胃癌相关抗原MG7-Ag模拟肽表位的筛选及测序分析
作者：徐立 乔泰东 陈宝军 欧阳为明 丁杰 张庆华 周隽 吴昕彦 金伯泉 樊代明
单位：徐立 乔泰东 陈宝军 丁杰 樊代明(710032 西安市，第四军医大学西京医院消化病研究所)；欧阳为明(第四军医大学免疫教研室)；金伯泉(第四军医大学免疫教研室)；张庆华(上海第二医科大学瑞金医院血液病研究所)；周隽(上海第二医科大学瑞金医院血液病研究所)；吴昕彦(上海第二医科大学瑞金医院血液病研究所)
关键词：噬菌体；抗体；单克隆；肽类；胃肿瘤
中华医学杂志000424 【摘要】 目的 从噬菌体呈现的随机肽库中筛选胃癌单克隆抗体MG7所识别的胃癌相关抗原的短肽模拟表位，为进一步研究胃癌相关抗原与单抗结合的结构基序奠定基础。方法 用胃癌单克隆抗体MG7对呈现于噬菌体衣壳蛋白pⅧ上的2个九肽库分别进行亲和富集和免疫筛选；阳性克隆进一步用荧光标记和硝酸纤维素膜斑点印迹法证实其结合活性；经随机抽取部分阳性克隆进行DNA序列分析，推导出相应噬菌体呈现肽的氨基酸序列，通过序列比较分析相对保守的表位信息；运用HLA分子结合分析软件预测已测序短肽与HLA分子结合的可能性。 结果 经反复多轮筛选和结合活性检测，从pⅧ和pⅧ-cys 2个噬菌体肽库中分别得到了12和30个阳性克隆；通过对部分阳性克隆进行测序分析，推导相应的随机肽序列和序列比较分析，得到具有相对保守性的表位信息如PLX0-2S、SAVR、XRMX、YARN等。经计算机预测分析，发现它们可与HLA多个分子结合。结论 PLX0-2S、SAVR、XRMX、YARN等有可能为胃癌单克隆抗体MG7所识别的表位基序。
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Mimic epitope recognized by monoclonal antibody MG7 against gastric cancer through screening phage displayed random peptide library
XU Li
(Institute of Digestive Diseases, Xijing Hospital, The 4th Military Medical University, Xi′an 710032, China)
QIAO Taidong
(Institute of Digestive Diseases, Xijing Hospital, The 4th Military Medical University, Xi′an 710032, China)
, 百拇医药
CHEN Baojun
(Institute of Digestive Diseases, Xijing Hospital, The 4th Military Medical University, Xi′an 710032, China)
【Abstract】 Objective To get mimic peptide epitopes that could be recognized by a monoclonal antibody against gastric cancer named MG7 from random peptide library displayed by phage, and to provide useful information for further study of the interaction between antigen and antibody. Methods Through affinity enrichment and immunoscreening of two phage-displayed non-apeptide libraries constructed in pⅧ with MG7 MAb separately, several positive phages were obtained. Fluorescence labeling and dot blot were carried out for further identification of their binding activities. Then, some of the positive phages were sequenced and their corresponding peptide sequence was deduced according to their DNA sequence. Finally, HLA binding prediction software was applied for HLA binding analysis. Results Based on several rounds of screening and binding activity detection, we got twelve and thirty positive phage clones respectively from two libraries. Through DNA sequencing, peptide deducing and sequence aligning analysis of the positive phages, some preserved epitope information such as PLX0-2S, SAVR, XRMX and YARN were obtained. The prediction using HLA binding analysis software showed that most of the sequenced peptide had the potentiality to bind with HLA molecules. Conclusion PLX0-2S, SAVR, XRMX and YARN may be some of the motifs which could be recognized by monoclonal antibody MG7.
, 百拇医药
【Key words】 Bacteriophages； Antibodies, monoclonal； Peptide； Stomach neoplasms
噬菌体呈现技术是一种将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并呈现于噬菌体表面的技术。目前，该技术已广泛用于抗体的工程化、抗原表位的筛选、激素或酶的底物序列的确定、受体激动剂或拮抗剂的制备等。本研究运用这一技术通过我所已建立的胃癌单克隆抗体MG7对呈现于噬菌体衣壳蛋白pⅧ上的2个九肽库进行了亲和筛选，经DNA测序分析相应的阳性克隆，得到具有保守性的表位信息，为进一步研究胃癌相关抗原与单抗结合的结构基序奠定了基础。
材料和方法
一、肽库、菌株及主要实验材料
呈现九肽的噬菌体随机肽库由意大利Franco Felici教授提供。其中pⅧ肽库是将九肽相应的碱基直接插入，pⅧ-cys肽库是在九肽相应的碱基的两侧分别加入一个半胱氨酸相应的碱基再插入到载体中。大肠杆菌菌株XL1-Blue为本实验室冻存。辅助病毒M13KO7由我校免疫教研室提供。胃癌特异性单抗MG7由本室制备[1]。
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二、试剂配制
TBS/TBST洗涤液：0.15 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，pH 7.5为TBS，加质量浓度为0.05的Tween 20为TBST。封闭液：0.1 mol/L NaHCO3，5 g/L BSA。洗脱缓冲液：0.1 mol/L 甘氨酸，以HCl调至pH 2.2，加入BSA至0.1%。洗脱中和液：1 mol/L Tris-HCl(pH 9.0)。TB-AT液：Teriffic Broth培养液+100 μg/ml Amp+100 μg/ml Tet。
三、方法
1.胃癌单抗MG7的纯化：常规DEAE52离子交换柱层析法纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度。
2.肽库的亲和富集：参照文献[2]进行。取约1 μg纯化的MG7单抗加入到含100 μl 0.1 mol/L NaHCO3(pH 8.6)包被缓冲液的酶标ELISA板小孔中， 4℃过夜。TBST/TBS各洗3次后，孔中加入400 μl封闭液，37℃ 6 h，TBS洗涤3次，加入含1010个噬菌体颗粒的TBS-0.1% BSA液100 μl，室温 2 h。TBST/TBS各振洗10次。孔中加入100 μl洗脱缓冲液，作用60 min，用10 μl洗脱中和液中和。
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3.噬菌体转导单位测定、扩增：参照文献[3]进行。将洗脱的噬菌体加到2.5 ml XL1-Blue细菌培养物中，室温感染15 min，37℃振荡培养30 min，铺于LB+Amp(100 μg/ml)+Tet(100 μg/ml)板，37℃过夜。第2天计数形成的克隆数，用TB-AT液收集LB板上的克隆，-20℃冻存。
4.克隆的免疫筛选：参照文献[4]进行。取100 μl扩增的菌液加入5 ml TB-AT液，37℃振荡培养2 h。取1 ml培养液加入1011个辅助噬菌体M13KO7，37℃振荡培养1 h。10 000 r/min 离心5 min，用15 ml噬菌体缓冲液洗涤细菌沉淀3次。TB-AT重悬沉淀，铺于LB琼脂板，37℃过夜。将细菌转印至硝酸纤维素膜上，经质量浓度为0.05的BSA封闭，与MG7单抗结合，室温2 h，反复洗涤后加入HRP酶标抗鼠二抗，DAB显色。阳性克隆再经第二轮或第三轮筛选得到单一克隆。
5.细菌的荧光标记：将新鲜培养的阳性克隆细菌滴于挂有明胶的载玻片上，经质量浓度为0.037的多聚甲醛固定，质量浓度为0.03的BSA封闭，与MG7单抗室温作用2 h，洗涤后与生物素化的抗鼠二抗室温作用1 h，用亲和素标记的得克萨斯红显色，荧光镜下观察标记的细菌。
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6.噬菌体的免疫斑点检测：从阳性克隆中扩增相应的噬菌体颗粒，两次聚乙二醇(PEG) 沉淀进行纯化。取纯化的噬菌体点于硝酸纤维素膜上，常规免疫学检测。以空载体作为阴性对照。
7.ELISA竞争抑制实验：约1010纯化的噬菌体颗粒分别预先与纯化的单抗10 μg孵育，4℃过夜。ELISA酶标板中加入表达MG7抗原的KATO Ⅲ胃癌细胞(1×105/孔)，丙酮-甲醛固定液固定30 min，用含质量浓度为0.02的BSA的10 mmol/L PBS(pH 7.4) 封闭，37℃ 2 h，每孔分别加入噬菌体与抗体混合液100 μl，37℃孵育30 min，用PBST (质量浓度为0.05的Tween-20, 10 mmol/L PBS, pH 7.2～7.4)洗板5次，依次加入生物素抗鼠二抗、亲和素与HRP标记的生物素复合物，常规孵育和洗涤。最后以TMB显色，2 mol/L H2SO4终止反应。在酶标仪上以波长450 nm测量A值。同时做阳性和阴性对照。阳性对照孔直接加入抗体，阴性对照孔加入纯化的非重组噬菌体与抗体的混合物。
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8.DNA序列测定：采用M13 DNA纯化试剂盒提取单链噬菌体，引物由上海生工生物工程公司合成，为M13-40位序列：5′-GTCGTGGACTGGGAAAAC-3′。采用美国PE公司ABI PRISM BigDye Terminator 测序试剂盒和ABI PRISM 377全自动测序仪测序。
9.与HLA分子结合的预测：采用第四军医大学校园网的HLA预测软件系统进行。
结果
一、肽库的亲和富集及免疫筛选
经MG7单抗亲和富集，分别从pⅧ、pⅧ-cys肽库中得到2 435和2 759个克隆。用亲和富集的噬菌体感染细菌，随后铺于LB板上，经硝酸纤维素膜吸附进行常规免疫筛选，从中挑取可与单抗MG7结合的克隆，再经第2轮或第3轮筛选得到单一克隆。经多轮筛选和克隆化，最终从pⅧ和pⅧ-cys肽库中分别得到了12和30个克隆。
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二、细菌的荧光标记
用免疫筛选得到的噬菌体感染细菌，通过生物素和亲和素的桥接作用在荧光镜下观察了抗体与细菌表面的结合情况，结果见图1。以未插入肽段的噬菌体感染的细菌作为对照，镜下未见被标记的细菌。
图1 MG7表位组细菌的荧光标记，荧光镜下
可见携带有阳性噬菌体的细菌标记
三、噬菌体的免疫斑点检测
为进一步排除可能与细菌间存在的非特异性反应，对阳性克隆的噬菌体进行了2次PEG纯化。将纯化的噬菌体(约1010个颗粒)点于硝酸纤维素膜上，与MG7单抗孵育后，采用常规斑点印记法进行了进一步验证(图2，3)。以空载体作为对照，未见阳性反应。
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第1点为阳性对照，第2点为阴性对照，3～14点为纯化的不同噬菌体
图2 MG7-pⅧ组斑点印迹
第1点为阳性对照，第2点为阴性对照，3～32点为纯化的不同噬菌体
图3 MG7-pⅧ cys组斑点印迹
四、ELISA竞争抑制实验
以表达MG7抗原的细胞包被ELISA酶标板，纯化的噬菌体与单抗结合后加入板中孵育，测A450 nm值，检测抑制效率，结果见表1。在所检测的MG7表位组42个克隆中，抑制率达80%以上的有3个，75%～80%间有22个，70%～75%间有11个，70%～60%的有5个，60%以下的有1个。
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表1 竞争ELISA试验结果 噬菌体
A450 nm
抑制率(%)
噬菌体
A450 nm
抑制率(%)
MG7
1.397
Positive
0.119
91.5
G1
, 百拇医药
0.483
65.4
Negative
1.219
12.7
G2
0.423
69.7
G3
0.330
76.3
G4
0.384
, 百拇医药
72.5
G5
0.479
65.7
G6
0.294
79.0
G7
0.378
72.9
G8
0.316
77.4
, 百拇医药
G9
0.327
76.6
G10
0.582
58.3
G11
0.387
72.3
G12
0.462
66.9
GC1
, 百拇医药
0.366
73.8
GC2
0.329
76.4
GC3
0.303
78.3
GC4
0.384
72.5
GC5
0.288
, 百拇医药
79.4
GC6
0.307
78.0
GC7
0.416
70.2
GC8
0.284
79.7
GC9
0.386
72.4
, 百拇医药
GC10
0.386
72.4
GC11
0.271
80.6
GC12
0.312
77.7
GC13
0.283
79.7
GC14
, 百拇医药
0.300
78.5
GC15
0.510
63.5
GC16
0.298
78.7
GC17
0.288
79.4
GC18
0.393
, 百拇医药
71.9
GC19
0.352
74.8
GC20
0.381
72.7
GC21
0.327
76.6
GC22
0.316
77.4
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GC23
0.316
77.4
GC24
0.281
80.0
GC25
0.302
78.4
GC26
0.288
79.4
GC27
, 百拇医药
0.305
78.2
GC28
0.268
80.8
GC29
0.308
78.0
GC30
0.293
79.0
五、DNA测序分析
在上述经过多次反复筛选的基础上，随机抽取一部分克隆进行了测序分析，测序结果见表2。在所测序的克隆中，GC5、GC24与GC27，GC11与GC13，G4与G10分别含有相同的插入肽段。分析结果，我们发现含PLX0-2S基序(其中，X为非特异性氨基酸残基；0-2为氨基酸数目)占测序克隆的44%，SAVR、XRMX、YARN亦有可能辰岷虾蠹尤氚逯蟹跤釧450 nm值，检测抑制效率，结果见表1。在所检测的MG7表位组42个克隆中，抑制率达80%以上的有3个，75%～80%间有22个，70%～75%间有11个，70%～60%的有5个，60%以下的有1个。表1 竞争ELISA试验结果 噬菌体
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呈现肽的蛋白序列
GC5/GC24/GC27
EFC-PLSWPFPVF-CGDP*
GC11/GC13
EFC-RFAPLSAVR-CGDP
GC25
EFC-SRPPLHLSF-CGDP
GC12
EFC-PLGSHNHLP-EFC-CGDP
GC23
EFC-SLDLHPLRS-CGDP
, 百拇医药
GC1
EFC-HGPRMISFW-CGDP
GC17
EFC-HGPRMISIR-CGDP
GC26
EFC-RMCKGCYTS-CGDP
GC8
EFC-NAIYARNAQ-CGDP
GC9
EFC-TCHLRVYAQ-CGDP
GC28
, 百拇医药
EFC-SWAPVYARN-CGDP
GC20
EFC-GSAVRRPSR-CGDP
G4/G10
EF-YKPSETIRM-DPA
G15
EF-RRPRLLDTA-DPA
表3 MG7表位组与HLA分子结合的预测
A3
A11
B8
, 百拇医药 B27
DR1
DR3
DR7
DR8
GC1
*
GC5/GC24/GC27
*
GC8
*
*
GC9
, 百拇医药 *
*
GC11/GC13
*
*
*
*
*
GC12
*
*
*
GC17
*
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*
*
GC19
*
GC20
*
*
*
GC23
*
*
*
*
GC25
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*
GC28
*
*
G4/G10
*
*
*
G15
*
*
*意指噬菌体呈现的肽序列可与某个HLA分子结合，如GC1可以与HLA-B28分子结合讨论
, 百拇医药
已有文献报道，用抗体筛选噬菌体随机肽库是获得抗原表位的有效方法[5，6]。鉴于对抗原性的研究已在从天然抗原整个分子水平向表位水平过渡，我们尝试用胃癌单抗为筛选配基，从九肽随机肽库中筛选抗体识别的表位，以期寻找具有免疫原性的短肽序列。
测序结果显示，从pⅧ-cys肽库中得到的克隆相对于从pⅧ肽库中得到的克隆其呈现的肽序列要相对保守，这与我们的期望相符。已有的晶体结构衍射结果显示[7]，包含一对半胱氨酸的肽段(CXXXXXXXXXC)可形成链内二硫键，使所产生的环行肽结构相对有序和稳定，在空间结构上柔性减少，刚性增强，一般具有较高的亲和力和结合特异性。
ELISA竞争抑制实验提示，噬菌体模拟表位对天然抗原与抗体间结合的抑制率在60%～80%，这可能与两者间的亲和力及相互作用时所形成的空间构象有关；而我们还发现用天然抗原可完全抑制噬菌体表位与抗体的结合，提示噬菌体模拟表位与抗体的结合位点位于天然抗原与抗体结合位点之中。
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对一个线性蛋白质抗原而言，结构相似群往往可以是抗原分子中的一段氨基酸序列，即抗原表位(epitope)。对一个非线性抗原或非蛋白质抗原而言，肽性模拟表位可能不是抗原本身的序列，而是空间构象中相互接近而一级结构中互不连续的几个氨基酸。在这种情况下，模拟表位的氨基酸顺序可能与大分子抗原上的表位截然不同，却可能诱发特异性相似的免疫反应。由于胃癌MG7单抗所识别的胃癌相关抗原的编码基因尚未克隆成功，我们尚无法确定筛选出的阳性克隆所呈现的肽段与真正相关抗原的关系。但从我们已测序的克隆中，不难发现 PLX0-2S基序占了相对的优势。另外SAVR、XRMX、YARN亦有可能成为候选的表位基序。目前正在用阳性噬菌体呈现的肽段进行免疫原性分析，以期确定具有免疫原性的一种或多种最佳抗原模拟表位，为研究胃癌相关抗原与单抗结合的结构基序奠定基础。
此外，我们还希望就抗体的表位是否有可能成为或包含T细胞表位这一至今尚有争论的问题做一些有益的探讨。为此，我们运用计算机软件预测了抗体的模拟肽表位与HLA分子结合的可能性，发现大多数分子具有与HLA多个分子结合的可能性。这些分子是否可诱发CTL的杀伤活性，我们正在研究。
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志谢 上海第二医科大学瑞金医院血液病研究所陈竺院士、陈赛娟研究员在测序方面给予指导和帮助
基金项目：国家863课题(102-10-01-06)及国家杰出青年基金课题(39525020)共同资助项目
参考文献
1，樊代明,张学庸,陈希陶，等. 抗低分化胃癌细胞系MKN-46-9单克隆抗体的制备及免疫组化鉴定. 解放军医学杂志,1988，13:12-14.
2，Parmley SF, Smith GP. Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes. Gene, 1988, 73:305-318.
3，Luzzago A, Felici F, Tramontano A, et al. Mimicking of discontinuous epitopes by phage-displayed peptides, I. Epitope mapping of human H ferritin using a phage library of constrained peptides. Gene, 1993, 128: 51-57.
, 百拇医药
4，Felici F, Luzzago A, Folgori A, et al. Mimicking of discontinuous epitopes by phage-displayed peptides, II. Selection of clones recognized by a protective monoclonal antibody against the Bordetella pertussis toxin from phage peptide libraries. Gene, 1993, 128: 21-27.
5，Cortese R, Felici F, Galfre G. Epitope discovery using peptide libraries displayed on phage. Trends Biotechnol, 1994, 12: 262-267.
6，Gevorkian G, Manoutcharian K, Almagro JC, et al. Identification of autoimmune thrombocytopenic purpura-related epitopes using phage-display peptide library. Clin Immunol Immunopathol, 1998, 86: 305-309.
7，Luzzago A, Felici F. Construction of disulfide-constrained random peptide libraries displayed on phage coat protein VIII. Methods in Molecular Biol, 1997, 87:155-164.
(收稿日期：1999-02-08), 百拇医药
单位：徐立 乔泰东 陈宝军 丁杰 樊代明(710032 西安市，第四军医大学西京医院消化病研究所)；欧阳为明(第四军医大学免疫教研室)；金伯泉(第四军医大学免疫教研室)；张庆华(上海第二医科大学瑞金医院血液病研究所)；周隽(上海第二医科大学瑞金医院血液病研究所)；吴昕彦(上海第二医科大学瑞金医院血液病研究所)
关键词：噬菌体；抗体；单克隆；肽类；胃肿瘤
中华医学杂志000424 【摘要】 目的 从噬菌体呈现的随机肽库中筛选胃癌单克隆抗体MG7所识别的胃癌相关抗原的短肽模拟表位，为进一步研究胃癌相关抗原与单抗结合的结构基序奠定基础。方法 用胃癌单克隆抗体MG7对呈现于噬菌体衣壳蛋白pⅧ上的2个九肽库分别进行亲和富集和免疫筛选；阳性克隆进一步用荧光标记和硝酸纤维素膜斑点印迹法证实其结合活性；经随机抽取部分阳性克隆进行DNA序列分析，推导出相应噬菌体呈现肽的氨基酸序列，通过序列比较分析相对保守的表位信息；运用HLA分子结合分析软件预测已测序短肽与HLA分子结合的可能性。 结果 经反复多轮筛选和结合活性检测，从pⅧ和pⅧ-cys 2个噬菌体肽库中分别得到了12和30个阳性克隆；通过对部分阳性克隆进行测序分析，推导相应的随机肽序列和序列比较分析，得到具有相对保守性的表位信息如PLX0-2S、SAVR、XRMX、YARN等。经计算机预测分析，发现它们可与HLA多个分子结合。结论 PLX0-2S、SAVR、XRMX、YARN等有可能为胃癌单克隆抗体MG7所识别的表位基序。
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Mimic epitope recognized by monoclonal antibody MG7 against gastric cancer through screening phage displayed random peptide library
XU Li
(Institute of Digestive Diseases, Xijing Hospital, The 4th Military Medical University, Xi′an 710032, China)
QIAO Taidong
(Institute of Digestive Diseases, Xijing Hospital, The 4th Military Medical University, Xi′an 710032, China)
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CHEN Baojun
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【Abstract】 Objective To get mimic peptide epitopes that could be recognized by a monoclonal antibody against gastric cancer named MG7 from random peptide library displayed by phage, and to provide useful information for further study of the interaction between antigen and antibody. Methods Through affinity enrichment and immunoscreening of two phage-displayed non-apeptide libraries constructed in pⅧ with MG7 MAb separately, several positive phages were obtained. Fluorescence labeling and dot blot were carried out for further identification of their binding activities. Then, some of the positive phages were sequenced and their corresponding peptide sequence was deduced according to their DNA sequence. Finally, HLA binding prediction software was applied for HLA binding analysis. Results Based on several rounds of screening and binding activity detection, we got twelve and thirty positive phage clones respectively from two libraries. Through DNA sequencing, peptide deducing and sequence aligning analysis of the positive phages, some preserved epitope information such as PLX0-2S, SAVR, XRMX and YARN were obtained. The prediction using HLA binding analysis software showed that most of the sequenced peptide had the potentiality to bind with HLA molecules. Conclusion PLX0-2S, SAVR, XRMX and YARN may be some of the motifs which could be recognized by monoclonal antibody MG7.
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【Key words】 Bacteriophages； Antibodies, monoclonal； Peptide； Stomach neoplasms
噬菌体呈现技术是一种将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并呈现于噬菌体表面的技术。目前，该技术已广泛用于抗体的工程化、抗原表位的筛选、激素或酶的底物序列的确定、受体激动剂或拮抗剂的制备等。本研究运用这一技术通过我所已建立的胃癌单克隆抗体MG7对呈现于噬菌体衣壳蛋白pⅧ上的2个九肽库进行了亲和筛选，经DNA测序分析相应的阳性克隆，得到具有保守性的表位信息，为进一步研究胃癌相关抗原与单抗结合的结构基序奠定了基础。
材料和方法
一、肽库、菌株及主要实验材料
呈现九肽的噬菌体随机肽库由意大利Franco Felici教授提供。其中pⅧ肽库是将九肽相应的碱基直接插入，pⅧ-cys肽库是在九肽相应的碱基的两侧分别加入一个半胱氨酸相应的碱基再插入到载体中。大肠杆菌菌株XL1-Blue为本实验室冻存。辅助病毒M13KO7由我校免疫教研室提供。胃癌特异性单抗MG7由本室制备[1]。
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二、试剂配制
TBS/TBST洗涤液：0.15 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，pH 7.5为TBS，加质量浓度为0.05的Tween 20为TBST。封闭液：0.1 mol/L NaHCO3，5 g/L BSA。洗脱缓冲液：0.1 mol/L 甘氨酸，以HCl调至pH 2.2，加入BSA至0.1%。洗脱中和液：1 mol/L Tris-HCl(pH 9.0)。TB-AT液：Teriffic Broth培养液+100 μg/ml Amp+100 μg/ml Tet。
三、方法
1.胃癌单抗MG7的纯化：常规DEAE52离子交换柱层析法纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度。
2.肽库的亲和富集：参照文献[2]进行。取约1 μg纯化的MG7单抗加入到含100 μl 0.1 mol/L NaHCO3(pH 8.6)包被缓冲液的酶标ELISA板小孔中， 4℃过夜。TBST/TBS各洗3次后，孔中加入400 μl封闭液，37℃ 6 h，TBS洗涤3次，加入含1010个噬菌体颗粒的TBS-0.1% BSA液100 μl，室温 2 h。TBST/TBS各振洗10次。孔中加入100 μl洗脱缓冲液，作用60 min，用10 μl洗脱中和液中和。
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3.噬菌体转导单位测定、扩增：参照文献[3]进行。将洗脱的噬菌体加到2.5 ml XL1-Blue细菌培养物中，室温感染15 min，37℃振荡培养30 min，铺于LB+Amp(100 μg/ml)+Tet(100 μg/ml)板，37℃过夜。第2天计数形成的克隆数，用TB-AT液收集LB板上的克隆，-20℃冻存。
4.克隆的免疫筛选：参照文献[4]进行。取100 μl扩增的菌液加入5 ml TB-AT液，37℃振荡培养2 h。取1 ml培养液加入1011个辅助噬菌体M13KO7，37℃振荡培养1 h。10 000 r/min 离心5 min，用15 ml噬菌体缓冲液洗涤细菌沉淀3次。TB-AT重悬沉淀，铺于LB琼脂板，37℃过夜。将细菌转印至硝酸纤维素膜上，经质量浓度为0.05的BSA封闭，与MG7单抗结合，室温2 h，反复洗涤后加入HRP酶标抗鼠二抗，DAB显色。阳性克隆再经第二轮或第三轮筛选得到单一克隆。
5.细菌的荧光标记：将新鲜培养的阳性克隆细菌滴于挂有明胶的载玻片上，经质量浓度为0.037的多聚甲醛固定，质量浓度为0.03的BSA封闭，与MG7单抗室温作用2 h，洗涤后与生物素化的抗鼠二抗室温作用1 h，用亲和素标记的得克萨斯红显色，荧光镜下观察标记的细菌。
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6.噬菌体的免疫斑点检测：从阳性克隆中扩增相应的噬菌体颗粒，两次聚乙二醇(PEG) 沉淀进行纯化。取纯化的噬菌体点于硝酸纤维素膜上，常规免疫学检测。以空载体作为阴性对照。
7.ELISA竞争抑制实验：约1010纯化的噬菌体颗粒分别预先与纯化的单抗10 μg孵育，4℃过夜。ELISA酶标板中加入表达MG7抗原的KATO Ⅲ胃癌细胞(1×105/孔)，丙酮-甲醛固定液固定30 min，用含质量浓度为0.02的BSA的10 mmol/L PBS(pH 7.4) 封闭，37℃ 2 h，每孔分别加入噬菌体与抗体混合液100 μl，37℃孵育30 min，用PBST (质量浓度为0.05的Tween-20, 10 mmol/L PBS, pH 7.2～7.4)洗板5次，依次加入生物素抗鼠二抗、亲和素与HRP标记的生物素复合物，常规孵育和洗涤。最后以TMB显色，2 mol/L H2SO4终止反应。在酶标仪上以波长450 nm测量A值。同时做阳性和阴性对照。阳性对照孔直接加入抗体，阴性对照孔加入纯化的非重组噬菌体与抗体的混合物。
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8.DNA序列测定：采用M13 DNA纯化试剂盒提取单链噬菌体，引物由上海生工生物工程公司合成，为M13-40位序列：5′-GTCGTGGACTGGGAAAAC-3′。采用美国PE公司ABI PRISM BigDye Terminator 测序试剂盒和ABI PRISM 377全自动测序仪测序。
9.与HLA分子结合的预测：采用第四军医大学校园网的HLA预测软件系统进行。
结果
一、肽库的亲和富集及免疫筛选
经MG7单抗亲和富集，分别从pⅧ、pⅧ-cys肽库中得到2 435和2 759个克隆。用亲和富集的噬菌体感染细菌，随后铺于LB板上，经硝酸纤维素膜吸附进行常规免疫筛选，从中挑取可与单抗MG7结合的克隆，再经第2轮或第3轮筛选得到单一克隆。经多轮筛选和克隆化，最终从pⅧ和pⅧ-cys肽库中分别得到了12和30个克隆。
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二、细菌的荧光标记
用免疫筛选得到的噬菌体感染细菌，通过生物素和亲和素的桥接作用在荧光镜下观察了抗体与细菌表面的结合情况，结果见图1。以未插入肽段的噬菌体感染的细菌作为对照，镜下未见被标记的细菌。
图1 MG7表位组细菌的荧光标记，荧光镜下
可见携带有阳性噬菌体的细菌标记
三、噬菌体的免疫斑点检测
为进一步排除可能与细菌间存在的非特异性反应，对阳性克隆的噬菌体进行了2次PEG纯化。将纯化的噬菌体(约1010个颗粒)点于硝酸纤维素膜上，与MG7单抗孵育后，采用常规斑点印记法进行了进一步验证(图2，3)。以空载体作为对照，未见阳性反应。
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第1点为阳性对照，第2点为阴性对照，3～14点为纯化的不同噬菌体
图2 MG7-pⅧ组斑点印迹
第1点为阳性对照，第2点为阴性对照，3～32点为纯化的不同噬菌体
图3 MG7-pⅧ cys组斑点印迹
四、ELISA竞争抑制实验
以表达MG7抗原的细胞包被ELISA酶标板，纯化的噬菌体与单抗结合后加入板中孵育，测A450 nm值，检测抑制效率，结果见表1。在所检测的MG7表位组42个克隆中，抑制率达80%以上的有3个，75%～80%间有22个，70%～75%间有11个，70%～60%的有5个，60%以下的有1个。
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表1 竞争ELISA试验结果 噬菌体
A450 nm
抑制率(%)
噬菌体
A450 nm
抑制率(%)
MG7
1.397
Positive
0.119
91.5
G1
, 百拇医药
0.483
65.4
Negative
1.219
12.7
G2
0.423
69.7
G3
0.330
76.3
G4
0.384
, 百拇医药
72.5
G5
0.479
65.7
G6
0.294
79.0
G7
0.378
72.9
G8
0.316
77.4
, 百拇医药
G9
0.327
76.6
G10
0.582
58.3
G11
0.387
72.3
G12
0.462
66.9
GC1
, 百拇医药
0.366
73.8
GC2
0.329
76.4
GC3
0.303
78.3
GC4
0.384
72.5
GC5
0.288
, 百拇医药
79.4
GC6
0.307
78.0
GC7
0.416
70.2
GC8
0.284
79.7
GC9
0.386
72.4
, 百拇医药
GC10
0.386
72.4
GC11
0.271
80.6
GC12
0.312
77.7
GC13
0.283
79.7
GC14
, 百拇医药
0.300
78.5
GC15
0.510
63.5
GC16
0.298
78.7
GC17
0.288
79.4
GC18
0.393
, 百拇医药
71.9
GC19
0.352
74.8
GC20
0.381
72.7
GC21
0.327
76.6
GC22
0.316
77.4
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GC23
0.316
77.4
GC24
0.281
80.0
GC25
0.302
78.4
GC26
0.288
79.4
GC27
, 百拇医药
0.305
78.2
GC28
0.268
80.8
GC29
0.308
78.0
GC30
0.293
79.0
五、DNA测序分析
在上述经过多次反复筛选的基础上，随机抽取一部分克隆进行了测序分析，测序结果见表2。在所测序的克隆中，GC5、GC24与GC27，GC11与GC13，G4与G10分别含有相同的插入肽段。分析结果，我们发现含PLX0-2S基序(其中，X为非特异性氨基酸残基；0-2为氨基酸数目)占测序克隆的44%，SAVR、XRMX、YARN亦有可能辰岷虾蠹尤氚逯蟹跤釧450 nm值，检测抑制效率，结果见表1。在所检测的MG7表位组42个克隆中，抑制率达80%以上的有3个，75%～80%间有22个，70%～75%间有11个，70%～60%的有5个，60%以下的有1个。表1 竞争ELISA试验结果 噬菌体
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呈现肽的蛋白序列
GC5/GC24/GC27
EFC-PLSWPFPVF-CGDP*
GC11/GC13
EFC-RFAPLSAVR-CGDP
GC25
EFC-SRPPLHLSF-CGDP
GC12
EFC-PLGSHNHLP-EFC-CGDP
GC23
EFC-SLDLHPLRS-CGDP
, 百拇医药
GC1
EFC-HGPRMISFW-CGDP
GC17
EFC-HGPRMISIR-CGDP
GC26
EFC-RMCKGCYTS-CGDP
GC8
EFC-NAIYARNAQ-CGDP
GC9
EFC-TCHLRVYAQ-CGDP
GC28
, 百拇医药
EFC-SWAPVYARN-CGDP
GC20
EFC-GSAVRRPSR-CGDP
G4/G10
EF-YKPSETIRM-DPA
G15
EF-RRPRLLDTA-DPA
表3 MG7表位组与HLA分子结合的预测
A3
A11
B8
, 百拇医药 B27
DR1
DR3
DR7
DR8
GC1
*
GC5/GC24/GC27
*
GC8
*
*
GC9
, 百拇医药 *
*
GC11/GC13
*
*
*
*
*
GC12
*
*
*
GC17
*
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*
*
GC19
*
GC20
*
*
*
GC23
*
*
*
*
GC25
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*
GC28
*
*
G4/G10
*
*
*
G15
*
*
*意指噬菌体呈现的肽序列可与某个HLA分子结合，如GC1可以与HLA-B28分子结合讨论
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已有文献报道，用抗体筛选噬菌体随机肽库是获得抗原表位的有效方法[5，6]。鉴于对抗原性的研究已在从天然抗原整个分子水平向表位水平过渡，我们尝试用胃癌单抗为筛选配基，从九肽随机肽库中筛选抗体识别的表位，以期寻找具有免疫原性的短肽序列。
测序结果显示，从pⅧ-cys肽库中得到的克隆相对于从pⅧ肽库中得到的克隆其呈现的肽序列要相对保守，这与我们的期望相符。已有的晶体结构衍射结果显示[7]，包含一对半胱氨酸的肽段(CXXXXXXXXXC)可形成链内二硫键，使所产生的环行肽结构相对有序和稳定，在空间结构上柔性减少，刚性增强，一般具有较高的亲和力和结合特异性。
ELISA竞争抑制实验提示，噬菌体模拟表位对天然抗原与抗体间结合的抑制率在60%～80%，这可能与两者间的亲和力及相互作用时所形成的空间构象有关；而我们还发现用天然抗原可完全抑制噬菌体表位与抗体的结合，提示噬菌体模拟表位与抗体的结合位点位于天然抗原与抗体结合位点之中。
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对一个线性蛋白质抗原而言，结构相似群往往可以是抗原分子中的一段氨基酸序列，即抗原表位(epitope)。对一个非线性抗原或非蛋白质抗原而言，肽性模拟表位可能不是抗原本身的序列，而是空间构象中相互接近而一级结构中互不连续的几个氨基酸。在这种情况下，模拟表位的氨基酸顺序可能与大分子抗原上的表位截然不同，却可能诱发特异性相似的免疫反应。由于胃癌MG7单抗所识别的胃癌相关抗原的编码基因尚未克隆成功，我们尚无法确定筛选出的阳性克隆所呈现的肽段与真正相关抗原的关系。但从我们已测序的克隆中，不难发现 PLX0-2S基序占了相对的优势。另外SAVR、XRMX、YARN亦有可能成为候选的表位基序。目前正在用阳性噬菌体呈现的肽段进行免疫原性分析，以期确定具有免疫原性的一种或多种最佳抗原模拟表位，为研究胃癌相关抗原与单抗结合的结构基序奠定基础。
此外，我们还希望就抗体的表位是否有可能成为或包含T细胞表位这一至今尚有争论的问题做一些有益的探讨。为此，我们运用计算机软件预测了抗体的模拟肽表位与HLA分子结合的可能性，发现大多数分子具有与HLA多个分子结合的可能性。这些分子是否可诱发CTL的杀伤活性，我们正在研究。
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志谢 上海第二医科大学瑞金医院血液病研究所陈竺院士、陈赛娟研究员在测序方面给予指导和帮助
基金项目：国家863课题(102-10-01-06)及国家杰出青年基金课题(39525020)共同资助项目
参考文献
1，樊代明,张学庸,陈希陶，等. 抗低分化胃癌细胞系MKN-46-9单克隆抗体的制备及免疫组化鉴定. 解放军医学杂志,1988，13:12-14.
2，Parmley SF, Smith GP. Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes. Gene, 1988, 73:305-318.
3，Luzzago A, Felici F, Tramontano A, et al. Mimicking of discontinuous epitopes by phage-displayed peptides, I. Epitope mapping of human H ferritin using a phage library of constrained peptides. Gene, 1993, 128: 51-57.
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4，Felici F, Luzzago A, Folgori A, et al. Mimicking of discontinuous epitopes by phage-displayed peptides, II. Selection of clones recognized by a protective monoclonal antibody against the Bordetella pertussis toxin from phage peptide libraries. Gene, 1993, 128: 21-27.
5，Cortese R, Felici F, Galfre G. Epitope discovery using peptide libraries displayed on phage. Trends Biotechnol, 1994, 12: 262-267.
6，Gevorkian G, Manoutcharian K, Almagro JC, et al. Identification of autoimmune thrombocytopenic purpura-related epitopes using phage-display peptide library. Clin Immunol Immunopathol, 1998, 86: 305-309.
7，Luzzago A, Felici F. Construction of disulfide-constrained random peptide libraries displayed on phage coat protein VIII. Methods in Molecular Biol, 1997, 87:155-164.
(收稿日期：1999-02-08), 百拇医药