溶栓Ⅰ号抗血栓作用的研究
作者：马恩龙 曹颖林 李莉 孟宪志 单凤平
单位：马恩龙(沈阳药科大学1997级药理研究生)；曹颖林(沈阳药科大学药学系，沈阳 110015)；李莉 孟宪志 单凤平(辽宁省微生物研究所，沈阳 110015)
关键词：溶栓Ⅰ号；血栓；纤维蛋白平板
沈阳药科大学学报000417 摘 要 采用体外溶栓法、纤维蛋白平板法及家兔颈动脉血栓形成法，观察溶栓Ⅰ号的溶栓作用.结果表明：溶栓Ⅰ号可以溶解体外血栓；对正常及加热纤维蛋白平板均有溶解作用；抑制血栓形成并溶解已形成的血栓.
分类号 R96
A Study on the Antithrombolic Effect of Fibrinolytic No.Ⅰ
, 百拇医药
Ma Enlong，Cao Yinglin，Li Li，Meng Xianzhi，Shan Fengping
(Department of Pharmacy，Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract The antithrombolic effect of Fibrinolytic No.Ⅰwas studied in this experiment by means of thrombus in vitro,fibrin plate and thrombus produced in common carotid artery in vitro. The result showed that Fibrinolytic No.Ⅰcould not only dissolve the thrombus in vitro and normal or heated fibrin plate but also inhibit thrombosis and even dissolve the thrombus in vitro.
, 百拇医药
Key words Fibrinolytic No.Ⅰ;thrombus; fibrin plate
溶栓Ⅰ号是从参环毛蚓(Pheretima aspergillum)中提取的一组酸性蛋白酶，并经进一步纯化.体内外试验结果均表明蚯蚓提取物具有抗血栓形成和溶解血栓作用〔1～3〕.本文研究了溶栓Ⅰ号对体外血栓、纤维蛋白平板及家兔颈动脉血栓的影响.
1 材料与试药
动物 新西兰种大白兔，体重1.9～2.5 kg，雌雄兼用，沈阳药科大学动物室提供，合格证号：辽实动字033号.
试药 溶栓Ⅰ号：200U/支，含蛋白60 μg/支，辽宁省微生物研究所提供，980916，给药前用生理盐水配成所需浓度溶液；尿激酶(UK)：10万u/支，南京大学制药厂，9807286，给药前用生理盐水配成所需浓度溶液；纤维蛋白原：上海莱士血制品有限公司，980224，给药前用pH7.4的磷酸缓冲液配成所需浓度溶液；凝血酶：深圳蛇口海王生物工程有限公司长春公司，980609，给药前用pH7.4的磷酸缓冲液配成所需浓度.
, http://www.100md.com
2 实验方法
2.1 溶栓Ⅰ号对体外血栓的溶解作用〔4〕
家兔耳缘静脉采血，3.8%枸椽酸钠按1∶9比例加入抗凝，顺序加入纤维蛋白原、CaCl2(0.5 mol/L)和凝血酶(100 u/mL)，体积比为1 mL血中加入20 μL纤维蛋白原溶液、10 μL CaCl2、20 μL凝血酶.快速混匀后用一次性塑料注射器将血液快速注入内径3 mm的聚乙烯管中，放入37℃水浴20 min后，将血栓取出，切成1.5 cm小段，分别称重后置入含有溶栓Ⅰ号高剂量(6 μg/mL)，中剂量(3 μg/mL)，低剂量(1.5 μg/mL)，尿激酶(600 u/mL)，生理盐水各2 mL的试管中，放入37℃水浴中，4 h后将剩余血栓条取出分别称重，计算溶栓百分率.各浓度药物均重复10次.溶栓百分率=[(血栓初重-药物作用4 h后血栓重)/血栓初重]×100%.
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2.2 溶栓Ⅰ号对纤维蛋白平板的溶解作用〔5〕
2.2.1 纤维蛋白平板的制备
在平皿内加9 mL 0.5%纤维蛋白原溶液，再加入20 u/mL的凝血酶溶液1 mL，立即打旋混匀大约10 s，即形成1 mm厚的纤维蛋白凝块，在平皿上盖加滤纸，在水平处放置30 min后即可使用.
2.2.2 加热纤维蛋白平板的制备
取上述已做好的平板，置于85℃烘箱内30 min，冷却后即可使用.
2.2.3测定方法
将溶栓Ⅰ号高剂量(6 μg/mL)，中剂量(3 μg/mL)，低剂量(1.5 μg/mL)，尿激酶(600 u/mL)，生理盐水各20 μL滴到纤维蛋白平板上，各点间距大于1.5 cm，置纤维蛋白平板与于湿盒内，放入37℃烘箱中，4 h后观察有无溶解圈，并用卡尺测量溶解圈的直径，计算溶解圈面积，以溶解圈面积大小衡量纤溶活性的大小，各浓度药物均重复10次.
, http://www.100md.com
溶解圈面积(mm2)=[(长径+短径)/4]2×π.
2.3 溶栓Ⅰ号对家兔颈动脉血栓的影响〔6〕
家兔随机分为6组，每组8只，用20%乌拉坦5 ml/kg耳缘静脉注射麻醉，背位固定，分离一侧颈总动脉，在相距约4 cm处将两端用动脉夹夹住血管，取12号细缝衣针，连一根一端打结的细线，自近心端穿入颈总动脉，顺血管走行3 cm，从远心端穿出，将另一端也打结后剪断丝线.然后缓慢松开动脉夹，恢复血流.2 h后将血栓对照组家兔的该段颈动脉切下，将其中的细线取出，置滤纸上吸去余血，迅速称重，减去同样长度细线的重量，即得形成血栓的湿重，其余各组家兔分别按2 mL/kg体重耳缘静脉注射溶栓Ⅰ号高、中、低剂量、尿激酶和生理盐水，给药后4 h按上述方法称量所形成血栓的湿重.
2.4 统计方法
, 百拇医药
实验数据用(
±s)表示，组间资料统计采用组间t-检验.
3 实验结果
3.1 溶栓Ⅰ号对体外血栓的溶解作用
由表1可见：溶栓Ⅰ号后对体外血栓有明显的溶解作用，并有明显量效关系.
3.2 溶栓Ⅰ号对纤维蛋白平板溶解面积的影响
由表2、3可见：溶栓Ⅰ号对未加热纤维蛋白平板有明显溶解作用；对加热平板也有明显溶解作用，与尿激酶组相比作用明显增强.量效关系明显.
Tab.1 The effect of fibrinolytic No.Ⅰ on thrombus in vitro(±s)，n=10 Group
, 百拇医药
Dose
Thrombolytic rate(%)
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(6 μg/mL)
79.3±5.6#
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(3 μg/mL)
73.7±9.2#
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(1.5 μg/mL)
, http://www.100md.com
60.1±7.8#
UK
2 mL(600 u/mL)
79.5±6.5#
NS
2 mL
14.5±5.9
#P<0.001 Compared with NS groupTab.2 The effect of fibrinolytic No.Ⅰon unheated fibrin plate(±s)，n=10 Group
, 百拇医药
Dose
Dissolved space(mm2)
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(6 μg/mL)
164.4±7.1#*
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(3 μg/mL)
133.2±6.7#*
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(1.5 μg/mL)
, 百拇医药
93.5±5.3#
UK
2 mL(600 u/mL)
115.4±5.4#
NS
2 mL
0
#P<0.001 Compared with NS group，*P<0.001 Compared with UK groupTab.3 The effect of fibrinolytic No.Ⅰon heated fibrin plate(±s)，n=10 Group
, 百拇医药
Dose
Dissolved space(mm2)
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(6 μg/mL)
101.2±6.1#*
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(3 μg/mL)
84.2±4.5#*
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(1.5 μg/mL)
, http://www.100md.com
63.0±3.1#*
UK
2 mL(600 u/mL)
46.1±3.8#
NS
2 mL
0
#P<0.001 Compared with NS group，*P<0.001 Compared with UK group
3.3 溶栓Ⅰ号对家兔颈动脉血栓形成的影响
从表4可见：应用溶栓Ⅰ号后，与生理盐水组相比，血栓重量明显减轻，且有明显的量效关系；与尿激酶组相比作用明显增强.Tab.4 The effect of fibrinolytic No.Ⅰon thrombus in common carotid artery(±s)，n=10 Group
, http://www.100md.com
Dose
Wet weight of thrombus(4h after injecting)
Thrombus control(2h after surgery)
——
10.59±0.43
Fibrinolytic No Ⅰ
0.2 mg/kg
10.45±3.65##**
Fibrinolytic No Ⅰ
0.1 mg/kg
, http://www.100md.com
12.55±2.77##*
Fibrinolytic No Ⅰ
0.05 mg/kg
15.48±3.17#
UK
2万u/kg
16.63±3.00#
NS
——
21.76±5.63
##P<0.01 Compared with NS group，#P<0.05 Compared with NS group； **P<0.01 Compared with UK group，*P<0.05 Compared with UK group
, http://www.100md.com
4 讨论
血栓形成是许多疾病如：心肌梗死，缺血性卒中，深静脉血栓等的基本病理过程，它严重危害着人类的健康.目前，治疗血栓疾病的药物如尿激酶、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、单链尿激酶等药物存在着出血，溶栓后再闭塞等缺点，并且价格昂贵，因此，开发一种新型的溶栓药就显得十分重要.本实验采用体外和体内溶栓实验，证明溶栓Ⅰ号具有良好的溶栓作用.纤维蛋白平板实验表明溶栓Ⅰ号有溶血栓作用，作用机理可能与激活纤溶酶原及有关.直接溶解纤维蛋白.体内实验采用家兔颈动脉血栓形成的方法观察溶栓Ⅰ号对实验性血栓的溶解作用.结果表明：给药组血栓湿重明显减轻，且高剂量组血栓湿重较血栓对照组血栓湿重有略微降低，这表明溶栓Ⅰ号可抑制血栓形成，还可以溶解已形成的血栓.此外，体内实验结果表明：溶栓Ⅰ号对血小板血栓作用明显强于尿激酶，因而有可能减少再闭塞的发生.本品来源广泛、价格相对较低，因而具有较大的开发价值，对本品进一步的研究有待开展.
国家重点科技项目(攻关)计划，No.96160；
, http://www.100md.com
参考文献
1，Tuckova L.Lytic activation coelomic fluid of Eisenia and Lumbricus terrestris. Dev Comp Immunol，1986，10：181～189
2，路华英,金汝成.蚯蚓纤溶酶的提取性质鉴定和溶解血栓的研究.兰州大学学报，1986，(1)：95～98
3，Park S.Fibrinolytic activiy of eathworm extract.Thromb Haemost，1989，62：545～561
4，刘秀文，汤仲明，梁心平，等.重组链激酶对兔实验性肺栓塞的溶栓作用.药学学报，1998，33(11)：801～806
5，陈奇.中药药理研究方法学.北京：卫生出版社，1994.617～618
6，王晴川，许云绿，刘广芬.一种简易的家兔颈动脉血栓模型形成方法和蕲蛇酶的溶栓作用.中国药理学通报，1993，9(3)：228～230
收稿日期:1999-11-02
, http://www.100md.com
单位：马恩龙(沈阳药科大学1997级药理研究生)；曹颖林(沈阳药科大学药学系，沈阳 110015)；李莉 孟宪志 单凤平(辽宁省微生物研究所，沈阳 110015)
关键词：溶栓Ⅰ号；血栓；纤维蛋白平板
沈阳药科大学学报000417 摘 要 采用体外溶栓法、纤维蛋白平板法及家兔颈动脉血栓形成法，观察溶栓Ⅰ号的溶栓作用.结果表明：溶栓Ⅰ号可以溶解体外血栓；对正常及加热纤维蛋白平板均有溶解作用；抑制血栓形成并溶解已形成的血栓.
分类号 R96
A Study on the Antithrombolic Effect of Fibrinolytic No.Ⅰ
, 百拇医药
Ma Enlong，Cao Yinglin，Li Li，Meng Xianzhi，Shan Fengping
(Department of Pharmacy，Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract The antithrombolic effect of Fibrinolytic No.Ⅰwas studied in this experiment by means of thrombus in vitro,fibrin plate and thrombus produced in common carotid artery in vitro. The result showed that Fibrinolytic No.Ⅰcould not only dissolve the thrombus in vitro and normal or heated fibrin plate but also inhibit thrombosis and even dissolve the thrombus in vitro.
, 百拇医药
Key words Fibrinolytic No.Ⅰ;thrombus; fibrin plate
溶栓Ⅰ号是从参环毛蚓(Pheretima aspergillum)中提取的一组酸性蛋白酶，并经进一步纯化.体内外试验结果均表明蚯蚓提取物具有抗血栓形成和溶解血栓作用〔1～3〕.本文研究了溶栓Ⅰ号对体外血栓、纤维蛋白平板及家兔颈动脉血栓的影响.
1 材料与试药
动物 新西兰种大白兔，体重1.9～2.5 kg，雌雄兼用，沈阳药科大学动物室提供，合格证号：辽实动字033号.
试药 溶栓Ⅰ号：200U/支，含蛋白60 μg/支，辽宁省微生物研究所提供，980916，给药前用生理盐水配成所需浓度溶液；尿激酶(UK)：10万u/支，南京大学制药厂，9807286，给药前用生理盐水配成所需浓度溶液；纤维蛋白原：上海莱士血制品有限公司，980224，给药前用pH7.4的磷酸缓冲液配成所需浓度溶液；凝血酶：深圳蛇口海王生物工程有限公司长春公司，980609，给药前用pH7.4的磷酸缓冲液配成所需浓度.
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2 实验方法
2.1 溶栓Ⅰ号对体外血栓的溶解作用〔4〕
家兔耳缘静脉采血，3.8%枸椽酸钠按1∶9比例加入抗凝，顺序加入纤维蛋白原、CaCl2(0.5 mol/L)和凝血酶(100 u/mL)，体积比为1 mL血中加入20 μL纤维蛋白原溶液、10 μL CaCl2、20 μL凝血酶.快速混匀后用一次性塑料注射器将血液快速注入内径3 mm的聚乙烯管中，放入37℃水浴20 min后，将血栓取出，切成1.5 cm小段，分别称重后置入含有溶栓Ⅰ号高剂量(6 μg/mL)，中剂量(3 μg/mL)，低剂量(1.5 μg/mL)，尿激酶(600 u/mL)，生理盐水各2 mL的试管中，放入37℃水浴中，4 h后将剩余血栓条取出分别称重，计算溶栓百分率.各浓度药物均重复10次.溶栓百分率=[(血栓初重-药物作用4 h后血栓重)/血栓初重]×100%.
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2.2 溶栓Ⅰ号对纤维蛋白平板的溶解作用〔5〕
2.2.1 纤维蛋白平板的制备
在平皿内加9 mL 0.5%纤维蛋白原溶液，再加入20 u/mL的凝血酶溶液1 mL，立即打旋混匀大约10 s，即形成1 mm厚的纤维蛋白凝块，在平皿上盖加滤纸，在水平处放置30 min后即可使用.
2.2.2 加热纤维蛋白平板的制备
取上述已做好的平板，置于85℃烘箱内30 min，冷却后即可使用.
2.2.3测定方法
将溶栓Ⅰ号高剂量(6 μg/mL)，中剂量(3 μg/mL)，低剂量(1.5 μg/mL)，尿激酶(600 u/mL)，生理盐水各20 μL滴到纤维蛋白平板上，各点间距大于1.5 cm，置纤维蛋白平板与于湿盒内，放入37℃烘箱中，4 h后观察有无溶解圈，并用卡尺测量溶解圈的直径，计算溶解圈面积，以溶解圈面积大小衡量纤溶活性的大小，各浓度药物均重复10次.
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溶解圈面积(mm2)=[(长径+短径)/4]2×π.
2.3 溶栓Ⅰ号对家兔颈动脉血栓的影响〔6〕
家兔随机分为6组，每组8只，用20%乌拉坦5 ml/kg耳缘静脉注射麻醉，背位固定，分离一侧颈总动脉，在相距约4 cm处将两端用动脉夹夹住血管，取12号细缝衣针，连一根一端打结的细线，自近心端穿入颈总动脉，顺血管走行3 cm，从远心端穿出，将另一端也打结后剪断丝线.然后缓慢松开动脉夹，恢复血流.2 h后将血栓对照组家兔的该段颈动脉切下，将其中的细线取出，置滤纸上吸去余血，迅速称重，减去同样长度细线的重量，即得形成血栓的湿重，其余各组家兔分别按2 mL/kg体重耳缘静脉注射溶栓Ⅰ号高、中、低剂量、尿激酶和生理盐水，给药后4 h按上述方法称量所形成血栓的湿重.
2.4 统计方法
, 百拇医药
实验数据用(
±s)表示，组间资料统计采用组间t-检验.3 实验结果
3.1 溶栓Ⅰ号对体外血栓的溶解作用
由表1可见：溶栓Ⅰ号后对体外血栓有明显的溶解作用，并有明显量效关系.
3.2 溶栓Ⅰ号对纤维蛋白平板溶解面积的影响
由表2、3可见：溶栓Ⅰ号对未加热纤维蛋白平板有明显溶解作用；对加热平板也有明显溶解作用，与尿激酶组相比作用明显增强.量效关系明显.
Tab.1 The effect of fibrinolytic No.Ⅰ on thrombus in vitro(
±s)，n=10 Group, 百拇医药
Dose
Thrombolytic rate(%)
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(6 μg/mL)
79.3±5.6#
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(3 μg/mL)
73.7±9.2#
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(1.5 μg/mL)
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60.1±7.8#
UK
2 mL(600 u/mL)
79.5±6.5#
NS
2 mL
14.5±5.9
#P<0.001 Compared with NS groupTab.2 The effect of fibrinolytic No.Ⅰon unheated fibrin plate(
±s)，n=10 Group, 百拇医药
Dose
Dissolved space(mm2)
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(6 μg/mL)
164.4±7.1#*
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(3 μg/mL)
133.2±6.7#*
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(1.5 μg/mL)
, 百拇医药
93.5±5.3#
UK
2 mL(600 u/mL)
115.4±5.4#
NS
2 mL
0
#P<0.001 Compared with NS group，*P<0.001 Compared with UK groupTab.3 The effect of fibrinolytic No.Ⅰon heated fibrin plate(
±s)，n=10 Group, 百拇医药
Dose
Dissolved space(mm2)
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(6 μg/mL)
101.2±6.1#*
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(3 μg/mL)
84.2±4.5#*
Fibrinolytic No Ⅰ
2 mL(1.5 μg/mL)
, http://www.100md.com
63.0±3.1#*
UK
2 mL(600 u/mL)
46.1±3.8#
NS
2 mL
0
#P<0.001 Compared with NS group，*P<0.001 Compared with UK group
3.3 溶栓Ⅰ号对家兔颈动脉血栓形成的影响
从表4可见：应用溶栓Ⅰ号后，与生理盐水组相比，血栓重量明显减轻，且有明显的量效关系；与尿激酶组相比作用明显增强.Tab.4 The effect of fibrinolytic No.Ⅰon thrombus in common carotid artery(
±s)，n=10 Group, http://www.100md.com
Dose
Wet weight of thrombus(4h after injecting)
Thrombus control(2h after surgery)
——
10.59±0.43
Fibrinolytic No Ⅰ
0.2 mg/kg
10.45±3.65##**
Fibrinolytic No Ⅰ
0.1 mg/kg
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12.55±2.77##*
Fibrinolytic No Ⅰ
0.05 mg/kg
15.48±3.17#
UK
2万u/kg
16.63±3.00#
NS
——
21.76±5.63
##P<0.01 Compared with NS group，#P<0.05 Compared with NS group； **P<0.01 Compared with UK group，*P<0.05 Compared with UK group
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4 讨论
血栓形成是许多疾病如：心肌梗死，缺血性卒中，深静脉血栓等的基本病理过程，它严重危害着人类的健康.目前，治疗血栓疾病的药物如尿激酶、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、单链尿激酶等药物存在着出血，溶栓后再闭塞等缺点，并且价格昂贵，因此，开发一种新型的溶栓药就显得十分重要.本实验采用体外和体内溶栓实验，证明溶栓Ⅰ号具有良好的溶栓作用.纤维蛋白平板实验表明溶栓Ⅰ号有溶血栓作用，作用机理可能与激活纤溶酶原及有关.直接溶解纤维蛋白.体内实验采用家兔颈动脉血栓形成的方法观察溶栓Ⅰ号对实验性血栓的溶解作用.结果表明：给药组血栓湿重明显减轻，且高剂量组血栓湿重较血栓对照组血栓湿重有略微降低，这表明溶栓Ⅰ号可抑制血栓形成，还可以溶解已形成的血栓.此外，体内实验结果表明：溶栓Ⅰ号对血小板血栓作用明显强于尿激酶，因而有可能减少再闭塞的发生.本品来源广泛、价格相对较低，因而具有较大的开发价值，对本品进一步的研究有待开展.
国家重点科技项目(攻关)计划，No.96160；
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参考文献
1，Tuckova L.Lytic activation coelomic fluid of Eisenia and Lumbricus terrestris. Dev Comp Immunol，1986，10：181～189
2，路华英,金汝成.蚯蚓纤溶酶的提取性质鉴定和溶解血栓的研究.兰州大学学报，1986，(1)：95～98
3，Park S.Fibrinolytic activiy of eathworm extract.Thromb Haemost，1989，62：545～561
4，刘秀文，汤仲明，梁心平，等.重组链激酶对兔实验性肺栓塞的溶栓作用.药学学报，1998，33(11)：801～806
5，陈奇.中药药理研究方法学.北京：卫生出版社，1994.617～618
6，王晴川，许云绿，刘广芬.一种简易的家兔颈动脉血栓模型形成方法和蕲蛇酶的溶栓作用.中国药理学通报，1993，9(3)：228～230
收稿日期:1999-11-02
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