纯化天然骨唾液蛋白的体内成骨活性
作者：王金熙 吴士良 周海斌 郑祖根
单位：王金熙 周海斌 郑祖根(215004苏州医学院附属第二医院骨科)；吴士良(苏州医学院生化教研室)
关键词：唾液糖蛋白类；骨再生；骨基质
中华骨科杂志000413
【摘要】目的评价骨唾液蛋白(bonesialoprotein,BSP)在大鼠体内的成骨活性。方法应用从牛骨中提取纯化的BSP与经盐酸胍处理的无骨诱导活性的不溶性骨基质(insolublebonematrix,IBM)或提纯的Ⅰ型胶原形成共价交联的复合物，将BSP-IBM复合物和BSP-Ⅰ型胶原复合物分别植入直径8mm的大鼠颅骨骨缺损和胸部皮下组织内。不含BSP的IBM或Ⅰ型胶原也分别植入上述部位作为对照。术后21d取植入物,行X线、组织学和组织化学观察及生物化学分析。结果BSP-IBM复合物和BSP-Ⅰ型胶原复合物在大鼠颅骨骨缺损内形成大量的新骨，绝大部分岛状新骨位于缺损中部，与宿主骨不相连接；单纯植入IBM或Ⅰ型胶原的颅骨缺损中部无新骨形成。BSP-IBM复合物和BSP-Ⅰ型胶原复合物在胸部皮下组织内未能诱导异位成骨。结论BSP在大鼠体内的成骨活性具有组织依赖性，提示局部微环境和反应细胞的特性可能对BSP的成骨活性有调节作用。
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In vivo osteogenic activity of purified native bone sialoprotein
WANG Jinxi , WU Shiliang, ZHOU Haibin, et al.
Department of Orthopaedics,The Second Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 215004,China
【 Abstract】 Objective To evaluate in vivo osteogenic activity of bone sialoprotein (BSP). Methods Purified native bovine BSP was covallently cross linked with non osteoinductive insoluble bone matrix(IBM) after guanidine- HC1 extraction or purified type Ⅰ collagen, and implanted into 8 mm calvarial defects and subcutaneous pouches in the thoracic regions of rats. IBM alone or collagenⅠ alone was implanted into the same sites as controls. The implants were harvested at 21 days after implantation. Osteogenic activity of the implants was evaluated by radiological, histological, histochemical and biochemical examinations. Results Abundant new bone formation occurred in the calvarial defects treated with BSP- IBM or BSP- collagenⅠ , new bone was not observed either in the mid portion of the defects filled with IBM or collagenⅠ alone or in the subcutaneous pouches implanted with BSP- IBM， BSP- collagenⅠ ,IBM or collagenⅠ alone. Conclusion In vivo osteogenic activity of purified native BSP is site dependent. The biologic characteristics of responding cells in the connective tissues adjacent to the calvarial defects and local microenvironment may play an important role in BSP- elicited in vivo osteogenesis of rats.
, 百拇医药
【 Key words】 Sialoglycoproteins; Bone regeneration; Bone matrix
骨缺损的传统治疗主要是采用自体骨移植及同种异体骨移植等方法，但这些方法均有各自的缺点。自Urist用脱钙骨基质在肌肉内诱导异位成骨以来，人们对骨形态发生蛋白(bonemorphogenicprotein,BMP)及多种生长因子在骨缺损修复中的作用进行了广泛的研究[1-3]。此外，一组基因和分子结构与BMP不同，含有大量唾液酸的骨基质蛋白在骨组织钙化过程中的生物活性也日益受到重视。其中研究较多的有：(1)骨桥素(osteopontin,OPN)，首先在骨基质提取物中被发现，曾被命名为BSP-Ⅰ。后证实此蛋白存在于多种组织中，并非钙化组织所特有。(2)骨唾液蛋白(bonesialoprotein,BSP)，曾被命名为BSP-Ⅱ。此蛋白存在于骨组织、成牙质细胞和胎盘膜的滋养层中，后者在妊娠后期融合并形成钙化点。由此可见，BSP基本分布于骨和其他钙化组织内[4]。鉴于上述两种骨基质蛋白在组织分布和生物学特性方面均有差别，近期文献统一将BSP-Ⅰ称为OPN；BSP-Ⅱ称为BSP[4]。本文主要研究BSP。体外细胞培养提示，磷酸化的BSP能启动和调节矿物质在基质内的沉积并促进细胞附着及前成骨细胞的增生[4-6]，但其确切机制尚未完全阐明。关于BSP在体内的生物机能，特别是在骨缺损修复中的成骨活性，更缺乏系统研究。Wang等[7]于1998年首次报告BSP-明胶复合物在大鼠颅骨骨缺损部位的成骨作用。本研究主要探讨BSP与不同载体结合后在骨缺损部位的成骨活性以及在软组织内的异位成骨能力。
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左上：BSP-IBM复合物右上：单纯IBM左下：
BSP-Ⅰ型胶原复合物右下：单纯Ⅰ型胶原
图1术后21d大鼠颅骨缺损部位X线片
材料与方法
一、植入材料
(一)纯化天然BSP:从牛骨中提取和纯化的BSP由美国哈佛大学口腔学院口腔生物系提供。
(二)盐酸胍提取后的不溶性骨基质(insolublebonematrix,IBM)：采用改良的Sampath法[8]。取大鼠长骨骨干皮质，脱脂和干燥后在液氮低温下粉碎成直径为75～300μm骨粒。将骨粒在0.6mol/L盐酸中完全脱钙后水洗，再次脱脂制成脱钙骨基质(demineralizedbonematrix,DBM)。将DBM在4mol/L盐酸胍及蛋白酶抑制剂中(4℃)分离提取20h，离心(12000r/min)后获可溶性提取物(含BMPs)和不溶性沉淀残渣(IBM，不含BMPs)。将沉淀残渣用新鲜配制的4mol/L盐酸胍在4℃下再次提取18h，离心后去除上清液。经二次提取的IBM用去离子水漂洗后冷冻干燥备用。
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(三)Ⅰ型胶原的提纯：按Piez法[9]从大鼠尾肌腱中提取纯化，并经蛋白电泳证实。
二、BSP复合物的制备
BSP与载体行共价交联。交联反应用0.1mmol双N-羟琥珀酰亚胺脂溶于0.5ml的50mmol三羟甲基氨基甲烷，pH值7.4。将25μg纯化BSP和15mgIBM(一个植入物的剂量)在上述溶液中搅匀，置22℃1h，制成BSP-IBM复合物，冷冻干燥备用。用同样方法制备BSP-Ⅰ型胶原复合物(25μgBSP和15mgⅠ型胶原)。
三、BSP体内成骨活性的观察
(一)BSP体内成骨活性的观察：雄性Wistar大鼠24只，8周龄。随机分成4组，每组6只。麻醉后，手术部位脱毛消毒。在颅顶做一纵行切口，暴露颅盖骨并切除局部骨膜。用圆头锉造成直径8mm的圆形全层顶骨缺损。生理盐水冲洗骨缺损部位以去除残存骨屑。将四种不同植入物分别植入颅骨缺损部位和胸部皮下组织囊袋内。第一组植入BSP-IBM复合物,第二组为15mgIBM,第三组为BSP-Ⅰ型胶原复合物,第四组为15mgⅠ型胶原。伤口间断缝合。术后21d处死动物，取出颅部及胸部皮下组织植入物做有关检查。
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(二)观察内容：(1)大体观察：植入物周围的组织反应，血管和新生骨形成等。(2)X线检查：所有标本均采用同一摄片条件，以比较不同植入物在骨缺损部位的钙盐沉积状况。(3)组织学和组织化学检查：取每个植入物的一半及其周围组织于体积分数为10%福尔马林液中固定后,行脱钙石蜡包埋或不脱钙塑料包埋。石蜡切片用HE或藏红(safraninO)染色,不脱钙塑料切片用组织化学方法标记碱性磷酸酶(ALP)活性或Goldner染色法识别新骨基质。光镜下观察。(4)生物化学分析：植入物的另一半经剔除周围组织(颅骨标本去除宿主骨)后定量，匀浆，4℃下离心30min(12000r/min)。取上清液测ALP活性,沉淀物用于测定钙含量。
结果
一、大体观察
术后21d取标本时，各组植入物周围均未见明显炎症反应。植入BSP-IBM或BSP-Ⅰ型胶原的颅骨缺损部位可触及骨化组织。胸部皮下的BSP-IBM和单纯IBM植入物表面由薄层纤维组织包裹；而胸部皮下的BSP-Ⅰ型胶原和单纯Ⅰ型胶原植入物绝大部分已被吸收。
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二、X线检查
所有植入BSP-IBM或BSP-Ⅰ型胶原的颅骨缺损部位均有大量岛状的X线不透性物质，且主要位于缺损中部，但直径8mm的缺损尚未完全被骨化组织所修复。IBM和Ⅰ型胶原组的颅骨缺损边缘有少量钙化组织，但缺损中部未见明显钙化组织(图1)。
三、组织学和组织化学观察
(1)BSP-IBM组：植入颅骨缺损的BSP-IBM颗粒已被部分吸收，其表面及间隙内有大量新骨形成(图2a)。新骨表面可见丰富的具有ALP活性的成骨细胞和新生血管，并有间充质细胞向成骨细胞分化的形态特征(图2b)。植入胸部皮下的BSP-IBM颗粒间有纤维组织和新生血管，但未见骨或软骨形成(图3)。(2)IBM组：植于颅骨缺损内的IBM颗粒已被部分吸收，颗粒之间可见血管和纤维组织。邻近骨缺损边缘的IBM颗粒表面有少量新骨，但缺损中部未有新骨或软骨形成(图4)。胸部皮下的IBM植入物内未见骨或软骨形成。(3)BSP-Ⅰ型胶原组：颅骨缺损部位形成大量岛状新骨，大部分新骨与宿主骨边缘不连接，新骨表面可见间充质细胞向前成骨细胞和成骨细胞分化的现象(图5)。植入胸部皮下的BSP-Ⅰ型胶原绝大部分已被吸收，未见骨或软骨形成。(4)Ⅰ型胶原组：植入颅骨缺损处的Ⅰ型胶原绝大部分已被吸收，骨缺损部位被丰富的新生血管和纤维组织所填充(图6)，少量新骨仅限于宿主骨的边缘。植入胸部皮下的单纯Ⅰ型胶原至术后21d绝大部分已被吸收，未见骨或软骨形成。
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图2a植于颅骨缺损处的BSP-IBM复合物中新骨形成，绿色为新骨基质，骨细胞埋于骨基质中。红色为尚未吸收的IBM颗粒Goldner染色×280
图2bBSP-IBM植入物内形成的新骨表面有大量具有ALP活性的成骨细胞(红色)，并有间充质细胞向成骨细胞分化的形态特征ALP染色×280
图3植于胸部皮下的BSP-IBM复合物内未见骨或软骨形成HE×200
图4植于颅骨缺损处的IBM颗粒间无新骨或软骨形成HE×200
, 百拇医药
图5植于颅骨缺损处的BSP-Ⅰ型胶原复合物内的岛状新骨，绿色为新骨基质Goldner染色×320
图6单纯Ⅰ型胶原植入颅骨缺损后未见骨或软骨形成HE×120
四、生物化学分析
术后21d各种植入物的ALP活性和钙含量见表1。统计学分析(t检验)提示：颅骨缺损植入物中BSP-IBM组的ALP活性和钙含量均高于IBM组，差异有非常显著性意义(P<0.01)；BSP-Ⅰ型胶原组的ALP活性和钙含量均高于Ⅰ型胶原组，差异有非常显著性意义(P<0.01)；BSP-IBM组的ALP活性和钙含量均高于BSP-Ⅰ型胶原组，但差异无显著性意义(P>0.05)。植于胸部皮下的BSP-Ⅰ型胶原和Ⅰ型胶原绝大部分已被吸收，残余组织量不足以作生化分析。
, 百拇医药
表1各组植入物的ALP活性和钙含量(n=6,
±s) 部位
植入物
ALP活性(u/mg)
钙含量(μg/mg)
颅骨缺损
BSP-IBM
13.86±3.14
21.53±4.21
IBM
2.18±0.89
, 百拇医药 4.07±1.02
BSP-Ⅰ型胶原
12.35±2.63
19.46±3.88
Ⅰ型胶原
2.01±0.82
2.98±0.76
胸部皮下
BSP-IBM
0.95±0.49
1.27±0.48
IBM
, 百拇医药
0.78±0.29
0.91±0.40
讨论
一、与长骨缺损的实验模型相比，本研究所采用的颅骨缺损模型具有一定优点：首先，颅骨缺损周围仍保持骨性连续，勿需做内固定或外固定以稳定断端，避免了因固定不稳所致的软骨骨痂形成而干扰对实验结果的分析。其次，颅骨的再生能力很差。文献报告直径8mm的大鼠颅骨骨缺损如无有效处理，术后13个月仍未愈合，骨缺损部位被致密纤维组织所充填[10]。因此，颅骨骨缺损部的新骨形成基本上归因于植入物的作用。在颅骨缺损内植入IBM或Ⅰ型胶原后，缺损边缘形成少量新骨，而缺损中部无新骨形成，提示这种边缘成骨现象为宿主骨和骨膜的修复反应向植入物内的延伸。但至术后21d，这种骨性修复反应仍局限于缺损边缘区。而植入BSP复合物的颅骨缺损中部可见大量的新骨形成。X线和组织学检查均提示缺损部的岛状新骨大多与宿主骨不相连续。证明缺损中部的新骨形成归因于植入物的生物活性。
, 百拇医药
二、本实验所使用的BSP系经专门的提纯方法进行纯化，以排除提纯物中含有BMP和其他生长因子的可能性，氨基酸序列分析证实其为高度纯化的BSP[6]。因考虑到IBM中残留微量BMP的可能性，本实验除了应用IBM作为载体外，还采用提纯的Ⅰ型胶原作为载体。Ⅰ型胶原中不含骨诱导物质，从而基本上排除了植入物中含有BSP以外的成骨活性物质的可能性。
三、文献报告BSP能促进前成骨细胞(或类成骨细胞)分化为成骨细胞，并参与细胞外基质的钙化[5,6,11]。值得注意的是，文献报告中BSP的成骨效应均发生于成骨细胞系列的体外细胞培养过程，而非未分化间充质细胞的培养。本实验观察到BSP-IBM和BSP-Ⅰ型胶原复合物能刺激颅骨缺损部位的间充质细胞向成骨细胞分化,进而形成新骨的形态特征，而相同剂量的BSP复合物在胸部皮下未能诱导间充质细胞分化成骨。此结果提示BSP在体内的成骨活性具有组织部位的依赖性或需要更高的浓度才能在皮下组织诱导成骨。这种组织部位的特异性可能与以下因素有关：首先，颅骨缺损部的硬脑膜和头皮下结缔组织(缺损部的骨膜已切除)内的间充质反应细胞(respondingcells)与胸部皮下的反应细胞在分化程度和对BSP的亲和力等特性可能有所不同。特别是硬脑膜细胞，由于硬脑膜与颅骨内骨膜在解剖上有联系，硬脑膜浅层细胞的分化程度可能较接近成骨潜能细胞，这种细胞在一定浓度的BSP刺激下具有向成骨细胞分化的潜能。其次，这种分化过程可能受局部血液供应状况和生物化学环境的影响。正常骨基质中含有多种生长因子和分化因子，这些因子可能在创伤和重建过程中释放，并向周围组织中扩散而形成一定的浓度。颅骨部位这些内源性因子可能对植入的BSP的成骨活性有重要的促进或辅助作用。
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BSP在骨缺损部位的成骨活性在骨生物学和骨缺损修复方面均具有重要意义。尽管术后21d，8mm的颅骨缺损尚未被完全修复，但组织学显示此时新骨形成仍在进行之中。因此，BSP的后期效果尚待进一步观察，特别是新骨岛能否进一步扩展融合，使颅骨缺损完全修复，新骨能否被改建成具有内、外板的正常颅骨结构等。为了进一步明确这种成骨活性具有组织部位的依赖性，有必要进一步观察BSP植入骨缺损部位后早期的细胞分化特征及内源性生长因子和分化因子对BSP生物活性的调节作用。
参考文献
1，Urist MR. Bone: formation by autoinduction. Science,1965, 150:893- 899.
2，谭祖键，李起鸿.BMP及其诱导成骨的分子生物学基础.中华骨科杂志，1996，16:587-589.
3，梁戈，胡蕴玉，郑昌琼,等.多孔β-TCP/BMP复合人工骨的研制和动物体内的相关研究.中华骨科杂志，1998,18:75-79.
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4，Robey PG. Bone matrix proteoglycans and glycoproteins. In: Bilezikian JP, Raisz LG, Rodan GA, Eds. Principles of bone biology. San Diego:Academic Press, 1996. 155- 165.
5，Bianco P, Fisher LW, Young MF, et al. Expression of bone sialoprotein (BSP) in developing human tissues. Calcif Tissue Int, 1991, 49:421- 426.
6，Zhou HY,Takita H,Fujisawa R, et al. Stimulation by bone sialoprotein of calcification in osteoblast like MC3T3- E1 cells. Calcif Tissue Int,1995,56:403- 407.
, 百拇医药
7，Wang J, Kennedy JG, Kasser JR, et al. Novel bioactive property of purified native bone sialoprotein in bone repair of a calvarial defect. Orthop Trans, 1998, 22:951- 952.
8，Sampath TK, Reddi AH. Dissociative extraction and reconstitution of extracellular matrix components involved in local bone differentiation. Proc Natl Acad Sci USA, 1981, 78:7599- 7603.
9，Piez KA, Eigner EA, Lewis MS. The chromatographic separation and
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amino acid composition of the subunits of several collagens. Biochem, 1963, 2:58- 65.
10，Hollinger JO, Kleinschmidt JC. The critical size defect as an experimental model to test bone repiar materials. J Craniofac Surg, 1990, 1:60- 68.
11，Cooper LF, Yliheikkila PK, Felton DA, et al. Spatiotemporal assessment of fetal bovine osteoblast culture differentiation indicates a role for BSP in promoting differentiation. J Bone Miner Res, 1998, 13:620- 632.
(收稿日期:1999-04-02), http://www.100md.com
单位：王金熙 周海斌 郑祖根(215004苏州医学院附属第二医院骨科)；吴士良(苏州医学院生化教研室)
关键词：唾液糖蛋白类；骨再生；骨基质
中华骨科杂志000413
【摘要】目的评价骨唾液蛋白(bonesialoprotein,BSP)在大鼠体内的成骨活性。方法应用从牛骨中提取纯化的BSP与经盐酸胍处理的无骨诱导活性的不溶性骨基质(insolublebonematrix,IBM)或提纯的Ⅰ型胶原形成共价交联的复合物，将BSP-IBM复合物和BSP-Ⅰ型胶原复合物分别植入直径8mm的大鼠颅骨骨缺损和胸部皮下组织内。不含BSP的IBM或Ⅰ型胶原也分别植入上述部位作为对照。术后21d取植入物,行X线、组织学和组织化学观察及生物化学分析。结果BSP-IBM复合物和BSP-Ⅰ型胶原复合物在大鼠颅骨骨缺损内形成大量的新骨，绝大部分岛状新骨位于缺损中部，与宿主骨不相连接；单纯植入IBM或Ⅰ型胶原的颅骨缺损中部无新骨形成。BSP-IBM复合物和BSP-Ⅰ型胶原复合物在胸部皮下组织内未能诱导异位成骨。结论BSP在大鼠体内的成骨活性具有组织依赖性，提示局部微环境和反应细胞的特性可能对BSP的成骨活性有调节作用。
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In vivo osteogenic activity of purified native bone sialoprotein
WANG Jinxi , WU Shiliang, ZHOU Haibin, et al.
Department of Orthopaedics,The Second Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 215004,China
【 Abstract】 Objective To evaluate in vivo osteogenic activity of bone sialoprotein (BSP). Methods Purified native bovine BSP was covallently cross linked with non osteoinductive insoluble bone matrix(IBM) after guanidine- HC1 extraction or purified type Ⅰ collagen, and implanted into 8 mm calvarial defects and subcutaneous pouches in the thoracic regions of rats. IBM alone or collagenⅠ alone was implanted into the same sites as controls. The implants were harvested at 21 days after implantation. Osteogenic activity of the implants was evaluated by radiological, histological, histochemical and biochemical examinations. Results Abundant new bone formation occurred in the calvarial defects treated with BSP- IBM or BSP- collagenⅠ , new bone was not observed either in the mid portion of the defects filled with IBM or collagenⅠ alone or in the subcutaneous pouches implanted with BSP- IBM， BSP- collagenⅠ ,IBM or collagenⅠ alone. Conclusion In vivo osteogenic activity of purified native BSP is site dependent. The biologic characteristics of responding cells in the connective tissues adjacent to the calvarial defects and local microenvironment may play an important role in BSP- elicited in vivo osteogenesis of rats.
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【 Key words】 Sialoglycoproteins; Bone regeneration; Bone matrix
骨缺损的传统治疗主要是采用自体骨移植及同种异体骨移植等方法，但这些方法均有各自的缺点。自Urist用脱钙骨基质在肌肉内诱导异位成骨以来，人们对骨形态发生蛋白(bonemorphogenicprotein,BMP)及多种生长因子在骨缺损修复中的作用进行了广泛的研究[1-3]。此外，一组基因和分子结构与BMP不同，含有大量唾液酸的骨基质蛋白在骨组织钙化过程中的生物活性也日益受到重视。其中研究较多的有：(1)骨桥素(osteopontin,OPN)，首先在骨基质提取物中被发现，曾被命名为BSP-Ⅰ。后证实此蛋白存在于多种组织中，并非钙化组织所特有。(2)骨唾液蛋白(bonesialoprotein,BSP)，曾被命名为BSP-Ⅱ。此蛋白存在于骨组织、成牙质细胞和胎盘膜的滋养层中，后者在妊娠后期融合并形成钙化点。由此可见，BSP基本分布于骨和其他钙化组织内[4]。鉴于上述两种骨基质蛋白在组织分布和生物学特性方面均有差别，近期文献统一将BSP-Ⅰ称为OPN；BSP-Ⅱ称为BSP[4]。本文主要研究BSP。体外细胞培养提示，磷酸化的BSP能启动和调节矿物质在基质内的沉积并促进细胞附着及前成骨细胞的增生[4-6]，但其确切机制尚未完全阐明。关于BSP在体内的生物机能，特别是在骨缺损修复中的成骨活性，更缺乏系统研究。Wang等[7]于1998年首次报告BSP-明胶复合物在大鼠颅骨骨缺损部位的成骨作用。本研究主要探讨BSP与不同载体结合后在骨缺损部位的成骨活性以及在软组织内的异位成骨能力。
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左上：BSP-IBM复合物右上：单纯IBM左下：
BSP-Ⅰ型胶原复合物右下：单纯Ⅰ型胶原
图1术后21d大鼠颅骨缺损部位X线片
材料与方法
一、植入材料
(一)纯化天然BSP:从牛骨中提取和纯化的BSP由美国哈佛大学口腔学院口腔生物系提供。
(二)盐酸胍提取后的不溶性骨基质(insolublebonematrix,IBM)：采用改良的Sampath法[8]。取大鼠长骨骨干皮质，脱脂和干燥后在液氮低温下粉碎成直径为75～300μm骨粒。将骨粒在0.6mol/L盐酸中完全脱钙后水洗，再次脱脂制成脱钙骨基质(demineralizedbonematrix,DBM)。将DBM在4mol/L盐酸胍及蛋白酶抑制剂中(4℃)分离提取20h，离心(12000r/min)后获可溶性提取物(含BMPs)和不溶性沉淀残渣(IBM，不含BMPs)。将沉淀残渣用新鲜配制的4mol/L盐酸胍在4℃下再次提取18h，离心后去除上清液。经二次提取的IBM用去离子水漂洗后冷冻干燥备用。
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(三)Ⅰ型胶原的提纯：按Piez法[9]从大鼠尾肌腱中提取纯化，并经蛋白电泳证实。
二、BSP复合物的制备
BSP与载体行共价交联。交联反应用0.1mmol双N-羟琥珀酰亚胺脂溶于0.5ml的50mmol三羟甲基氨基甲烷，pH值7.4。将25μg纯化BSP和15mgIBM(一个植入物的剂量)在上述溶液中搅匀，置22℃1h，制成BSP-IBM复合物，冷冻干燥备用。用同样方法制备BSP-Ⅰ型胶原复合物(25μgBSP和15mgⅠ型胶原)。
三、BSP体内成骨活性的观察
(一)BSP体内成骨活性的观察：雄性Wistar大鼠24只，8周龄。随机分成4组，每组6只。麻醉后，手术部位脱毛消毒。在颅顶做一纵行切口，暴露颅盖骨并切除局部骨膜。用圆头锉造成直径8mm的圆形全层顶骨缺损。生理盐水冲洗骨缺损部位以去除残存骨屑。将四种不同植入物分别植入颅骨缺损部位和胸部皮下组织囊袋内。第一组植入BSP-IBM复合物,第二组为15mgIBM,第三组为BSP-Ⅰ型胶原复合物,第四组为15mgⅠ型胶原。伤口间断缝合。术后21d处死动物，取出颅部及胸部皮下组织植入物做有关检查。
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(二)观察内容：(1)大体观察：植入物周围的组织反应，血管和新生骨形成等。(2)X线检查：所有标本均采用同一摄片条件，以比较不同植入物在骨缺损部位的钙盐沉积状况。(3)组织学和组织化学检查：取每个植入物的一半及其周围组织于体积分数为10%福尔马林液中固定后,行脱钙石蜡包埋或不脱钙塑料包埋。石蜡切片用HE或藏红(safraninO)染色,不脱钙塑料切片用组织化学方法标记碱性磷酸酶(ALP)活性或Goldner染色法识别新骨基质。光镜下观察。(4)生物化学分析：植入物的另一半经剔除周围组织(颅骨标本去除宿主骨)后定量，匀浆，4℃下离心30min(12000r/min)。取上清液测ALP活性,沉淀物用于测定钙含量。
结果
一、大体观察
术后21d取标本时，各组植入物周围均未见明显炎症反应。植入BSP-IBM或BSP-Ⅰ型胶原的颅骨缺损部位可触及骨化组织。胸部皮下的BSP-IBM和单纯IBM植入物表面由薄层纤维组织包裹；而胸部皮下的BSP-Ⅰ型胶原和单纯Ⅰ型胶原植入物绝大部分已被吸收。
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二、X线检查
所有植入BSP-IBM或BSP-Ⅰ型胶原的颅骨缺损部位均有大量岛状的X线不透性物质，且主要位于缺损中部，但直径8mm的缺损尚未完全被骨化组织所修复。IBM和Ⅰ型胶原组的颅骨缺损边缘有少量钙化组织，但缺损中部未见明显钙化组织(图1)。
三、组织学和组织化学观察
(1)BSP-IBM组：植入颅骨缺损的BSP-IBM颗粒已被部分吸收，其表面及间隙内有大量新骨形成(图2a)。新骨表面可见丰富的具有ALP活性的成骨细胞和新生血管，并有间充质细胞向成骨细胞分化的形态特征(图2b)。植入胸部皮下的BSP-IBM颗粒间有纤维组织和新生血管，但未见骨或软骨形成(图3)。(2)IBM组：植于颅骨缺损内的IBM颗粒已被部分吸收，颗粒之间可见血管和纤维组织。邻近骨缺损边缘的IBM颗粒表面有少量新骨，但缺损中部未有新骨或软骨形成(图4)。胸部皮下的IBM植入物内未见骨或软骨形成。(3)BSP-Ⅰ型胶原组：颅骨缺损部位形成大量岛状新骨，大部分新骨与宿主骨边缘不连接，新骨表面可见间充质细胞向前成骨细胞和成骨细胞分化的现象(图5)。植入胸部皮下的BSP-Ⅰ型胶原绝大部分已被吸收，未见骨或软骨形成。(4)Ⅰ型胶原组：植入颅骨缺损处的Ⅰ型胶原绝大部分已被吸收，骨缺损部位被丰富的新生血管和纤维组织所填充(图6)，少量新骨仅限于宿主骨的边缘。植入胸部皮下的单纯Ⅰ型胶原至术后21d绝大部分已被吸收，未见骨或软骨形成。
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图2a植于颅骨缺损处的BSP-IBM复合物中新骨形成，绿色为新骨基质，骨细胞埋于骨基质中。红色为尚未吸收的IBM颗粒Goldner染色×280
图2bBSP-IBM植入物内形成的新骨表面有大量具有ALP活性的成骨细胞(红色)，并有间充质细胞向成骨细胞分化的形态特征ALP染色×280
图3植于胸部皮下的BSP-IBM复合物内未见骨或软骨形成HE×200
图4植于颅骨缺损处的IBM颗粒间无新骨或软骨形成HE×200
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图5植于颅骨缺损处的BSP-Ⅰ型胶原复合物内的岛状新骨，绿色为新骨基质Goldner染色×320
图6单纯Ⅰ型胶原植入颅骨缺损后未见骨或软骨形成HE×120
四、生物化学分析
术后21d各种植入物的ALP活性和钙含量见表1。统计学分析(t检验)提示：颅骨缺损植入物中BSP-IBM组的ALP活性和钙含量均高于IBM组，差异有非常显著性意义(P<0.01)；BSP-Ⅰ型胶原组的ALP活性和钙含量均高于Ⅰ型胶原组，差异有非常显著性意义(P<0.01)；BSP-IBM组的ALP活性和钙含量均高于BSP-Ⅰ型胶原组，但差异无显著性意义(P>0.05)。植于胸部皮下的BSP-Ⅰ型胶原和Ⅰ型胶原绝大部分已被吸收，残余组织量不足以作生化分析。
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表1各组植入物的ALP活性和钙含量(n=6,
±s) 部位植入物
ALP活性(u/mg)
钙含量(μg/mg)
颅骨缺损
BSP-IBM
13.86±3.14
21.53±4.21
IBM
2.18±0.89
, 百拇医药 4.07±1.02
BSP-Ⅰ型胶原
12.35±2.63
19.46±3.88
Ⅰ型胶原
2.01±0.82
2.98±0.76
胸部皮下
BSP-IBM
0.95±0.49
1.27±0.48
IBM
, 百拇医药
0.78±0.29
0.91±0.40
讨论
一、与长骨缺损的实验模型相比，本研究所采用的颅骨缺损模型具有一定优点：首先，颅骨缺损周围仍保持骨性连续，勿需做内固定或外固定以稳定断端，避免了因固定不稳所致的软骨骨痂形成而干扰对实验结果的分析。其次，颅骨的再生能力很差。文献报告直径8mm的大鼠颅骨骨缺损如无有效处理，术后13个月仍未愈合，骨缺损部位被致密纤维组织所充填[10]。因此，颅骨骨缺损部的新骨形成基本上归因于植入物的作用。在颅骨缺损内植入IBM或Ⅰ型胶原后，缺损边缘形成少量新骨，而缺损中部无新骨形成，提示这种边缘成骨现象为宿主骨和骨膜的修复反应向植入物内的延伸。但至术后21d，这种骨性修复反应仍局限于缺损边缘区。而植入BSP复合物的颅骨缺损中部可见大量的新骨形成。X线和组织学检查均提示缺损部的岛状新骨大多与宿主骨不相连续。证明缺损中部的新骨形成归因于植入物的生物活性。
, 百拇医药
二、本实验所使用的BSP系经专门的提纯方法进行纯化，以排除提纯物中含有BMP和其他生长因子的可能性，氨基酸序列分析证实其为高度纯化的BSP[6]。因考虑到IBM中残留微量BMP的可能性，本实验除了应用IBM作为载体外，还采用提纯的Ⅰ型胶原作为载体。Ⅰ型胶原中不含骨诱导物质，从而基本上排除了植入物中含有BSP以外的成骨活性物质的可能性。
三、文献报告BSP能促进前成骨细胞(或类成骨细胞)分化为成骨细胞，并参与细胞外基质的钙化[5,6,11]。值得注意的是，文献报告中BSP的成骨效应均发生于成骨细胞系列的体外细胞培养过程，而非未分化间充质细胞的培养。本实验观察到BSP-IBM和BSP-Ⅰ型胶原复合物能刺激颅骨缺损部位的间充质细胞向成骨细胞分化,进而形成新骨的形态特征，而相同剂量的BSP复合物在胸部皮下未能诱导间充质细胞分化成骨。此结果提示BSP在体内的成骨活性具有组织部位的依赖性或需要更高的浓度才能在皮下组织诱导成骨。这种组织部位的特异性可能与以下因素有关：首先，颅骨缺损部的硬脑膜和头皮下结缔组织(缺损部的骨膜已切除)内的间充质反应细胞(respondingcells)与胸部皮下的反应细胞在分化程度和对BSP的亲和力等特性可能有所不同。特别是硬脑膜细胞，由于硬脑膜与颅骨内骨膜在解剖上有联系，硬脑膜浅层细胞的分化程度可能较接近成骨潜能细胞，这种细胞在一定浓度的BSP刺激下具有向成骨细胞分化的潜能。其次，这种分化过程可能受局部血液供应状况和生物化学环境的影响。正常骨基质中含有多种生长因子和分化因子，这些因子可能在创伤和重建过程中释放，并向周围组织中扩散而形成一定的浓度。颅骨部位这些内源性因子可能对植入的BSP的成骨活性有重要的促进或辅助作用。
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BSP在骨缺损部位的成骨活性在骨生物学和骨缺损修复方面均具有重要意义。尽管术后21d，8mm的颅骨缺损尚未被完全修复，但组织学显示此时新骨形成仍在进行之中。因此，BSP的后期效果尚待进一步观察，特别是新骨岛能否进一步扩展融合，使颅骨缺损完全修复，新骨能否被改建成具有内、外板的正常颅骨结构等。为了进一步明确这种成骨活性具有组织部位的依赖性，有必要进一步观察BSP植入骨缺损部位后早期的细胞分化特征及内源性生长因子和分化因子对BSP生物活性的调节作用。
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(收稿日期:1999-04-02), http://www.100md.com