏糖醇、HinfⅠ 5U及PCR扩增产物5μl，37℃孵育4h后，3%琼脂糖电泳，0.5mg/L溴化乙锭染色，紫外光下观察结果。
SSCP分析用5μl PCR产物，加DNA变性液(含95%甲酰胺、20mmol/L EDTA、0.03%二甲苯兰FF及0.05%溴酚兰)5μl，80℃变性5min后，置冰浴，再于8%聚丙烯酰胺凝胶，15℃电泳，用银染凝胶，观察结果。
1.6 PCR产物测定
利用PCR产物纯化试剂盒，按产品说明纯化gyrA PCR产物，用末端标记测序试剂盒，在Perkin-Elmer ABI300型自动测序仪测序。
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2 结果
2.1 药敏试验
NA、OFLX、CPLX对S275的MIC值分别为2、0.06、<0.03mg/L，对RG1则为512、2、1mg/L，较对S275明显上升32倍以上。
2.2 gyrA PCR扩增RFLP、SSCP分析结果
gyrA扩增结果为347bp DNA片段。伤寒杆菌gyrA PCR产物经HinfⅠ酶切RFLP结果为S275有138、110及99bp三个片段，RG1仅有237、110bp二个片段，即原138与99bp间的酶切点消失。SSCP分析结果表明S275 gyrA有两条核酸带，而RG1仅有一条核酸带，证明RG1 gyrA有变异(图1)。
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图1 伤寒杆菌gyrA PCR-RFLP(A)及SSCP(B)图
2.3 gyrA序列测定
图2示gyrA测序结果，S275与RG1仅一个碱基差异，位于gyrA基因的247位碱基由T变异为G。
图2 伤寒杆菌S275与RG1 gyrA喹诺酮类决定区核苷酸序列(*示与S275相同)
3 讨论
DNA旋转酶为喹诺酮类抗菌作用的靶位，通过DNA旋转酶-DNA-喹诺酮类药物三者形成复合物，阻止DNA超旋型的转化，产生杀菌作用。DNA旋转酶A亚单位变异是细菌产生耐药的主要原因，据耐药菌A亚单位基因序列分析表明，耐药变异常位于旋转酶A亚单位67～106位氨基酸，即所谓耐喹诺酮类决定区，其中尤以83位氨基酸变异最为频繁，也是产生高水平耐药的原因。大肠埃希氏菌、金葡球菌、空肠弯曲菌、流感杆菌、淋球菌、痢疾杆菌、沙门氏菌等GyrA 83位均为丝氨酸，耐药变异后多被疏水性氨基酸，如亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸所替代，该位点因亲水性降低而耐药[2～5]。
, http://www.100md.com
DNA旋转酶A亚单位第83位氨基酸及附近所对应的核酸序列与限制性内切酶HinfⅠ特异性切点G↓ANTC相同，因此利用PCR扩增gyrA耐喹诺酮类决定区，并用HinfⅠ酶切扩增片段，检测该位点变异具有快速、特异的优点。本研究测定S275 gyrA该区域序列也证明，于83位氨基酸密码子周围存在GATTC序列，耐药变异株RG1则第247位碱基由T变为G，使GATTC变为GATGC，不再被HinfⅠ所切割，使RFLP结果表现为S275有138、110及96bp三个片段(另一切点于343与344之间)，而RG1为237与110bp两个核酸片段，可以确定第83位密码子变异。
DNA单链在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其迁移率除取决于DNA链大小外，更与DNA单链所形成的构象有关，相同长度DNA链，若其碱基变换致DNA空间构象发生变化，而出现泳动差异，可将变异DNA与正常DNA加以区别。PCR-SSCP分析技术则利用该原理，将目的DNA先进行PCR扩增，扩增产物以变性剂使DNA成为单链，再以电泳进行检测，该法灵敏性高，可检测一个碱基变异[2，5，6]。本研究表明S275与RG1由于第247位碱基差异，SSCP结果与S275有明显不同。
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由此可见，利用PCR灵敏特异的特征，扩增gryA耐喹诺酮类决定区，再结合SSCP可快速、准确地检测耐喹诺酮类细菌gyrA中少至一个碱基的差异，RFLP对检测gyrA第83位密码子变异也具特异、灵敏优点。以上二法较传统DNA旋转酶分析及DNA测序的研究方法简便和快捷。
作者简介：肖永红：男，生于1965年，博士，副教授。
参考文献
[1] Sambrook J, Fritsch E F, Maniativ T. Molecular cloning, a laboratory manual [M], 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989
[2] Wang T, Tanaka M, Sato K. Detection of grlA and gryA mutations in 344 Staphylococcus aureus strains [J]. Antimicrob Agents Chemother，1998；42：236
, http://www.100md.com
[3] Georgiou M, Munoz R, Roman F, et al. Ciprofloxacin-resistant Haemophilia influenzae strains possess mutations in analogous mutations of GyrA and ParC [J]. Antimicrob Agents Chemother，1996；40：1741
[4] Griggs D J, Gensberg K, Piddock L J. Mutations in gyrA, gene of quinolone-resistant Salmonella serotypes isolated from humans and animals [J]. Antimicrob Agents Chemother，1996；40：1009
[5] Rahman M, Mauff G, Levy J, et al. Detection of 4-quinolone resistance mutation in gyrA gene of Shigella dysenteriae type Ⅰ by PCR [J]. Antimicrob Agents Che-mother，1994；38：2488
[6] 谷志达主编. 现代医学分子生物学[M]. 北京：人民军医出版社，1998
收稿日期：1999-06-23, 百拇医药
单位：重庆医科大学附属第一医院，重庆 400016
关键词：伤寒杆菌；gyrA；聚合酶链反应；单链构象多态性；限制性片段长度多态性
中国抗生素杂志000413 摘要：DNA旋转酶为喹诺酮类抗菌药物作用靶位，其变异为细菌耐药主要原因之一。本文利用PCR-RFLP、SSCP对伤寒杆菌275(临床分离敏感株)及其自发耐药突变株RG1 DNA旋转酶A亚单位基因(gyrA)耐喹诺酮类决定区进行检测，并以DNA序列分析对该变异进行检测。结果表明，与伤寒杆菌275相比，RG1 gyrA第247位由T变异为G，相应于DNA旋转酶A亚单位第83位氨酸由丝氨酸变为丙氨酸。HinfⅠ对PCR产物酶切分析表明有一GANTC序列变异，SSCP则发现伤寒杆菌275与RG1 DNA电泳图象有明确差异。结果表明PCR-RFLP、SSCP检测伤寒杆菌gyrA变异快速、特异和灵敏。
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中图分类号：R378.2+3 文献标识码：A
文章编号：1001-8689(2000)04-0286-03
Detection of quinolone resistant mutation in gyrA gene of
Salmonella typhi by PCR-RFLP, SSCP
Xiao Yong-hong and Wang Qi-nan
(The First Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Sciences， Chongqing 400016)
ABSTRACT The mutations of DNA gyrase (the antibacterial target of quinolones) are major reasons of quinolone resistance. The quinolone resistant determining regions (QRDR) of gyrA genes of DNA gyrase subunit A of Salmonella typhi 275 (a clinically isolated quinolone susceptible strain) and its spontaneous mutant RG1 were examined in this study with PCR-RFLP and SSCP. DNA sequence of their gyrA QRDR was also made. Results revealed that the base 274 of gyrA in RG1 had a change from T to G. PCR-RFLP suggested that a hydrolysis point of HinfⅠ disappeared from QRDR of RG1 and the electrophoretogram of PCR-SSCP in RG1 was totally different from that of 275. These results indicatd that PCR-SSCP and RFLP are rapid, sensitive and specific methods in the detection of gyrA mutation in Salmonella typhi.
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KEY WORDS Salmonella typhi； gyrA； PCR； SSCP； RFLP
伤寒为我国常见传染病，氟喹诺酮类作为主要治疗药物的疗效受到广泛关注。随着该类药物广泛应用，耐药伤寒杆菌已有报道。DNA旋转酶为喹诺酮类药物作用靶位，该酶A亚单位编码基因gyrA变异为喹诺酮类耐药的主要机制。本文体外筛选伤寒杆菌耐喹诺酮类菌株，利用聚合酶链反应(PCR)扩增gyrA基因，结合限制性片段长度多态性(RFLP)及单链构象多态性分析(SSCP)、检测gyrA变异，表明PCR-RFLP与SSCP对检测细菌gyrA变异快速、准确。
1 材料与方法
1.1 菌株
伤寒杆菌275(S275)为我院1996年临床病人血培养分离所得对喹诺酮类敏感菌株，用平板法筛选其耐药变异株RG1。挑取单个S275菌落接于10ml Mueller-Hinton肉汤(MHB，每1000ml含牛肉浸膏5g，水解酪蛋白17.5g，可溶性淀粉1.5g)，过夜培养后，以少许菌液均匀涂布于含4mg/L(2×MIC)萘啶酸(NA)的MH琼脂(MHA)，37℃孵育48h后，得耐药变异株RG1，与S275共同用于下列研究。
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1.2 抗菌药物及主要试剂
氧氟沙星(OFLX)由日本第一制药株式会社提供。环丙沙星(CPLX)为太原制药厂提供。NA购自Sigma公司。
多聚酶链反应(PCR)扩增DNA旋转酶A亚单位基因(gyrA)上游引物为5′-TGTCCGAGATGGC-CTGAAGC -3′，位于大肠埃希氏菌gyrA 108～127位碱基；下游引物为5′-TGCCGTCATAGTTATCA-ACG-3′，与大肠埃希氏菌gyrA 435～454位碱基互补。上述引物委托中国科学院微生物研究所基因工程中心合成，合成仪为Beckman Oligo 1000型。dNTP、Taq酶、限制性内切酶HinfⅠ、Wizard PCR产物纯化试剂盒、DNA银染试剂盒均购自Promega公司；DNA测序用Perkin-Elmer之末端标记试剂盒。
1.3 药敏试验
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以试管双倍稀释法测定抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。过夜生长的细菌，以生理盐水稀释为1.5×108CFU/ml，加入含倍比稀释抗生素的系列MHB中，使最终接种量为104～105CFU/ml，37℃孵育18h后观察结果，以能抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。
1.4 PCR扩增gyrA
参考文献方法进行[1]。1ml过夜培养伤寒杆菌，离心10000r/min，5min收集，以600μl TE缓冲液(pH8.0)混悬，加入10% SDS 30μl，37℃孵育1h后，用等量酚、酚氯仿、氯仿提取后作模板DNA。50μl反应混合物含10mmol/L Tris HCl(pH9.0)、50mmol/L KCl、0.1% Tritom X-100、1.5mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、1UTaq酶、上下游引物各50pmol、DNA模板2μl。 初始循环94℃ 1.5min， 60℃ 2min，72℃3min；后续94℃1min，60℃1min，72℃3min，30循环；最后72℃延伸15min；产物以2%琼脂糖电泳，0.5 mg/L溴化乙锭染色，紫外光下观察结果。
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1.5 gyrA PCR产物RFLP及SSCP分析
RFLP分析反应混合物(20μl)含2.5mmol/L Tris乙酸(pH7.8)、10mmol/L乙酸钾、1mmol/L乙酸镁、0.1mmol/L二硫苏糖醇、HinfⅠ 5U及PCR扩增产物5μl，37℃孵育4h后，3%琼脂糖电泳，0.5mg/L溴化乙锭染色，紫外光下观察结果。
SSCP分析用5μl PCR产物，加DNA变性液(含95%甲酰胺、20mmol/L EDTA、0.03%二甲苯兰FF及0.05%溴酚兰)5μl，80℃变性5min后，置冰浴，再于8%聚丙烯酰胺凝胶，15℃电泳，用银染凝胶，观察结果。
1.6 PCR产物测定
利用PCR产物纯化试剂盒，按产品说明纯化gyrA PCR产物，用末端标记测序试剂盒，在Perkin-Elmer ABI300型自动测序仪测序。
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2 结果
2.1 药敏试验
NA、OFLX、CPLX对S275的MIC值分别为2、0.06、<0.03mg/L，对RG1则为512、2、1mg/L，较对S275明显上升32倍以上。
2.2 gyrA PCR扩增RFLP、SSCP分析结果
gyrA扩增结果为347bp DNA片段。伤寒杆菌gyrA PCR产物经HinfⅠ酶切RFLP结果为S275有138、110及99bp三个片段，RG1仅有237、110bp二个片段，即原138与99bp间的酶切点消失。SSCP分析结果表明S275 gyrA有两条核酸带，而RG1仅有一条核酸带，证明RG1 gyrA有变异(图1)。
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图1 伤寒杆菌gyrA PCR-RFLP(A)及SSCP(B)图
2.3 gyrA序列测定
图2示gyrA测序结果，S275与RG1仅一个碱基差异，位于gyrA基因的247位碱基由T变异为G。
图2 伤寒杆菌S275与RG1 gyrA喹诺酮类决定区核苷酸序列(*示与S275相同)
3 讨论
DNA旋转酶为喹诺酮类抗菌作用的靶位，通过DNA旋转酶-DNA-喹诺酮类药物三者形成复合物，阻止DNA超旋型的转化，产生杀菌作用。DNA旋转酶A亚单位变异是细菌产生耐药的主要原因，据耐药菌A亚单位基因序列分析表明，耐药变异常位于旋转酶A亚单位67～106位氨基酸，即所谓耐喹诺酮类决定区，其中尤以83位氨基酸变异最为频繁，也是产生高水平耐药的原因。大肠埃希氏菌、金葡球菌、空肠弯曲菌、流感杆菌、淋球菌、痢疾杆菌、沙门氏菌等GyrA 83位均为丝氨酸，耐药变异后多被疏水性氨基酸，如亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸所替代，该位点因亲水性降低而耐药[2～5]。
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DNA旋转酶A亚单位第83位氨基酸及附近所对应的核酸序列与限制性内切酶HinfⅠ特异性切点G↓ANTC相同，因此利用PCR扩增gyrA耐喹诺酮类决定区，并用HinfⅠ酶切扩增片段，检测该位点变异具有快速、特异的优点。本研究测定S275 gyrA该区域序列也证明，于83位氨基酸密码子周围存在GATTC序列，耐药变异株RG1则第247位碱基由T变为G，使GATTC变为GATGC，不再被HinfⅠ所切割，使RFLP结果表现为S275有138、110及96bp三个片段(另一切点于343与344之间)，而RG1为237与110bp两个核酸片段，可以确定第83位密码子变异。
DNA单链在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其迁移率除取决于DNA链大小外，更与DNA单链所形成的构象有关，相同长度DNA链，若其碱基变换致DNA空间构象发生变化，而出现泳动差异，可将变异DNA与正常DNA加以区别。PCR-SSCP分析技术则利用该原理，将目的DNA先进行PCR扩增，扩增产物以变性剂使DNA成为单链，再以电泳进行检测，该法灵敏性高，可检测一个碱基变异[2，5，6]。本研究表明S275与RG1由于第247位碱基差异，SSCP结果与S275有明显不同。
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由此可见，利用PCR灵敏特异的特征，扩增gryA耐喹诺酮类决定区，再结合SSCP可快速、准确地检测耐喹诺酮类细菌gyrA中少至一个碱基的差异，RFLP对检测gyrA第83位密码子变异也具特异、灵敏优点。以上二法较传统DNA旋转酶分析及DNA测序的研究方法简便和快捷。
作者简介：肖永红：男，生于1965年，博士，副教授。
参考文献
[1] Sambrook J, Fritsch E F, Maniativ T. Molecular cloning, a laboratory manual [M], 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989
[2] Wang T, Tanaka M, Sato K. Detection of grlA and gryA mutations in 344 Staphylococcus aureus strains [J]. Antimicrob Agents Chemother，1998；42：236
, http://www.100md.com
[3] Georgiou M, Munoz R, Roman F, et al. Ciprofloxacin-resistant Haemophilia influenzae strains possess mutations in analogous mutations of GyrA and ParC [J]. Antimicrob Agents Chemother，1996；40：1741
[4] Griggs D J, Gensberg K, Piddock L J. Mutations in gyrA, gene of quinolone-resistant Salmonella serotypes isolated from humans and animals [J]. Antimicrob Agents Chemother，1996；40：1009
[5] Rahman M, Mauff G, Levy J, et al. Detection of 4-quinolone resistance mutation in gyrA gene of Shigella dysenteriae type Ⅰ by PCR [J]. Antimicrob Agents Che-mother，1994；38：2488
[6] 谷志达主编. 现代医学分子生物学[M]. 北京：人民军医出版社，1998
收稿日期：1999-06-23, 百拇医药