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编号:10223503
乙型肝炎病毒感染者HLA-DRB基因分型及其相关性研究
http://www.100md.com 《第三军医大学学报》 2000年第4期
     作者:刘建平 林辉 宋建勇

    单位:刘建平(第三军医大学预防医学系流行病学教研室,重庆 400038);林辉(第三军医大学预防医学系流行病学教研室,重庆 400038);宋建勇(第三军医大学预防医学系流行病学教研室,重庆 400038)

    关键词:HBV感染;HLA-DRB;基因分型;聚合酶链反应(PCR)

    第三军医大学学报000416 提 要: 目的 探索乙肝病毒(HBV)感染者HLA-DRB基因 频率及其与疾病的相关性。方法 用PCR-SSP对重庆地区汉族乙肝患者4 0例和正常人120名进行HLA-DRB基因分型,结合临床病型与HBV复制状态作相关性分析。结果:重庆地区汉族正常人以DR2(15)、DR5(12)、DR9位点 常见,乙肝患者与之比较DR3基因频率明显增高(P< 0.05),DR5(12 )、DR7基 因频率也有增高,均见于慢性乙肝和肝硬化,相对危险度DR3为2.4,DR7为2.0。DR7基 因多见于HBV高复制状态,相对危险度为2.4。结论:HLA-DR3基因与 重庆地区汉族慢性乙肝和肝硬化相关,DR7与HBV高复制状态有关;免疫遗传因素参与慢性 乙肝的发病机制。
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    中图法分类号: R512.62 文献标识码:A

    文章编号:1000-5404(2000)04-0354-03

    HLA-DRB genotyping and its relation in patients with HBV infection

    LIU Jia-ping, LIN Hui, SONG Jian-yong

    (Department of Epide miology, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)

    Abstract: Objective To study the frequency of dif ferent genotypes of HLA-DRB gene and their relations to HBV infection. Methods HLA-DRB genotyping was conducted in 40 cases of HBV infection and 120 healthy subjects with polymerase chian reaction-sequence specific prime r (PCR-SSP). All the patients and healthy subjects were residents of chongqing district and belonged to Han Natiionality. The relationship of different genotyp es of HLA-DRB with the clinical types of HBV infection was analyzed. Re sults HLA-DR2(15), DR5(12) and DR9 were the frequent gen otypes in the healthy residents of Chongqing with the frequency of 18.3%, 16.7% and 14.2% respectively. The frequency of HLA-DR3 was increased from 3.3% in h ealthy subjects to 12.5% in patients with chronic hepatitis B and hepatitis B-a ssociated liver cirrhosis (P< 0.05). The frequency of HLA-DR 5(12) and HLA-DR7 was also increased in those patients. The relative risk coefficient w as 2.4 for HLA-DR3 and 2.0 for HLA-DR7. HLA-DR7 was usually found in hi gh replication condition of HBV with a relative risk coefficient of 2.4. Conclusion HLA-DR3 is related to hepatitis B and liver cirrhosis o f the Han Nationality in Chongqing district. HLA-DR7 is usually found in high replication condition of HBV. And immune and genetic factors participate in the pathogenesis of hepatitis B.
, 百拇医药
    Key words: HBV infection; HLA-DRB gene; genotyping; polymerase chain reaction (PCR)▲

    人体感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)后的临床表现形式多样,其预后各不 相同。这与机体对HBV免疫应答(Ir)方式不同有关,而机体的Ir基因位于人主要组织相容性 复合物(即HLA基因)的D区。研究HLA-DR基因型与HBV不同感染形式之间的相关性,本文用聚 合酶链反应(PCR)技术序列特异性引物扩增DNA片段,检测120名重庆地区汉族正常人和40例 乙型肝炎(乙肝)患者HLA-DRB基因频率分布,分析其与HBV复制水平的相关性,从免疫遗传角度探讨慢性乙肝的发生机制。

    1 材料与方法

    1.1 研究对象

    1.1.1 HBV感染者 40例乙肝取自本校西南医院感染病科和消化科住院患者,经临床和病 原学诊断的病例包括急性黄疸型乙型肝炎3例,慢性乙肝25例,乙肝后肝硬化12例。诊断均 符合1995年《病毒性肝炎防治方案》中的标准,未做病理组织学分型。患者均为重庆地区汉 族人,其中男29例,女11例,平均年龄40.2岁(23~72岁)。
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    1.1.2 正常对照 120名对照来源于本校新桥医院输血科,为本地汉族健康献血员,其中 ,男76名,女44名,平均年龄36.5岁(21~47岁)。

    1.2 外周血单个核细胞DNA提取

    取肝素抗凝血3 ml,室温下2 000 r/min离心5 min,吸取白细胞层,以1×TEN( 1 mol/L Tris.HCl+5 mol/L NaCl+0.5 mol/L EDTA)以及10% SDS混合振荡,加入蛋白酶K(P K 1 mg/ml)30 μl,37°C振荡过夜。加入等量酚氯仿混合液充分混匀,4 0 00 r/m in离心5 min,反复2次,取上清加二倍无水乙醇混匀,可见DNA呈线状析出,离心弃上清后 加70%乙醇洗2次,真空干燥20 min,溶于200 μl Tris.HCl EDTA液(PH 8.0),以紫外分 光光度计检测DNA含量。

, http://www.100md.com     1.3 HLA-DRB基因分型

    采用中国医学科学院基础所生产的“HLA-DRB基因分型试剂盒”(批号981026)序列特异 性引物PCR(PCR-SSP)方法扩增DR1、DR2(15)、DR2(16)、DR3、DR4、DR 5(11)、DR5(12)、DR6(13)、DR6(14)、DR7、DR8、DR9共 计12个基因位点。基本原理根据第11届国际HLA Workshop会议确定的HLA-DRB基因核苷酸 序列,设计一系列组特异的序列特异性引物。在适宜的反应体系中经Tag DNA聚合酶催化, 扩增出不同序列的PCR产物。经2%琼脂糖凝胶电泳分离后,与标准型别的阳性对照比较,在 紫外灯下直接判断和确定HLA-DRB基因型别。
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    1.4 HBV检测

    标志物用ELISA法检测,HBV DNA用斑点杂交检测。

    1.5 统计学方法

    所得数据进入Epi 5.01b软件,用卡方检验计算χ2值,Yate's校正P值,Fisher氏精确概率检验P值。

    2 结果

    2.1 重庆地区汉族正常人HLA-DRB亚型基因频率分布

    提取DNA经PCR扩增电泳后呈现明显条带。结果表明,本地区正常人群以DR2(15) 、DR5(12)、DR9位点常见,其基因频率分别为18.3%、16.7%、14.2%。
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    2.2 乙肝患者HLA-DRB亚型基因频率分布

    DRB基因位点连锁亚型分布与正常人群比较,见表1。乙肝患者DR3基因频率明显增高 ,统计学处理差异显著(P< 0.05);DR5(12)、DR7基因频率 也有升高,但未 达到统计学差异;这些基因亚型均出现在慢性乙肝和肝硬化患者。携带DR3、DR7基因位 点发生慢性乙肝或肝硬化的相对危险度(RR)分别为2.40和2.0,见表2。

    2.3 乙肝患者HBV复制状态与DRB基因的关系

    根据HBV标志物和HBV DNA检测结果将乙肝患者分为HBV高复制状态(HBeAg和/或HBV DNA 阳性)和低复制状态(抗-HBe阳性,HBeAg阴性),比较两者DRB基因频率差异,见表3。
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    可见,DR7基因位点在HBV高复制状态多见(P< 0.05),其RR为2.42 ,其余各基因位点未发现显著差异。

    表1 慢性乙肝及肝硬化患者HLA-DRB基因连锁型分布

    Tab 1 HLA-DRB gene linkage in patients with chronic

    hepatit is B and liver cirrhosis HLA-DRB linkage

    Chronic he patitis B

    Hepatitis B-associated cirrhosis

    DR2(15)-DR9
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    -

    1

    DR2(16)-DR5(12)

    1

    1

    DR3-DR1

    1

    -

    DR3-DR9

    -

    1

    DR5(11)-DR7
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    2

    -

    DR5(11)-DR5(12)

    -

    1

    DR5(12)-DR3

    -

    1

    DR5(12)-DR4

    1

    -
, 百拇医药
    DR5(12)-DR7

    1

    -

    DR9-DR4

    1

    -

    表2 乙肝患者与正常人HLA-DRB基因频率比较

    Tab 2 Comparison of HLA-DRB gene frequency in patients with hepatitis B and in healthy subjects

    Hepatitis B group(n=40)
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    Control (n=120)

    HLA-DRB gene

    No.

    Frequency(% )

    No.

    Frequency(%)

    Chi square

    Pc value

    RR (95%CI)

    DR1

    1

    2.5
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    2

    1.7

    0.11

    1.00*

    1.34 (0.26~6.80)

    DR2(15)

    8

    20.0

    22

    18.3

    0.05

    1.00
, 百拇医药
    1.08(0.56~2 .11)

    DR2(16)

    2

    5.0

    5

    4.2

    0.05

    0.82

    1.15(0.35~3.83)

    DR3

    5

    12.5
, 百拇医药
    4

    3.3

    4.72

    0.04*

    2.40(1.25~4.60)

    DR4

    2

    5.0

    10

    8.3

    0.48

    0.73*
, 百拇医药
    0.65(0.18~2.37)

    DR5(11)

    3

    7.5

    9

    7.5

    0.00

    1.00*

    1.00(0.36~2.7 7)

    DR5(12)

    11

    27.5
, 百拇医药
    20

    16.7

    2.24

    0.20

    1.58(0.89~2. 80)

    DR6(13)

    1

    2.5

    7

    5.8

    0.70

    0.68*
, 百拇医药
    0.49(0.08~3.1 1)

    DR6(14)

    0

    0

    5

    4.2

    1.71

    0.33

    0.00

    DR7

    6

    15.0

, 百拇医药     7

    5.8

    3.36

    0.13

    2.00(1.03~3.85)

    DR8

    2

    5.0

    7

    5.8

    0.04

    1.00*

    0.88(0.25~3.09)
, 百拇医药
    DR9

    6

    15.0

    17

    14.2

    0.02

    1.89

    1.05(0.50~2.22)

    DRvacancy

    2

    5.0

    5
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    4.2

    0.05

    1.00*

    1.15(0.35~3 .83)

    Pc:Corrected P value;*:Fisher exact test;RR:Relative risk; CI:C onfidence interval

    表3 HBV不同复制状态HLA-DRB基因亚型比较

    Tab 3 Comparison of HLA-DRB subtypes in different replication of HBV HLA-DRB Subtype

    H igh replication(n=17)
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    Low replication(n=17)

    Chi square

    Fisher's P value

    RR(95%CI)

    DR1

    0

    1

    1.00

    1.00

    0.00

    DR2(15)

    5
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    4

    0.15

    1.00

    1.16(0.57~2.36)

    DR2(16)

    1

    1

    0.00

    1.00

    1.00

    DR3

    0

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    4.40

    0.10

    0.00

    DR4

    0

    2

    2.06

    0.49

    0.00

    DR5(11)

    2

    1
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    0.35

    1.00

    1.38(0.57~3.32)

    DR5(12)

    8

    4

    2.00

    0.28

    1.63(0.86~3.10)

    DR7

    5

    0
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    5.69

    0.04

    2.42(1.57~3.73)

    DR9

    1

    4

    2.05

    0.34

    0.36(0.06~2.16)

    3 讨论

    HLA是目前所知的最具有高度多态性的遗传系统,作为个体组织细胞的遗传标志,特别 是免疫细胞上的HLA具有向抗原特异性T细胞受体传递抗原多肽的生物学特性,在抗原识别、 免疫应答和免疫调控,破坏外来抗原靶细胞方面起着重要作用。近年来寻找与疾病相关的HL A基因并探讨其在疾病发生中的作用已成为HLA系统研究的一个热门和重点领域。研究表明, 人感染HBV后临床表现的多样性除与病毒本身的变异有关外,另一很重要的因素在于机体对H BV应答的个体遗传差异。国内有关HLA基因分型与HBV感染相关性的研究极少报道。
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    本文对HLA-DRB基因(表达DR1-18,DR51-53位点)的分型表明,DR3位点 与慢性乙肝和乙肝后肝硬化有关,携带DR3位点的个体感染HBV后易发生慢性感染,其RR为 2.4。DR7、DR5(12)位点可能与慢性乙肝有关,其确证需扩大样本进一步研究,DR 7位点与HBV高复制状态有关,推测HBV感染携带DR7位点者病毒不易清除,呈持续感染状 态,因而临床表现为慢性化。这一结果与国外对接种乙肝疫苗后无(弱)应答状态HLA-DR位 点分型结果相吻合[1~3],即最多见的位点为DR7、DR3以及两者的结合型。We issman等[2]认为造成无应签状态的原因与携带上述亚型者难以将HBsAg信息提 呈给T细胞,并产生抗体有关,其确切机制尚有待深入研究。日本Zeniya等[4]的研 究表明,HBV无症状携带者和组织学损害轻微的慢性乙肝DR5基因频率明显升高(P < 0.0 5),认为免疫遗传背景是决定HBV感染疾病易感性的重要因素之一。Thursz等[5]在 西非的研究表明,DR6(13)基因位点与儿童和成年人HBV感染自然恢复即免于持续性感染有关。因此,对呈自限性的急性乙肝比较研究将有可能发现对抗HB V慢性感染的抗病基因。由于人种和地域的差异,为阐明HBV感染与HLA基因型的关系,针对 我国国情,建议进行全国范围内的协作,扩大HLA基因分型的类别,进行家系研究,并结合 临床肝组织病理和肝损害情况深入研究,以探明HBV相关的疾病易感(或抗病)基因及其在发 病机制中的作用,为乙肝的防治寻找新的突破口。
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    基金项目:第三军医大学科研基金资助项目(X96-1-3)

    作者简介:刘建平(1961-),男,山东省菜西市人,博士, 副教授,主要从事传染病、流行病方面的研究,发表论文46篇。电话:(023)68752287

    参考文献:

    [1] Wolfgang J, Schmidt M, Deinhardt F. Vaccination against hep atitis B: Comparison of three different vaccination schedules[J]. J Infect Dis ,1989,160(5):766-769.

    [2] Weissman J Y, Mark M T, Myron J T, et al. Lack of respons e to r ecombinant hepatitis B vaccine in nonresponders to the plasma vaccine[J]. JAMA ,1988,260(12):1 734-1 738.
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    [3] Canho R, Grosheide P M, Schalm S W, et al. Failure of neo natal hepatits B vaccination: The role of HBV DNA levels in hepatitis B carrier mother s and HLA antigens in neonates[J]. J Hepatol,1994,20(4):483-486.

    [4] Zeniya M, Watanabe F, Aizawa Y, et al. Immunogenetic back ground of hepatitis B virus infection and autoimmune hepatitis in Japan[J]. Gastroen terol Jpn,1993,28(Suppl 4):69-75.

    [5] Thursz M R, Kwiatkowski D, Allsopp C, et al. Association betwee n and MHC class Ⅱ allele and clearance of hepatitis B virus in the Gambia[J]. N Engl J Med,1995,232(16):1 065-1 069.

    收稿日期:1999-05-17;修回日期:1999-12-22, 百拇医药