我国人群中人类免疫缺陷病毒1感染的协同受体CCR5Δ32基因突变的初步检测
作者：王福生 蒋建东 雷周云 金磊 徐东平 汪悦 施红 张冰 李跃旗
单位：王福生 雷周云 金磊 徐东平 施红 张冰 李跃旗(100039 北京，中国人民解放军第三○二医院传染病研究所)；蒋建东(美国纽约大学西奈山医学院肿瘤系)；汪悦(美国纽约大学西奈山医学院肿瘤系)
关键词：
中华医学杂志000417 目前，中国人群对人类免疫缺陷病毒(HIV)的遗传易感性已引起我国学者的高度关注。我们取中国人外周血单个核细胞来源的基因组DNA，应用PCR扩增和DNA序列分析等技术，分析CCR5Δ32基因纯合子和杂合子在中国人群中的分布，初步评估我国人群HIV-1感染的遗传易感性。此外，希望从分子遗传学角度为我国卫生主管部门对艾滋病防治的决策提供科学依据。
一、材料与方法
, 百拇医药
1.标本来源：我们收集了915例土生土长的中国人外周静脉血标本，他们均为中国人民解放军第三○二医院的住院病人(主要是患各种急慢性肝炎、菌痢、高血压和肿瘤等病人)或门诊健康体检人群，年龄范围为15～80岁，其中男719例、女196例。
2.外周血单个核细胞基因组DNA的提取：分别用常规法或QIAamp Blood Kit试剂盒法。常规方法提取的DNA样品216份，主要步骤同文献[1]。经QIAamp Blood Kit法(QIAGEN公司)提取的699份DNA样品按试剂盒说明书进行。
3.多聚酶链反应(PCR)：PCR引物为Primer-1：5′-CTCGGATCCACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCT-3′(32 mer)和Primer-2：5′-CTCGTCGACATGATGTGTAAGATAAGCCTCAC-3′(32 mer)。引物和探针均为美国Genset corp公司合成。PCR反应体系按美国Promega公司说明书进行。PCR反应条件：94℃ 3 min、94℃，30 s 62℃，30 s 72℃，1 min，共30个循环；经72℃ 10 min后，在4℃存放PCR产物。PCR产物经电泳分析，然后应用毛细管转移法将DNA从琼脂糖凝胶转移至尼龙膜(美国Amersham公司)[1]。
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4.Southern杂交：应用针对CCR5Δ32基因中缺失的32个碱基的特异性寡核苷酸探针和严格的杂交条件，可有效地排除假阳性。用[γ-32P]ATP标记CCR5Δ32探针(32 nt)：5′-GTCAGTATCAATTCTGGAAGAATTCCCAGACA。标记反应的原理是：在37℃温育，T4多核苷酸激酶催化[γ-32P]-磷酸基团加到寡核苷酸探针的5′端。用美国5′-3′公司的G-25柱纯化[γ-32P]标记的探针。置于-20℃备用，具体步骤同文献[2]。
5.DNA序列测定：将PCR扩增的CCR5Δ32基因产物242 bp和210 bp两条带分别从琼脂糖凝胶切下，用Clontech purification kit(Clontech公司)进行纯化，再取少量纯化后的PCR产物用紫外分光光度计定量。PCR产物浓度稀释至10～30 ng/μl，取3 μl用于DNA测序。在ABI Prism 310 DNA自动测序仪(Pekin-Elmer公司)上样。
, http://www.100md.com
二、结果
通过设计特定的引物，用PCR方法对915份中国人来源的基因组DNA中CCR5Δ32突变进行检测。我们设计的引物位于CCR5基因的3 260～3 484 nt，由于发生缺失突变的32个碱基位于3 315～3 346 nt之间，所以PCR扩增的CCR5wt/wt基因产物为242 bp，CCR5Δ32纯合子突变片段为210 bp，杂合子为242和210 bp两条片段。在本实验中，用常规法和QIAamp Blood Kit方法提取的DNA标本均能成功地用于PCR扩增。
值得注意的是在915例个体中，913例PCR产物均显示242 bp片段，仅2例同时见到242 bp和210 bp片段；未发现有纯合子CCR5Δ32/Δ32基因型的210 bp片段。我们还利用特异的探针进行Southern杂交，证实了PCR检测的准确性(图1)。此外，进一步对其中103份PCR产物进行DNA序列分析，发现所有野生型(wt)和突变型(Δ32)的基因序列与文献报道一致。由此确认在所检测的915例中，仅2例发生32个碱基缺失突变(杂合子CCR5wt/Δ32)，其余913例均为野生型(纯合子CCR5wt/wt)。本研究报告中国人群CCR5Δ32基因平均突变率约为0.2%。
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上图为PCR扩增产物经2.0%琼脂糖电泳的结果：M.100 bp DNA marker；1～17：分别代表被检测的17例样本的PCR产物，第8号和第14号含有242 bp和210 bp 2条带；其他样品均为242 bp 1条带；18.阴性对照；19.阳性(野生型纯合子)对照。下图为前述的PCR产物经转膜后，进行Southern杂交，仅见第1～17和19号242 bp部位出现阳性信号，而第6、13号的210 bp部位未见杂交信号
图1 PCR扩增和Southern杂交检测CCR5Δ32基因突变
三、讨论
迄今已证实，CCR5是NSI病毒株感染靶细胞所必须的协同受体，所以，CCR5Δ32基因突变可影响NSI HIV-1感染和艾滋病进行性发展的过程[1]。有关CCR5Δ32突变的机理尚不清楚。有人认为在人类进化过程中CCR5-Δ32缺失突变可能是近来发生的事，并且在白人中发生率较高。本组受测试者中仅2例发生CCR5Δ32/wt杂合子突变，他们均为本土中国人，其祖辈没有和外国人通婚的历史，提示突变的CCR5Δ32/wt基因乃随机发生，并非从外国流入。然而在调查的915例中有913例个体表现为野生型CCR5基因，说明中国人群中CCR5Δ32的突变率很低，提示我国绝大多数人群对NSI HIV-1株感染有着较高的易感性。为证实这一结论的可靠性有必要进一步扩大检测样本数，以便更准确地了解中国人群中CCR5Δ32缺失突变分布，从而为我国艾滋病的防治及政府卫生部门制定相关的政策提供准确的依据。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770683)
参考文献
1，Sambrok J. Fritsch EF, Maniatis T. Analysis and cloning of eukaryotic genomic DNA. Molecular Cloning-a laboratory manual.2nd. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.916-919.
2，Guignard F, Combadiere C, Tiffany HL, et al. Gene organization and promoter function for CC chemokine receptor 5 (CCR5). J Immuol, 1998,160：985-992.
(收稿日期：1999-02-08), http://www.100md.com
单位：王福生 雷周云 金磊 徐东平 施红 张冰 李跃旗(100039 北京，中国人民解放军第三○二医院传染病研究所)；蒋建东(美国纽约大学西奈山医学院肿瘤系)；汪悦(美国纽约大学西奈山医学院肿瘤系)
关键词：
中华医学杂志000417 目前，中国人群对人类免疫缺陷病毒(HIV)的遗传易感性已引起我国学者的高度关注。我们取中国人外周血单个核细胞来源的基因组DNA，应用PCR扩增和DNA序列分析等技术，分析CCR5Δ32基因纯合子和杂合子在中国人群中的分布，初步评估我国人群HIV-1感染的遗传易感性。此外，希望从分子遗传学角度为我国卫生主管部门对艾滋病防治的决策提供科学依据。
一、材料与方法
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1.标本来源：我们收集了915例土生土长的中国人外周静脉血标本，他们均为中国人民解放军第三○二医院的住院病人(主要是患各种急慢性肝炎、菌痢、高血压和肿瘤等病人)或门诊健康体检人群，年龄范围为15～80岁，其中男719例、女196例。
2.外周血单个核细胞基因组DNA的提取：分别用常规法或QIAamp Blood Kit试剂盒法。常规方法提取的DNA样品216份，主要步骤同文献[1]。经QIAamp Blood Kit法(QIAGEN公司)提取的699份DNA样品按试剂盒说明书进行。
3.多聚酶链反应(PCR)：PCR引物为Primer-1：5′-CTCGGATCCACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCT-3′(32 mer)和Primer-2：5′-CTCGTCGACATGATGTGTAAGATAAGCCTCAC-3′(32 mer)。引物和探针均为美国Genset corp公司合成。PCR反应体系按美国Promega公司说明书进行。PCR反应条件：94℃ 3 min、94℃，30 s 62℃，30 s 72℃，1 min，共30个循环；经72℃ 10 min后，在4℃存放PCR产物。PCR产物经电泳分析，然后应用毛细管转移法将DNA从琼脂糖凝胶转移至尼龙膜(美国Amersham公司)[1]。
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4.Southern杂交：应用针对CCR5Δ32基因中缺失的32个碱基的特异性寡核苷酸探针和严格的杂交条件，可有效地排除假阳性。用[γ-32P]ATP标记CCR5Δ32探针(32 nt)：5′-GTCAGTATCAATTCTGGAAGAATTCCCAGACA。标记反应的原理是：在37℃温育，T4多核苷酸激酶催化[γ-32P]-磷酸基团加到寡核苷酸探针的5′端。用美国5′-3′公司的G-25柱纯化[γ-32P]标记的探针。置于-20℃备用，具体步骤同文献[2]。
5.DNA序列测定：将PCR扩增的CCR5Δ32基因产物242 bp和210 bp两条带分别从琼脂糖凝胶切下，用Clontech purification kit(Clontech公司)进行纯化，再取少量纯化后的PCR产物用紫外分光光度计定量。PCR产物浓度稀释至10～30 ng/μl，取3 μl用于DNA测序。在ABI Prism 310 DNA自动测序仪(Pekin-Elmer公司)上样。
, http://www.100md.com
二、结果
通过设计特定的引物，用PCR方法对915份中国人来源的基因组DNA中CCR5Δ32突变进行检测。我们设计的引物位于CCR5基因的3 260～3 484 nt，由于发生缺失突变的32个碱基位于3 315～3 346 nt之间，所以PCR扩增的CCR5wt/wt基因产物为242 bp，CCR5Δ32纯合子突变片段为210 bp，杂合子为242和210 bp两条片段。在本实验中，用常规法和QIAamp Blood Kit方法提取的DNA标本均能成功地用于PCR扩增。
值得注意的是在915例个体中，913例PCR产物均显示242 bp片段，仅2例同时见到242 bp和210 bp片段；未发现有纯合子CCR5Δ32/Δ32基因型的210 bp片段。我们还利用特异的探针进行Southern杂交，证实了PCR检测的准确性(图1)。此外，进一步对其中103份PCR产物进行DNA序列分析，发现所有野生型(wt)和突变型(Δ32)的基因序列与文献报道一致。由此确认在所检测的915例中，仅2例发生32个碱基缺失突变(杂合子CCR5wt/Δ32)，其余913例均为野生型(纯合子CCR5wt/wt)。本研究报告中国人群CCR5Δ32基因平均突变率约为0.2%。
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上图为PCR扩增产物经2.0%琼脂糖电泳的结果：M.100 bp DNA marker；1～17：分别代表被检测的17例样本的PCR产物，第8号和第14号含有242 bp和210 bp 2条带；其他样品均为242 bp 1条带；18.阴性对照；19.阳性(野生型纯合子)对照。下图为前述的PCR产物经转膜后，进行Southern杂交，仅见第1～17和19号242 bp部位出现阳性信号，而第6、13号的210 bp部位未见杂交信号
图1 PCR扩增和Southern杂交检测CCR5Δ32基因突变
三、讨论
迄今已证实，CCR5是NSI病毒株感染靶细胞所必须的协同受体，所以，CCR5Δ32基因突变可影响NSI HIV-1感染和艾滋病进行性发展的过程[1]。有关CCR5Δ32突变的机理尚不清楚。有人认为在人类进化过程中CCR5-Δ32缺失突变可能是近来发生的事，并且在白人中发生率较高。本组受测试者中仅2例发生CCR5Δ32/wt杂合子突变，他们均为本土中国人，其祖辈没有和外国人通婚的历史，提示突变的CCR5Δ32/wt基因乃随机发生，并非从外国流入。然而在调查的915例中有913例个体表现为野生型CCR5基因，说明中国人群中CCR5Δ32的突变率很低，提示我国绝大多数人群对NSI HIV-1株感染有着较高的易感性。为证实这一结论的可靠性有必要进一步扩大检测样本数，以便更准确地了解中国人群中CCR5Δ32缺失突变分布，从而为我国艾滋病的防治及政府卫生部门制定相关的政策提供准确的依据。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770683)
参考文献
1，Sambrok J. Fritsch EF, Maniatis T. Analysis and cloning of eukaryotic genomic DNA. Molecular Cloning-a laboratory manual.2nd. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.916-919.
2，Guignard F, Combadiere C, Tiffany HL, et al. Gene organization and promoter function for CC chemokine receptor 5 (CCR5). J Immuol, 1998,160：985-992.
(收稿日期：1999-02-08), http://www.100md.com