微乳毛细管电泳分离吉他霉素组分
作者：洪利娅 郦玲
单位：洪利娅(浙江省药品检验所 杭州 310004)；郦玲(浙江省天台药品检验所)
关键词：吉他霉素；组分；微乳毛细管电泳
药物分析杂志000412 摘要 目的：建立大环内酯类药物吉他霉素的高效毛细管电泳分离方法。方法：以微乳毛细管电泳分离模式对吉他霉素各组分的分离进行了研究；考察了电泳体系各因素对分离的影响。结果：以0.08 mol.L-1正庚烷-10%异丙醇-0.01 mol.L-1硼酸钠-0.12 mol.L-1SDS(pH 9.0)作为微乳液，在柱温30 ℃，电压25 kV，检测波长214 nm条件下分离吉他霉素，各组分得到了良好分离；重现性考察结果表明，6次测量主组分A5迁移时间的RSD为0.7%，峰面积RSD为1.9%。结论：微乳毛细管电泳在吉他霉素组分分离方面的成功应用，为结构相似的中性物质的分离提供了一种新方法,也为日后的定量测定提供了依据。
, 百拇医药
Separation of Active Ingredients in Kitasamycin
by Microemulsion Capillary Electrophoresis
Hong Liya and Li Ling
( Zhejiang Provincial Institute for Drug Control, Hangzhou 310004)
Abstract Objective：To establish a high performance capillary electrophoresis ( HPCE ) method for the separation of active ingredients in kitasamycin. Methods:A study of the separation of active ingredients in kitasamycin by microemulsion electrokinetic chromatography ( MEEKC ) is presented. The effects of some factors in the electrophoretic conditions on the separation were investigated .Results: The satisfactory separation was achieved on optimization of electrophoretic condition: 0.08 mol.L-1 heptane-10% isopropanol - 0.01 mol.L-1 sodium tetraborate buffer - 0.12 mol.L-1 SDS (pH 9.0) as microemulsion with on - column UV monitoring at 214 nm,25 kV applied voltage, 30 ℃ column temperature. The relative standard deviations of migration time and peak area of A5 for replicate injections (n=6) were 0.7% and 1.9% ,respectively.Conclusion:The results demonstrated that MEEKC would be a promising technique for separation and determination of strongly hydrophobic neutral compounds with similar structure .
, 百拇医药
Key words kitasamycin, ingredients, microemulsion electrokinetic chromatography▲
吉他霉素(kitasamycin)是十六元环大环内酯类抗生素，疗效优于红霉素。目前国内外生产的产品主要含A族(A1，A3～A9)组分[1]，由于国内外不同厂家所用的菌种不同，故产品的组分比例也有差异，从而影响产品的优劣和临床疗效。文献[2～4]均采用HPLC法测定组分，但分离效果较差，各组分间不能达到基线分离，误差较大。
微乳毛细管电泳(MEEKC)法为毛细管电泳的一种新分离模式，所采用的运行缓冲液又称微乳液，由有机相、水相、表面活性剂和共表面活性剂组成，此法已用于一些药物的分离[5，6]，迄今国内外报道仅十几篇，用于吉他霉素的分离分析作者未见文献报道。本实验采用这种新的分离模式首次对吉他霉素组分进行了分离，通过实验条件的优化，得到了较为满意的结果。
, 百拇医药
1 仪器与试药
P/ACE 5500型高效毛细管电泳仪(美国Beckman公司)，DAD检测器，GOLD软件工作站，智能酸度计，毛细管柱：57 cm×75 μm(有效长度：50 cm，河北永年光导纤维厂)。
吉他霉素样品(本省3家生产单位提供)。
正庚烷、正丁醇、异丙醇、硼酸钠、磷酸及SDS均为分析纯，甲醇为色谱纯，水为二次重蒸馏水。
2 方法
毛细管每次开机前依次用0.1 mol.L-1氢氧化钠溶液和水分别冲洗5 min，最后用运行缓冲液冲洗平衡10 min，2次测定间用运行缓冲液冲洗3 min ,以压力方式于阴极处进样10 s，检测波长214 nm。
, 百拇医药
2.1 溶液的配制
2.1.1 样品溶液 取吉他霉素适量，加50%甲醇溶液超声溶解，制成约0.5 mg.mL-1的溶液。
2.1.2 磷酸盐缓冲液( 80 mmol.L-1,pH 6.0) 称取磷酸氢二钠2.86 g,加水至100 mL ,用6 mol.L-1 磷酸调pH 至6.0 。
2.1.3 运行缓冲液( 0.08 mol.L-1正庚烷-10%异丙醇-0.01 mol.L-1硼酸钠-0.12 mol.L-1SDS) 称取硼砂0.38 g,SDS 3.27 g,加水50 mL超声溶解 ,加入正庚烷1.2 mL、异丙醇10 mL,混匀后,加水至100 mL,调pH至9.0,用0.2 μm滤膜过滤。
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3 结果与讨论
3.1 分离模式的选择 实验曾采用30 mmol.L-1胆酸钠-20%乙腈-80 mmol.L-1磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，65%乙腈-35 mmol.L-1磷酸盐缓冲液(pH 6.0)系统作为运行缓冲液，前者只分离出4个组分，且胆酸盐放置1 d后即析出，后者只出1个单峰，说明普通的CE及MEKC分离模式不能有效地分离结构极为相似的吉他霉素各组分，而采用MEEKC模式，则得到了较好分离。
3.2 微乳液pH对分离的影响 pH能改变溶质的表观电荷数，从而影响各组分在水相和微乳液油滴内相的分配。吉他霉素为弱碱性多组分化合物，各组分pKa非常接近。根据文献[7]选择运行缓冲液pH的原则，即选用pH=pKa-log 2,本实验选择pH 7.5,8.0,8.5,9.0,9.4各条件考察电迁移行为的变化及对分离的影响。实验表明，pH对各组分分离度影响较小，但随着pH增大，迁移时间略为延长，同时基线趋于平稳，以pH为9.0时，基线最平稳，故选pH 9.0作为最佳pH。
, 百拇医药
3.3 SDS浓度的影响 SDS量影响组分的容量因子，从而影响电迁移。本实验考察了柱温为30 ℃,pH为9.0条件下，SDS浓度从70 mmol.L-1到120 mmol.L-1对分离的影响。实验表明，SDS浓度较低时分离较差，区带相互重叠，当SDS浓度增至120 mmol.L-1时，各组分才达到基线分离。
3.4 硼酸钠浓度的影响 实验比较了30 ℃柱温，pH 9.0,SDS浓度为120 mmol.L-1条件下，硼酸钠浓度在0.005～0.02 mol.L-1范围内对分离的影响。结果表明，随着硼酸钠浓度的增加，分离效果有所改善，但分析时间也随之延长。兼顾分离和迁移时间2因素，选择0.01mol.L-1的硼酸钠浓度为最佳浓度。
, 百拇医药
3.5微乳液中异丙醇加入量的影响 文献[5，6]报道的微乳液采用正丁醇作共表面活性剂，但笔者应用于吉他霉素组分的分离，效果不够理想，虽经各种因素优化，仍未达到基线分离，而改为异丙醇，分离度则得到大大改善，实验考察了7.3%，10%,12.5%,15%等不同异丙醇加入量对分离的影响，以A5和A6 2组分的迁移时间对异丙醇加入量作图，见图1。结果表明，组分的分离度随异丙醇加入量增大而增大，但迁移时间却大大延长，兼顾分离度和分析时间，选10.0%异丙醇为最佳条件。
3.6 电压对分离的影响 电压在15～27 kV范围内变化时,组分迁移时间随着电压升高而减小,柱效也随之加大,当电压大于25 kV时,分离柱效开始下降,这是由于产生了焦耳热。虽然15 kV时，各组分间分离度最大，但分离时间也最长，故实验选择最优电压为25 kV。
3.7 柱温对分离的影响 柱温在20～35 ℃范围内变化时，随着温度升高，迁移时间缩短，但分离度下降，峰数目减少，系峰合并所致，优选温度为30 ℃。
, 百拇医药
图1 异丙醇加入量对迁移时间的影响
3.8 各组分的分离及峰归属的确定 在上述优选的条件下，典型图谱见图2。A8，A7，A6，A5，A4，A3的迁移时间分别为24.19，25.75，29.00，30.06，32.51，33.26 min。吉他霉素系多组分抗生素，各组分纯品不易得到，本文参照HPLC图谱的流出峰次序及各组分的极性大小[4]来确定各峰归属，即极性大的组分先出峰，这与MEEKC的分离机理相一致，见图2。
图2 吉他霉素分离色谱图
3.9 重现性 在优选的条件下，重复进样6次，以A5组分为例，迁移时间的RSD为0.7%，峰面积的RSD为1.9%。
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3.10 微乳液的稳定性 文献[6]指出，当共表面活性剂分子结构中C数目与有机相分子结构中的C数目之和等于表面活性剂分子结构中C数目时，该微乳液相当稳定，在室温下能放置数月。而本实验所采用的微乳液在放置2 d后，有分层现象，说明溶液不够稳定，其稳定性以及异丙醇在微乳液中所起的作用有待进一步研究。
3.11 不同厂家A5主组分相对百分含量比较 目前国内外生产的吉他霉素组分主要为A5组分，故本文以测定A5组分的相对百分含量来比较不同厂家的产品。实验采用上述优选的MEEKC方法和文献[2]HPLC方法进行测定，按面积百分比法计算，结果见表1。 从表1可知，MEEKC法所测A5组分的相对百分含量均比HPLC法测得值低，这是由于前法能将A5组分有效分离。不同厂家生产的样品A5组分含量不同，提示各主组分间的比例可能有所差异。
表1 吉他霉素A5组分的相对百分含量(%，n=3) 生产单位
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批号
MEKKC法
HPLC法
A
990301
37
52
B
990417
43
50
990446
42
, 百拇医药
49
990448
46
53
C
960701
36
47
4 小结
微乳毛细管电泳在吉他霉素组分分析中的成功应用，为结构相似的亲脂性化合物组分的分离提供了一种有效的方法，只要解决了吉他霉素纯组分制备问题，就有可能对各组分进行定量分析，从而评价国内、外各厂家产品的优劣，此项工作正在进行中。■
参考文献
, 百拇医药
1.朱汝锦.柱晶白霉素的生物合成、化学和生产.医药工业，1988，19(10):469
2.中华人民共和国卫生部部标准(试行).WS-177(X-121)91
3.日本抗生物质医药品基准解说.1990.618
4.王永金，王立群，闵翠娟等.柱晶白霉素的高效液相色谱分析.沈阳药学院学报，1990，7(2)：79
5.周国华，罗国安，古单良等.乙酰螺旋霉素活性成分的分析.分析化学，1998,26(2):137
6.Maria F Miola ,Martin J Snowden ,Kevin D Altria . The use of microemulsion electrokinetic chromatography in pharmaceutical analysis . J Pharm Biomed Anal,1998,18(4):785
7.Terabe S, Yashima T. Separation of oxygen isotopic benzoic acids by capillary zone electrophoresis based on isotope effects on the dissociation of the carboxyl group. Anal Chem,1988,60(17):1673
(本文于1999年9月27日收到), 百拇医药
单位：洪利娅(浙江省药品检验所 杭州 310004)；郦玲(浙江省天台药品检验所)
关键词：吉他霉素；组分；微乳毛细管电泳
药物分析杂志000412 摘要 目的：建立大环内酯类药物吉他霉素的高效毛细管电泳分离方法。方法：以微乳毛细管电泳分离模式对吉他霉素各组分的分离进行了研究；考察了电泳体系各因素对分离的影响。结果：以0.08 mol.L-1正庚烷-10%异丙醇-0.01 mol.L-1硼酸钠-0.12 mol.L-1SDS(pH 9.0)作为微乳液，在柱温30 ℃，电压25 kV，检测波长214 nm条件下分离吉他霉素，各组分得到了良好分离；重现性考察结果表明，6次测量主组分A5迁移时间的RSD为0.7%，峰面积RSD为1.9%。结论：微乳毛细管电泳在吉他霉素组分分离方面的成功应用，为结构相似的中性物质的分离提供了一种新方法,也为日后的定量测定提供了依据。
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Separation of Active Ingredients in Kitasamycin
by Microemulsion Capillary Electrophoresis
Hong Liya and Li Ling
( Zhejiang Provincial Institute for Drug Control, Hangzhou 310004)
Abstract Objective：To establish a high performance capillary electrophoresis ( HPCE ) method for the separation of active ingredients in kitasamycin. Methods:A study of the separation of active ingredients in kitasamycin by microemulsion electrokinetic chromatography ( MEEKC ) is presented. The effects of some factors in the electrophoretic conditions on the separation were investigated .Results: The satisfactory separation was achieved on optimization of electrophoretic condition: 0.08 mol.L-1 heptane-10% isopropanol - 0.01 mol.L-1 sodium tetraborate buffer - 0.12 mol.L-1 SDS (pH 9.0) as microemulsion with on - column UV monitoring at 214 nm,25 kV applied voltage, 30 ℃ column temperature. The relative standard deviations of migration time and peak area of A5 for replicate injections (n=6) were 0.7% and 1.9% ,respectively.Conclusion:The results demonstrated that MEEKC would be a promising technique for separation and determination of strongly hydrophobic neutral compounds with similar structure .
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Key words kitasamycin, ingredients, microemulsion electrokinetic chromatography▲
吉他霉素(kitasamycin)是十六元环大环内酯类抗生素，疗效优于红霉素。目前国内外生产的产品主要含A族(A1，A3～A9)组分[1]，由于国内外不同厂家所用的菌种不同，故产品的组分比例也有差异，从而影响产品的优劣和临床疗效。文献[2～4]均采用HPLC法测定组分，但分离效果较差，各组分间不能达到基线分离，误差较大。
微乳毛细管电泳(MEEKC)法为毛细管电泳的一种新分离模式，所采用的运行缓冲液又称微乳液，由有机相、水相、表面活性剂和共表面活性剂组成，此法已用于一些药物的分离[5，6]，迄今国内外报道仅十几篇，用于吉他霉素的分离分析作者未见文献报道。本实验采用这种新的分离模式首次对吉他霉素组分进行了分离，通过实验条件的优化，得到了较为满意的结果。
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1 仪器与试药
P/ACE 5500型高效毛细管电泳仪(美国Beckman公司)，DAD检测器，GOLD软件工作站，智能酸度计，毛细管柱：57 cm×75 μm(有效长度：50 cm，河北永年光导纤维厂)。
吉他霉素样品(本省3家生产单位提供)。
正庚烷、正丁醇、异丙醇、硼酸钠、磷酸及SDS均为分析纯，甲醇为色谱纯，水为二次重蒸馏水。
2 方法
毛细管每次开机前依次用0.1 mol.L-1氢氧化钠溶液和水分别冲洗5 min，最后用运行缓冲液冲洗平衡10 min，2次测定间用运行缓冲液冲洗3 min ,以压力方式于阴极处进样10 s，检测波长214 nm。
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2.1 溶液的配制
2.1.1 样品溶液 取吉他霉素适量，加50%甲醇溶液超声溶解，制成约0.5 mg.mL-1的溶液。
2.1.2 磷酸盐缓冲液( 80 mmol.L-1,pH 6.0) 称取磷酸氢二钠2.86 g,加水至100 mL ,用6 mol.L-1 磷酸调pH 至6.0 。
2.1.3 运行缓冲液( 0.08 mol.L-1正庚烷-10%异丙醇-0.01 mol.L-1硼酸钠-0.12 mol.L-1SDS) 称取硼砂0.38 g,SDS 3.27 g,加水50 mL超声溶解 ,加入正庚烷1.2 mL、异丙醇10 mL,混匀后,加水至100 mL,调pH至9.0,用0.2 μm滤膜过滤。
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3 结果与讨论
3.1 分离模式的选择 实验曾采用30 mmol.L-1胆酸钠-20%乙腈-80 mmol.L-1磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，65%乙腈-35 mmol.L-1磷酸盐缓冲液(pH 6.0)系统作为运行缓冲液，前者只分离出4个组分，且胆酸盐放置1 d后即析出，后者只出1个单峰，说明普通的CE及MEKC分离模式不能有效地分离结构极为相似的吉他霉素各组分，而采用MEEKC模式，则得到了较好分离。
3.2 微乳液pH对分离的影响 pH能改变溶质的表观电荷数，从而影响各组分在水相和微乳液油滴内相的分配。吉他霉素为弱碱性多组分化合物，各组分pKa非常接近。根据文献[7]选择运行缓冲液pH的原则，即选用pH=pKa-log 2,本实验选择pH 7.5,8.0,8.5,9.0,9.4各条件考察电迁移行为的变化及对分离的影响。实验表明，pH对各组分分离度影响较小，但随着pH增大，迁移时间略为延长，同时基线趋于平稳，以pH为9.0时，基线最平稳，故选pH 9.0作为最佳pH。
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3.3 SDS浓度的影响 SDS量影响组分的容量因子，从而影响电迁移。本实验考察了柱温为30 ℃,pH为9.0条件下，SDS浓度从70 mmol.L-1到120 mmol.L-1对分离的影响。实验表明，SDS浓度较低时分离较差，区带相互重叠，当SDS浓度增至120 mmol.L-1时，各组分才达到基线分离。
3.4 硼酸钠浓度的影响 实验比较了30 ℃柱温，pH 9.0,SDS浓度为120 mmol.L-1条件下，硼酸钠浓度在0.005～0.02 mol.L-1范围内对分离的影响。结果表明，随着硼酸钠浓度的增加，分离效果有所改善，但分析时间也随之延长。兼顾分离和迁移时间2因素，选择0.01mol.L-1的硼酸钠浓度为最佳浓度。
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3.5微乳液中异丙醇加入量的影响 文献[5，6]报道的微乳液采用正丁醇作共表面活性剂，但笔者应用于吉他霉素组分的分离，效果不够理想，虽经各种因素优化，仍未达到基线分离，而改为异丙醇，分离度则得到大大改善，实验考察了7.3%，10%,12.5%,15%等不同异丙醇加入量对分离的影响，以A5和A6 2组分的迁移时间对异丙醇加入量作图，见图1。结果表明，组分的分离度随异丙醇加入量增大而增大，但迁移时间却大大延长，兼顾分离度和分析时间，选10.0%异丙醇为最佳条件。
3.6 电压对分离的影响 电压在15～27 kV范围内变化时,组分迁移时间随着电压升高而减小,柱效也随之加大,当电压大于25 kV时,分离柱效开始下降,这是由于产生了焦耳热。虽然15 kV时，各组分间分离度最大，但分离时间也最长，故实验选择最优电压为25 kV。
3.7 柱温对分离的影响 柱温在20～35 ℃范围内变化时，随着温度升高，迁移时间缩短，但分离度下降，峰数目减少，系峰合并所致，优选温度为30 ℃。
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图1 异丙醇加入量对迁移时间的影响
3.8 各组分的分离及峰归属的确定 在上述优选的条件下，典型图谱见图2。A8，A7，A6，A5，A4，A3的迁移时间分别为24.19，25.75，29.00，30.06，32.51，33.26 min。吉他霉素系多组分抗生素，各组分纯品不易得到，本文参照HPLC图谱的流出峰次序及各组分的极性大小[4]来确定各峰归属，即极性大的组分先出峰，这与MEEKC的分离机理相一致，见图2。
图2 吉他霉素分离色谱图
3.9 重现性 在优选的条件下，重复进样6次，以A5组分为例，迁移时间的RSD为0.7%，峰面积的RSD为1.9%。
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3.10 微乳液的稳定性 文献[6]指出，当共表面活性剂分子结构中C数目与有机相分子结构中的C数目之和等于表面活性剂分子结构中C数目时，该微乳液相当稳定，在室温下能放置数月。而本实验所采用的微乳液在放置2 d后，有分层现象，说明溶液不够稳定，其稳定性以及异丙醇在微乳液中所起的作用有待进一步研究。
3.11 不同厂家A5主组分相对百分含量比较 目前国内外生产的吉他霉素组分主要为A5组分，故本文以测定A5组分的相对百分含量来比较不同厂家的产品。实验采用上述优选的MEEKC方法和文献[2]HPLC方法进行测定，按面积百分比法计算，结果见表1。 从表1可知，MEEKC法所测A5组分的相对百分含量均比HPLC法测得值低，这是由于前法能将A5组分有效分离。不同厂家生产的样品A5组分含量不同，提示各主组分间的比例可能有所差异。
表1 吉他霉素A5组分的相对百分含量(%，n=3) 生产单位
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批号
MEKKC法
HPLC法
A
990301
37
52
B
990417
43
50
990446
42
, 百拇医药
49
990448
46
53
C
960701
36
47
4 小结
微乳毛细管电泳在吉他霉素组分分析中的成功应用，为结构相似的亲脂性化合物组分的分离提供了一种有效的方法，只要解决了吉他霉素纯组分制备问题，就有可能对各组分进行定量分析，从而评价国内、外各厂家产品的优劣，此项工作正在进行中。■
参考文献
, 百拇医药
1.朱汝锦.柱晶白霉素的生物合成、化学和生产.医药工业，1988，19(10):469
2.中华人民共和国卫生部部标准(试行).WS-177(X-121)91
3.日本抗生物质医药品基准解说.1990.618
4.王永金，王立群，闵翠娟等.柱晶白霉素的高效液相色谱分析.沈阳药学院学报，1990，7(2)：79
5.周国华，罗国安，古单良等.乙酰螺旋霉素活性成分的分析.分析化学，1998,26(2):137
6.Maria F Miola ,Martin J Snowden ,Kevin D Altria . The use of microemulsion electrokinetic chromatography in pharmaceutical analysis . J Pharm Biomed Anal,1998,18(4):785
7.Terabe S, Yashima T. Separation of oxygen isotopic benzoic acids by capillary zone electrophoresis based on isotope effects on the dissociation of the carboxyl group. Anal Chem,1988,60(17):1673
(本文于1999年9月27日收到), 百拇医药