H2O2致小鼠淋巴细胞DNA的损伤及修复
作者：程绍辉 卜黎明 刘宁 孙殿军
单位：中国地方病防治研究中心 大骨节病研究所，黑龙江 哈尔滨 150001
关键词：单细胞电泳；氧化损伤；DNA损伤
中国地方病学杂志000402 [摘要] 目的 应用单细胞电泳检测(SCGE)过氧化氢(H2O2)致小鼠淋巴细胞DNA损伤及其修复。方法 标准SCGE条件下荧光显微镜观察。结果 H2O2不同浓度80、160和320 μmol/L，3个组H2O2浓度均可致小鼠淋巴细胞DNA损伤，较低剂量即可造成细胞拖尾，可逆性损伤在60 min内可获得明显修复。结论 单细胞电泳可快速灵敏地检测氧化损伤，也可能用于流行病学研究。
[中图分类号] Q464；Q523 [文献标识码] A
, http://www.100md.com
[文章编号]1000-4955(2000)04-243-02
Experimental study of DNA damage induced by H2O2 in lymphocytes
CHENG Shao-hui, BU Li-ming, LIU Ning, et al
(Kashin-Beck Disease Institute, Chinese Research Center for Endemic Disease Control, Harbin 150001, China)
Abstract： Objective To monitor DNA damages and repairs in lymphocytes.Method Single cell gel elecrophoresis (SCGE) assay was used.Result The study showed that H2O2 caused DNA damage which could also be repaired in lymphocytes.Conclusions SCGE was a fast and sensitive method to detect cell oxidative damage caused by H2O2.The assay may be also useful in molecular epidemiology.
, 百拇医药
Key words：SCGE; Oxidative damage; DNA damage and repair
近年来，在地方病病因研究中已多有涉及可能致癌的物质如砷、真菌毒素(Mycotoxin)等，提示应改进方法与技术，迅速开展相关的研究。本实验利用单细胞电泳检测(SCGE)法观察过氧化氢(H2O2)致小鼠淋巴细胞损伤及其修复的时间动态变化，可作为规范样品处理过程的参考。
1 材料与方法
1.1 H2O2损伤实验 取健康小鼠，无菌取脾，用PBS液吹打脾脏制成细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，细胞悬液用H2O2稀释至80、160和320 μmol/L,并调整细胞浓度至2×106/ml；经处理的细胞悬液置37℃恒温箱1 h，备用。
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1.2 修复实验 将处理后1 h的细胞悬液离心3 min(2 500 r/min)，弃去PBS液，用1640完全培养液将细胞吹打悬浮，调整细胞浓度至2×106/ml。经处理的细胞悬液置37℃恒温箱1 h，备用。
1.3 单细胞电泳
1.3.1 制片 100 μl PBS液配制的0.6%正常熔点熔解后滴加在磨沙载玻片中，用盖玻片使胶均匀展开，4℃下固化5 min，即第1层胶。取新鲜制备的细胞悬液10 μl，在37℃下与90 μl低熔点琼脂糖混匀后加入到第1层胶上，立即盖上盖玻片，4℃固化10 min,即第2层胶。将100 μl低熔点琼脂糖铺在第2层胶上，加盖玻片4℃下固化10 min,即第3层胶。
1.3.2 裂解 取下盖玻片，将凝胶载玻片浸没于新配制的裂解液中(2.5 mol/L NaCl 10 mmol/L Tris 1%十二烷基肌氨酸钠pH=10用前加入1% Triton-100和10%DMSO)。
, 百拇医药
1.3.3 解旋 从裂解液中取出载玻片，用蒸馏水洗去多余的NaCl后移入水平电泳槽内解旋40 min(1mmol/L Na2EDTA,300 mmol/L NaOH,pH=13)。
1.3.4 电泳 电压25V，电泳300 mA,低温避光，电泳时间40 min。
1.3.5 染色和观察 0.4 mol/L Tris漂洗3次，每次5 min，然后滴加300 μl 5 μg/ml溴化乙锭染色15 min,放置4℃避光保存，选择激发波长400 nm，光栅波长590 nm，视野200倍，135(ISO 400)黑白胶片同步照像，每片随机观察50个细胞。用目镜测微尺测量细胞拖尾尾长距离。
2 结果
经H2O2处理组及修复各实验组细胞拖尾尾长结果(表1，图1)。
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表1 剂量及处理时间与实验细胞拖尾长度(
±s) H2O2剂量
(μmol/L)
处理2 h尾长
(μm)
处理1h尾长
(μm)
0
80
160
320
11.3 ±4.1
, http://www.100md.com
28.26±11.3*
41.8 ±14.4*
54.2 ±17.1
11.4 ±8.33
12.8 ±4.8*
13.75±6.78*
20.77±6.41*
*表示与H2O2阴性对照组相比P<0.01
由表可见随着氧化损伤加重，细胞拖尾延长。二者呈现高度相关(r=0.97,P<0.05)。如图2所示，320 μmol/L H2O2处理组和160 μmol/L H2O2处理组造成淋巴细胞明显拖尾，80 μmol/L H2O2处理组淋巴细胞轻度拖尾；从恢复实验中可以看到320 μmol/L H2O2处理组仍有明显的拖尾现象，而80 μmol/L H2O2处理组修复1 h后尾长已接近正常细胞。
, 百拇医药
图1 H2O2对淋巴细胞的DNA损伤和修复
图2 SCGE法观察实例(×400)
图3 SCGE法观察实例
3 讨论
疾病发生的病理生理机制,最终要靠对人体、人群的直接观察才可解决。近代研究，包括地方病病因学研究，都提出了利用非损伤性的简易方法研究人群DNA损伤与危害因素的相关剂量效应[1，2]。本实验室已经做过连续数年的探索，并且注意到可修复性改变，在实验室、现场研究中技术和理论的价值[3]。国外有文献报道，可修复缺如、或者较差DNA损伤与肿瘤形成的关联更加密切[4]。作者认为在实验室或现场的研究中引进判别、解释可修复现象的技术和理论，将十分有利于SCGE方法的改进与应用。本实验提供的数据说明，搁置1h既有明显的修复，可以设想，间隔时间越长，修复的程度也会越高。而且可修复与不可修复显然对于鉴别危险暴露因素的性质有重要参考价值。
, 百拇医药
氧化损伤的DNA断裂后迅速修复现象，可能是断裂后DNA的粘性末端重新连接成的[5]。该现象说明，在SCGE法观察DNA损伤时，必须注意采样的时间间隔，避开修复现象的混杂作用。
[基金来源]哈尔滨医科大学211课题基金(1998-08)
[作者简介]程绍辉(1972-)，男，博士研究生。
参考文献
[1] 孙殿军，杨建伯，张勇红.T-2毒素对雏鸡软骨、肝脏蛋白质、DNA合成的抑制[J].中国地方病学杂志，1995，15(1)：10-12.
[2] Migliore L,Nieri M,Amodio S.The human lymphocytes micronucleus assay:a comparison between whole-blood and separated-lymphocyte cultures[J].Mt.Res,1989,(227):167-172.
, 百拇医药
[3] 任志红.T-2毒素致DNA损伤的SCGE法观察[D].哈尔滨医科大学博士论文.哈尔滨医科大学，1999.
[4] Froelich JJ,Schneller FR,Zahn RK.The influence of radiation and chemotherapy-related DNA strand breaks on carcinogenesis:an evaluation[J].Clin Chem Lab Med,1999,(37):403-408.
[5] Andrew R Collins,Victoria L Dobson,Maria Dusinska.The comet assay:what can it really tell us[J].Mutation research,1997,(375):183-193.
[收稿日期]1999-12-24;[修订日期]2000-01-12, 百拇医药
单位：中国地方病防治研究中心 大骨节病研究所，黑龙江 哈尔滨 150001
关键词：单细胞电泳；氧化损伤；DNA损伤
中国地方病学杂志000402 [摘要] 目的 应用单细胞电泳检测(SCGE)过氧化氢(H2O2)致小鼠淋巴细胞DNA损伤及其修复。方法 标准SCGE条件下荧光显微镜观察。结果 H2O2不同浓度80、160和320 μmol/L，3个组H2O2浓度均可致小鼠淋巴细胞DNA损伤，较低剂量即可造成细胞拖尾，可逆性损伤在60 min内可获得明显修复。结论 单细胞电泳可快速灵敏地检测氧化损伤，也可能用于流行病学研究。
[中图分类号] Q464；Q523 [文献标识码] A
, http://www.100md.com
[文章编号]1000-4955(2000)04-243-02
Experimental study of DNA damage induced by H2O2 in lymphocytes
CHENG Shao-hui, BU Li-ming, LIU Ning, et al
(Kashin-Beck Disease Institute, Chinese Research Center for Endemic Disease Control, Harbin 150001, China)
Abstract： Objective To monitor DNA damages and repairs in lymphocytes.Method Single cell gel elecrophoresis (SCGE) assay was used.Result The study showed that H2O2 caused DNA damage which could also be repaired in lymphocytes.Conclusions SCGE was a fast and sensitive method to detect cell oxidative damage caused by H2O2.The assay may be also useful in molecular epidemiology.
, 百拇医药
Key words：SCGE; Oxidative damage; DNA damage and repair
近年来，在地方病病因研究中已多有涉及可能致癌的物质如砷、真菌毒素(Mycotoxin)等，提示应改进方法与技术，迅速开展相关的研究。本实验利用单细胞电泳检测(SCGE)法观察过氧化氢(H2O2)致小鼠淋巴细胞损伤及其修复的时间动态变化，可作为规范样品处理过程的参考。
1 材料与方法
1.1 H2O2损伤实验 取健康小鼠，无菌取脾，用PBS液吹打脾脏制成细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，细胞悬液用H2O2稀释至80、160和320 μmol/L,并调整细胞浓度至2×106/ml；经处理的细胞悬液置37℃恒温箱1 h，备用。
, http://www.100md.com
1.2 修复实验 将处理后1 h的细胞悬液离心3 min(2 500 r/min)，弃去PBS液，用1640完全培养液将细胞吹打悬浮，调整细胞浓度至2×106/ml。经处理的细胞悬液置37℃恒温箱1 h，备用。
1.3 单细胞电泳
1.3.1 制片 100 μl PBS液配制的0.6%正常熔点熔解后滴加在磨沙载玻片中，用盖玻片使胶均匀展开，4℃下固化5 min，即第1层胶。取新鲜制备的细胞悬液10 μl，在37℃下与90 μl低熔点琼脂糖混匀后加入到第1层胶上，立即盖上盖玻片，4℃固化10 min,即第2层胶。将100 μl低熔点琼脂糖铺在第2层胶上，加盖玻片4℃下固化10 min,即第3层胶。
1.3.2 裂解 取下盖玻片，将凝胶载玻片浸没于新配制的裂解液中(2.5 mol/L NaCl 10 mmol/L Tris 1%十二烷基肌氨酸钠pH=10用前加入1% Triton-100和10%DMSO)。
, 百拇医药
1.3.3 解旋 从裂解液中取出载玻片，用蒸馏水洗去多余的NaCl后移入水平电泳槽内解旋40 min(1mmol/L Na2EDTA,300 mmol/L NaOH,pH=13)。
1.3.4 电泳 电压25V，电泳300 mA,低温避光，电泳时间40 min。
1.3.5 染色和观察 0.4 mol/L Tris漂洗3次，每次5 min，然后滴加300 μl 5 μg/ml溴化乙锭染色15 min,放置4℃避光保存，选择激发波长400 nm，光栅波长590 nm，视野200倍，135(ISO 400)黑白胶片同步照像，每片随机观察50个细胞。用目镜测微尺测量细胞拖尾尾长距离。
2 结果
经H2O2处理组及修复各实验组细胞拖尾尾长结果(表1，图1)。
, http://www.100md.com
表1 剂量及处理时间与实验细胞拖尾长度(
±s) H2O2剂量(μmol/L)
处理2 h尾长
(μm)
处理1h尾长
(μm)
0
80
160
320
11.3 ±4.1
, http://www.100md.com
28.26±11.3*
41.8 ±14.4*
54.2 ±17.1
11.4 ±8.33
12.8 ±4.8*
13.75±6.78*
20.77±6.41*
*表示与H2O2阴性对照组相比P<0.01
由表可见随着氧化损伤加重，细胞拖尾延长。二者呈现高度相关(r=0.97,P<0.05)。如图2所示，320 μmol/L H2O2处理组和160 μmol/L H2O2处理组造成淋巴细胞明显拖尾，80 μmol/L H2O2处理组淋巴细胞轻度拖尾；从恢复实验中可以看到320 μmol/L H2O2处理组仍有明显的拖尾现象，而80 μmol/L H2O2处理组修复1 h后尾长已接近正常细胞。
, 百拇医药
图1 H2O2对淋巴细胞的DNA损伤和修复
图2 SCGE法观察实例(×400)
图3 SCGE法观察实例
3 讨论
疾病发生的病理生理机制,最终要靠对人体、人群的直接观察才可解决。近代研究，包括地方病病因学研究，都提出了利用非损伤性的简易方法研究人群DNA损伤与危害因素的相关剂量效应[1，2]。本实验室已经做过连续数年的探索，并且注意到可修复性改变，在实验室、现场研究中技术和理论的价值[3]。国外有文献报道，可修复缺如、或者较差DNA损伤与肿瘤形成的关联更加密切[4]。作者认为在实验室或现场的研究中引进判别、解释可修复现象的技术和理论，将十分有利于SCGE方法的改进与应用。本实验提供的数据说明，搁置1h既有明显的修复，可以设想，间隔时间越长，修复的程度也会越高。而且可修复与不可修复显然对于鉴别危险暴露因素的性质有重要参考价值。
, 百拇医药
氧化损伤的DNA断裂后迅速修复现象，可能是断裂后DNA的粘性末端重新连接成的[5]。该现象说明，在SCGE法观察DNA损伤时，必须注意采样的时间间隔，避开修复现象的混杂作用。
[基金来源]哈尔滨医科大学211课题基金(1998-08)
[作者简介]程绍辉(1972-)，男，博士研究生。
参考文献
[1] 孙殿军，杨建伯，张勇红.T-2毒素对雏鸡软骨、肝脏蛋白质、DNA合成的抑制[J].中国地方病学杂志，1995，15(1)：10-12.
[2] Migliore L,Nieri M,Amodio S.The human lymphocytes micronucleus assay:a comparison between whole-blood and separated-lymphocyte cultures[J].Mt.Res,1989,(227):167-172.
, 百拇医药
[3] 任志红.T-2毒素致DNA损伤的SCGE法观察[D].哈尔滨医科大学博士论文.哈尔滨医科大学，1999.
[4] Froelich JJ,Schneller FR,Zahn RK.The influence of radiation and chemotherapy-related DNA strand breaks on carcinogenesis:an evaluation[J].Clin Chem Lab Med,1999,(37):403-408.
[5] Andrew R Collins,Victoria L Dobson,Maria Dusinska.The comet assay:what can it really tell us[J].Mutation research,1997,(375):183-193.
[收稿日期]1999-12-24;[修订日期]2000-01-12, 百拇医药