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编号:10233762
双歧杆菌对裸鼠移植大肠癌增殖与凋亡的原位研究
http://www.100md.com 《世界华人消化杂志》 2000年第4期
     作者:王立生 潘令嘉 陈村龙 李明松 孙 勇 张亚历

    单位:中国人民解放军第一军医大学南方医院全军消化内科研究所 广东省广州市 510515

    关键词:双歧杆菌;细胞凋亡;增殖细胞核抗原;结直肠肿瘤

    摘 要摘 要:目的 通过观察大肠癌裸鼠移植瘤细胞凋亡与细胞增殖活性之间的关系.探讨双歧杆菌的抑瘤途径及其机制。方法 利用原位末端标记技术及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色对40只裸鼠大肠癌移植瘤中的凋亡细胞和增殖细胞进行了原位观察。结果 双歧杆菌注射组大肠癌移植瘤的凋亡细胞密度显著高于肿瘤对照组(t=3.836,P<0.01).而肿瘤对照组的PCNA阳性细胞密度明显高于双歧杆菌注射组(t=3.074,P<0.01)。结论 双歧杆菌能诱导大肠癌裸鼠移植瘤细胞的凋亡,并能降低它的增殖活性。

    Effect of Bifidobacterium on proliferation and apoptosis of experimental large bowel carcinoma in situ
, 百拇医药
    Li Sheng Wang ,Ling Jia Pan ,Chun Long Chen ,Ming Song Li ,Yang Shun ,Ya Li Zhang

    (PLA Institute for Digestive Medicine,Nanfang Hospital,First Military Medical Univisity,Guangzhou 510515,Guangdong Province,China)

    Abstract:AIM To explore the antitumor ways and mechanisms of Bifidebacteria and observe the relationship between apoptosis and proliferating activity of nude mouse transplantated tumors of large bowel carcinoma.METHODS The apoptotic calls and expression of proliferating call nuclear antigen (PCNA) in 40 cases of nude mice with transplantated tumors of large bowel carcinoma were investigated using in situ end labeling technique and PCNA immnohistochemical staining.RESULTS Tbe density of apoptotic cells of transplantated tumors in the Bifidobacteritrm injection group wassignificantly higher than the control group (t=3.836,P<0.01). The density of proliferating cells in the Bifidobacterium injection group was obviously lower than that in the control group (t=3.074, P< 0.01).CONCLUSION Bifidobacteria could induce apoptosis of nude mouse transplantated tumors of large bowel carcinoma, and decrease the proliferating activity of the tumors.
, 百拇医药
    Keywords:Bifidobacterium; apoptosis;proliferating cell nuclear antigen; colorectal neoplasms

    0引言目前认为恶性肿瘤的发生与发展和细胞增殖旺盛,凋亡减少相关.很多治疗恶性肿瘤的措施均可诱导肿瘤细胞的凋亡,降低它的增殖活性,如放疗、化疗以及热疗等.双歧杆菌是机体肠道内最重要的生理性细菌,它在体内对多种肿瘤的生长均具有抑制作用,如MethA纤维肉瘤、肝癌和乳腺癌等[1].我们也证实,青春型双歧杆菌对大肠癌裸鼠移植瘤的生长具有一定的阻抑作用[2],现以原位末端标记法以及免疫组化染色观察了青春型双歧杆菌对大肠癌裸鼠移植瘤组织中的凋亡细胞以及增殖细胞核抗原(proliferatingcekknuclearantigen,PCNA)的表达水平,旨在探讨它的抑瘤机制。1材料和方法1.1材料Balb/c(nu/nu),♂,6~8周龄,体质量18g~22g,购于本校实验动物中心,饲养于SPF级动物室,双歧杆菌系本所从健康婴儿粪便中分离培养所得,经API-20A及TAB系统(英国)和多次生化反应鉴定为青春型,实验时将双歧杆菌接种至硫乙醇酸盐肉汤中,置厌氧培养箱37℃培养72h,含菌培养液3000r/min离心10min,去上清,沉渣以PBS液洗3次,调细菌数为1×1013/L大肠癌Lovo细胞株为人未分化结肠癌细胞,引自本校病理教研室.按常规传代于含100mL/L小牛血清的RPMl1640培养液中,生长至单层后,以2.5g/L胰蛋白酶消化贴壁的细胞,调细胞数为1×10l0/L。1.2方法动物分为2组,①肿瘤对照组:20只裸鼠,实验的d1于裸鼠的左前肢背部皮下接种Lovo细胞2×106(0.2mL),d2起于其腹腔注射PBS液0.2mL,1次/d,连续5d;②双歧杆菌注射组:20只裸鼠,实验d1接种Lovo细胞的数量、部位及程序均同肿瘤对照组,不同之处是d2起向裸鼠腹腔注射双歧杆菌2×109(0.2mL),1次/d,连续5d.实验后21J处死动物,剥离瘤体,将新鲜肿瘤组织固定于100mL/L中性福尔马林溶液中,常规石蜡包埋,制片,行HE染色,组织学证实为未分化结肠癌。1.2.1原位末端标记(insituendlabeling,ISEL)染色按谭晓华介绍的方法进行[2].切片常规脱蜡,梯度乙醇,复水化;将组织切片浸入2×SSC溶液中,80℃孵育20min,蒸馏水洗尽;5g/L胃蛋白酶(Ph2.0)37℃消化10min,蒸馏水洗尽;滴加bufferA液(含50mmol/LTris-HCI,5mmol/LMgCl2,10mmol/Lβ-琉基乙醇及50mg/LBSA,Ph7.5),室温孵育5min;弃去bufferA,滴加标记液50μL,25℃温育60min,标记液内含0.005mmol/LDntp(Datp,Dctp,Dgtp),0.005mmoL/Lbiotin-16-Dutp和25KU/LKlenow大片段;PBS洗2次,各3min;10mL/LH202-甲醇溶液以阻断内源性过氧化物酶,室温15min;PBS洗2次,各3min;滴加辣根过氧化物酶标亲和素(HRP-avidin)覆盖组织,室温下30min;PBS洗2次,各3min;DAB-H2O2显色,流水冲洗,苏木素复染,常规脱水,透明,封片.阴性对照在第5步改用不含Klenow大片段的标记液,其余相同。以上所用的主要试剂Dntp,biotin-16-Dutp购自德国宝灵曼公司,Klenow大片段购自Promega,HRP-avidin为美国Zyined公司产品。1.2.2PCNA免疫组化染色染色程序按免疫组化SP法常规进行.鼠抗人PCNA单抗,生物素化马抗鼠IgG以及SP试剂盒均为美国SantaCruz公司产品.以PBS代替-抗作为阴性对照.对每例切片以16D目镜测微网在400倍放大下计数网格中的阳性细胞数,每例计数10个网格,取其均值作为该样本的凋亡细胞或PCNA阳性细胞密度,以t检验行统计学处理。2结果2.1大肠癌移植瘤ISEL染色结果ISEL阳性细胞核呈淡黄色,背景清晰.肿瘤对照组移植瘤的ISEL阳性细胞呈散在分布,数量极少,这说明肿瘤组织也存在自发的凋亡现象.双歧杆菌注射组的ISEL阳性细胞呈片状或弥漫分布,数量较多,明显多于肿瘤对照组(t=3.074,P<0.01,表1,图1).2.2双歧杆菌对大肠癌裸鼠移植瘤增殖活性的影响免疫组化染色结果显示,PCNA阳性细胞核呈棕黄色,背景清晰,呈弥散分布.肿瘤对照组大肠癌移植瘤的PCNA阳性细胞密度显著高于双歧杆菌注射组(t=3.836,P<0.01,表1,图2).表1大肠癌裸鼠移植瘤凋亡细胞和PCNA阳性细胞密度(个±s,n=20)bp<0.0l,vs肿瘤对照组。图1双歧杆菌注射组大肠癌移植瘤中可见多量的ISEL阳性细胞,×200图2双歧杆菌注射组大肠癌移植瘤中可见较多量的PCNA阳性细胞,×2003讨论细胞增殖失控以及凋亡减少是许多恶性肿瘤发生与发展的基础.肿瘤细胞增殖活性的高低反映了它的预后、对放疗及化疗的反应和转归等生物学特性.PCNA是DNA聚合酶&的辅因子,它于细胞增殖周期的G1晚期出现,S期达到高峰,并与G2及M期逐渐下降,为细胞增生、DNA复制及合成所必须,因此PCNA是反映细胞增殖活性的一个客观指标[4].本结果表明,肿瘤对照组大肠癌移植瘤组织的PCNA阳性细胞密度显著高于双歧杆菌对照组,说明肿瘤对照组移植瘤细胞具有较高的增殖活性,处于S期的细胞比例较高,肿瘤的增殖速度也较快,相反荷瘤鼠经双歧杆菌处理后,移植瘤组织的增殖能力被抑制,最终也抑制了肿瘤的生长.通过各种途径诱导肿瘤细胞的凋亡是防治肿瘤的一条途径。已知许多化疗药物、放射线、高温以及激素均可诱导肿瘤细胞的凋亡,实现其抗瘤目的.目前检测细胞凋亡的方法与手段主要有电镜、流式细胞仪、DNA降解片段的凝胶电泳以及ISEL技术等。由于ISEL放大作用强,少量的DNA断裂即可出现阳性反应,因此它不仅能特异原位显示凋亡细胞的存在,而且还能获得处于凋亡早期的细胞,甚至HE染色胞核无明显变化时ISEL染色即可出现阳性反应[5].并且ISEL染色结果能与组织学结构相对比,确定凋亡细胞的部位,同时也可用于石蜡切片作回顾性分析,因此在实际工作中它的应用日益广泛.本结果表明,肿瘤对照组大肠癌移植瘤的ISEL阳性细胞数量减少,呈散在分布,而双歧杆菌注射组的阳性细胞较多,其密度显著高于肿瘤对照组,提示青春型双歧杆菌能诱导大肠癌移植瘤细胞的凋亡。一定数量的双歧杆菌对维持肠道的微生态平衡起重要作用,也是人体健康的重要标记.它不仅具有生物学屏障、营养免疫、抗感染和延缓衰老等生理功能,而且还具有抗肿瘤作用.Sekineetal[6]证实婴儿型双歧杆菌能显著抑制小鼠皮下移植的MethA纤维肉瘤的发生与发展.我们也观察到青春型双歧杆菌对大肠癌裸鼠移植瘤的生长具有明显的阻抑作用[2].目前普遍认为双歧杆菌的抑瘤机制主要是通过激活机体免疫系统中的巨噬细胞,使之分泌多量的具有抗瘤活性的IL-1,IL-6,IL-12,TNF-a以及NO等[7,8].结合本实验结果,我们认为青春型双歧杆菌的另一抑瘤途径是降低肿瘤细胞的增殖活性,阻止肿瘤细胞分裂,同时诱导它的凋亡。
, http://www.100md.com
    作者简介:王立生,男,196年7月30日出生,江西省宁都县人,汉族。1998年第一军医大学医学博士,讲师,主治医师。目前主要从事胃肠道微生态学的研究,发表论文32篇。

    参考文献:

    [1]Reddy BS,Rivenson A.Inhibitory effect of Bifidobacterium longum on colon,mammary and live carcinogenesis induced by 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline,a food mutagen,Cancer Res,1993;53:3914-3918

    [2]Wang LS, Pan LJ, Shi L, Zhang YL, Zhou DY. The primary observation of inhibiting function of Biffidobacteria to experimental colorectal carcinoma and its mechanisms.Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6:456-457
, 百拇医药
    [3]Tan XH, Zhang YL, Jiang B, Chen XQ, Li MS, Zhou DY. In situ end labeling detection for apoptosis in formal tissue sections. Xibao Shengwuxue Zazhi,1997;19:48-50

    [4] Connolly KM,Bogdanffy MS.Evaluation of proliferating cell nuclear antigen (PCNA)as an endogenous marker of cell proliferation in rat liver:a dual staining comparison with 5-bromo-2-deoxyuridine.J Histochem Cytochem,1993;41:1-8

    [5]Gavrieli Y,Sherman Y,Ben-Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.J Cell Biol,1992;119;493-501
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    [6]Sekine K,Watanabe SE,Ohta J.Induction and activation of tumoricidal cells in vivo and in vitro by the bacterial cell wall of bifidobacterium infantis.Bifidobacteria Microflora,1994;13:65-72

    [7]Wang LS, Pan LJ, Shi L, Sun Y, Zhang YL. Zhou DY. The effects of Bifidobacteria on IL-1,IL-6 and IL-12 produced by peritoneal macrophages of nude mice.Zhonghua Weishengwuxue Zazhi,1998;18:373

    [8]Sekine K, Ohta J,Onishi M,Tatsuki T,Shimokawa Y,Toida T,Kawashima T,Hashimoto Y.Analysis of antitumor properties of effector cells stimulated with a cell wall preparation (WPG)of Bifidobacterium infantis.Biol Pharm Bull,1995;18:148-153

    收稿日期:1999-10-25, http://www.100md.com