彗星试验体外活化条件研究
作者：王涛 衡正昌 张遵真
单位：华西医科大学环境卫生教研室，成都 610041
关键词：
卫生毒理学杂志000428 本课题受国家自然科学基金资助(19670625) 间接致突变物需经代谢活化才具有致突变作用。Ames试验中，活化有混合法和预孵法两种方式[1]。彗星试验有采用混合法活化[2，3]，预孵法未见报道。本试验以两种已知间接致突变物苯并(a)芘和2-氨基芴为受试物，将两种活化方式的彗星试验结果进行对比研究，并对活化暴露时间与适用的S9浓度进行探讨。
1 材料与方法
1.1 受试物 2-氨基芴(2-AF)，Fluka公司生产，纯度>97%；苯并(a)芘(B(a)P)，Sigma公司生产，纯度>97%。
, 百拇医药
1.2 细胞培养与暴露 V79细胞以DMEM为基本培养基，加体积分数为10%的小牛血清、100 IU青霉素和100?μg链霉素/100 ml 成为完全培养液，按常规传代培养。当细胞进入对数生长期并达到所需密度时，收获细胞，用无血清培养液将细胞浓度调整为2×105/ml，分装于5 ml 的离心管中，管中加入受试物，暴露一定时间后，离心，收集细胞进行彗星试验。
1.3 体外活化系统 大鼠肝S9由本室制备，经Aroclor-1254诱导。S9-mix液根据Ames等[4]的方法配制。
1.4 活化条件
1.4.1 活化方式 暴露时间为2 h,S9-mix 10%。预孵法指受试物与S9-mix在37 ℃孵箱中作用0.5 h，再对细胞染毒；混合法指受试物、S9-mix、细胞悬液混合在一起，在37 ℃孵箱中作用和染毒。
, 百拇医药
1.4.2 暴露时间 S9-mix浓度为10%。设1.0、1.5、2.0、3.0 h 4个时间，比较不同暴露时间的彗星试验结果。
1.4.3 S9-mix浓度 暴露时间为1.5 h。设2%、5%、10%3个浓度，比较不同浓度S9-mix的彗星试验结果。
1.5 彗星试验 按本室常规方法操作[5]。
1.6 观察指标 以拖尾细胞率和拖尾细胞尾长为观察指标。每张片计数200个细胞，记录拖尾细胞数，用目镜测微尺测量拖尾细胞的总长与头长。拖尾细胞率=拖尾细胞数/200×100%。拖尾细胞尾长=总长-头长。
1.7 统计学检验 用χ2检验和t检验。
2 结果
, 百拇医药
两种方式活化B(a)P与2-AF的彗星试验结果见表1。不加S9的彗星试验，各实验浓度组与阴性对照比较，差异无显著性(P>0.05)，均为阴性结果(除B(a)P最高浓度1.0 μg/ml外)。两种方式活化的B(a)P与2-AF，其拖尾细胞率和拖尾细胞尾长均随着浓度的增加而增加，与阴性对照比较，差异有显著性(P<0.01)。预孵法和混合法两种活化方式比较，在阴性对照组，拖尾细胞率和拖尾细胞尾长差异均无显著性；B(a)P 0.5～1.0 μg/ml和2-AF 10～50 μg/ml浓度组，预孵法的拖尾细胞尾长大于混合法(P<0.01)；2-AF剂量为10 μg/ml时，预孵法拖尾细胞率高于混合法(P<0.01)。
表1 两种活化方式的彗星试验结果 受试物
浓度
(μg/ml)
拖尾细胞率(%)
, http://www.100md.com
拖尾细胞尾长(μm,
±s)
-S9
混合
预孵
-S9
混合
预孵
阴性对照
0
3
5
6
, 百拇医药
9.6±1.5
10.8±2.4
11.2± 2.1
B(a)P
0.05
3
5
8
10.5±2.0
10.2±1.8
12.3± 3.2
0.1
5
, 百拇医药
50
50
11.5±2.2
11.2±2.8
17.6± 3.6
0.5
5
90
90
11.8±2.3
29.3±3.8
66.3± 5.5*
, 百拇医药
1.0
90
100
100
21.5±3.2
142.4±8.3
163.8±10.7*
2-AF
5.0
2
3
5
8.6±1.6
, 百拇医药
10.2±2.2
11.2± 2.5
10.0
3
50
80*
10.6±2.0
12.9±3.2
13.6± 2.3
20.0
5
90
, 百拇医药 95
12.0±2.5
18.6±5.0
30.5± 2.5*
50.0
5
100
100
13.6±2.6
100.8±8.6
120.9± 5.5*
暴露时间为2 h；与阴性对照组比，*P<0.01 不同暴露时间的彗星试验结果显示随暴露时间延长，拖尾细胞率逐渐增加。受试物最低浓度仅3.0 h时间点检出DNA损伤效应。由表2可见：拖尾细胞尾长随时间延长而增加，同剂量组1.5 h与1.0 h、3.0 h与2.0 h比较，差异有显著性(P<0.01)，2.0 h与1.5 h比较，拖尾细胞尾长差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
不同S9浓度的彗星试验结果见表3、4。由表可见：随着S9浓度增加，拖尾细胞率及拖尾细胞尾长均明显增加，S9浓度体积分数为10%时活化效果最佳。表2 预孵法不同暴露时间的拖尾细胞尾长 受试物
浓度
(μg/ml)
拖尾细胞尾长(μm,±s)
1.0 h
1.5 h
2.0 h
3.0 h
B(a)P
, http://www.100md.com
0.05
10.5±4.2
10.6±3.6
12.3± 3.2
13.2± 3.5
0.1
12.5±3.4
20.6±3.4*
31.0± 4.3
61.3± 4.9*
0.5
32.8±2.9
, http://www.100md.com
76.5±4.5*
86.4± 5.8
113.2± 9.6*
1.0
58.5±5.6
165.0±8.6*
176.2±13.2
182.0±15.3
2-AF
5.0
0
, 百拇医药
11.4±5.8
11.3± 2.5
11.6± 2.6*
10.0
7.5±2.2
12.8±3.3*
13.6± 4.2
15.2± 3.2
20.0
15.6±3.4
35.5±2.4*
, 百拇医药
40.5± 4.5
68.4± 3.5*
50.0
61.4±5.6
130.0±9.5*
140.2± 8.6
162.9± 18.6*
阴性对照
0
0
9.6±2.8
, 百拇医药
1.2±2.1
12.9±5.6
同剂量组1.5 h与1.0 h，3.0 h与2.0 h比较，*P<0.01表3 预孵法不同浓度S9对拖尾细胞率的影响(%) 受试物
浓度
(μg/ml)
不同浓度S9的拖尾细胞率
0%
2%
5%
10%
B(a)P
, 百拇医药
0.05
3
3
3
5
0.1
3
5
30*
50*
0.5
5
30*
, 百拇医药
50*
90*
1.0
90
90
100*
100
2-AF
5.0
0
2
2
2
, http://www.100md.com
10.0
0
3
5
80*
20.0
2
5
60*
95
50.0
5
5
, http://www.100md.com
80*
100*
阴性对照
0
0
3
3
3
暴露时间为1.5 h；与同剂量组较低S9浓度的实验结果比较，*P<0.01表4 预孵法不同浓度S9对拖尾细胞尾长的影响(±s) 受试物
浓度
, 百拇医药
(μg/ml)
不同浓度S9的拖尾细胞尾长(μm)
0%
2%
5%
10%
B(a)P
0.05
6.2±2.9
4.8±3.5
7.8±4.3
9.8± 3.8
, http://www.100md.com 0.1
7.9±3.5
8.0±4.0
15.6±2.9*
22.6± 2.4*
0.5
8.5±4.2
11.8±2.6*
36.8±5.8*
78.5± 6.5*
1.0
, 百拇医药
10.0±5.6
25.6±3.5*
86.5±6.6*
168.0± 7.6*
2-AF
5.0
0.0
4.0±2.5
5.8±3.6
9.5± 5.2
10.0
, 百拇医药 0.0
5.2±1.8
6.2±4.5
13.5± 3.2*
20.0
4.8±4.2
6.5±2.8
10.8±2.2
38.5± 4.2*
50.0
6.8±3.5
7.6±4.2
, 百拇医药
28.4±3.4
135.0±11.6*
阴性对照
0
0.0
3.9±2.3
5.0±2.5
9.6±5.2
暴露时间为1.5 h；与同剂量组较低S9浓度的实验结果比较，*P<0.01
3 讨论
试验结果表明：彗星试验中，预孵法和混合法两种方式均能有效活化间接致突变物，预孵法活化效果优于混合法。随暴露时间延长和S9浓度增加，DNA损伤效应增强。本文推荐彗星试验的体外活化试验条件为：化学物以体积分数为10%的S9-mix预孵活化0.5 h，细胞暴露1.5 h。
, http://www.100md.com
Ames试验常规应用混合法活化间接致突变物，但多数学者认为：某些类型化学物用预孵法检测更为有效[1]。本试验结果表明：彗星试验中，预孵法活化效果优于混合法。其原因可能是：在预孵法中，由于预孵时细胞悬液未加入，活化反应在较小的体积中进行，反应液中S9浓度相对较高，增加了活化反应的速度。
Myhr和Mayo[6]在小鼠淋巴瘤细胞L5178Y基因突变试验中发现：暴露时间延长至8 h，或加S9预培养18 h后暴露4 h，可引起突变频率明显增加。而McGregor[7]报道，在L5178Y细胞基因突变试验中，随着S9浓度的增加，突变频数增加。本试验所涉及的暴露时间与S9浓度未检出S9的细胞毒性与遗传毒性。
参考文献
[1] Gatehouse DS,Haworth T.Cebula,et al. Recommendations for the performance of bacterial mutation assays. Mutat Res,1994，312:217-233
, http://www.100md.com
[2] TafaZoli M,Kirsch-Volders M. In vitro mutagenicity and genotoxicity study of 1,2-dichloroethylene, 1,1,1-trichloroethane,1,3-dichloropropane,1,2,3-trichloropropane and 1,1,3-trichloropropene,using the micronucleus test and the alkaline single cell gel electrophoresis technique (comet assay) in human lymphocytes. Mutat Res,1996，371:185-202.
[3] Robas G,Frenzilli G,Barale R， et al. Herbicide-induced DNA damage in human lymphocytes evaluated by the single-cell gel electrophoresis (SCGE) assay. Mutat Res,1995，344:41-54.
, http://www.100md.com
[4] 张遵真，衡正昌. 用单细胞凝胶电泳技术检测铬和砷化物的DNA损伤作用. 中华预防医学杂志，1997，31：365-367.
[5] Ames Bruce N,McCann Joyce,Yamasaki Edith.Methods for detecting carcinogens and mutagens with the salmonella mammalian-microsome mutagenicity test. Mutat Res,1975，31:63-347.
[6] Myhr B C, Mayo JK. Mutagenicity of rat-liver S9 to L5178Y mouse lymphoma cells. Mutat Res,1987，189:27-38.
[7] David S,Sheila MG, Richard RM, et al.(International commission for protection against environmental mutagens and carcinogens.)Genotoxicity under extreme culture conditions. Mutat Res, 1991，257:194-195.
(收稿日期：1999-07-26), http://www.100md.com
单位：华西医科大学环境卫生教研室，成都 610041
关键词：
卫生毒理学杂志000428 本课题受国家自然科学基金资助(19670625) 间接致突变物需经代谢活化才具有致突变作用。Ames试验中，活化有混合法和预孵法两种方式[1]。彗星试验有采用混合法活化[2，3]，预孵法未见报道。本试验以两种已知间接致突变物苯并(a)芘和2-氨基芴为受试物，将两种活化方式的彗星试验结果进行对比研究，并对活化暴露时间与适用的S9浓度进行探讨。
1 材料与方法
1.1 受试物 2-氨基芴(2-AF)，Fluka公司生产，纯度>97%；苯并(a)芘(B(a)P)，Sigma公司生产，纯度>97%。
, 百拇医药
1.2 细胞培养与暴露 V79细胞以DMEM为基本培养基，加体积分数为10%的小牛血清、100 IU青霉素和100?μg链霉素/100 ml 成为完全培养液，按常规传代培养。当细胞进入对数生长期并达到所需密度时，收获细胞，用无血清培养液将细胞浓度调整为2×105/ml，分装于5 ml 的离心管中，管中加入受试物，暴露一定时间后，离心，收集细胞进行彗星试验。
1.3 体外活化系统 大鼠肝S9由本室制备，经Aroclor-1254诱导。S9-mix液根据Ames等[4]的方法配制。
1.4 活化条件
1.4.1 活化方式 暴露时间为2 h,S9-mix 10%。预孵法指受试物与S9-mix在37 ℃孵箱中作用0.5 h，再对细胞染毒；混合法指受试物、S9-mix、细胞悬液混合在一起，在37 ℃孵箱中作用和染毒。
, 百拇医药
1.4.2 暴露时间 S9-mix浓度为10%。设1.0、1.5、2.0、3.0 h 4个时间，比较不同暴露时间的彗星试验结果。
1.4.3 S9-mix浓度 暴露时间为1.5 h。设2%、5%、10%3个浓度，比较不同浓度S9-mix的彗星试验结果。
1.5 彗星试验 按本室常规方法操作[5]。
1.6 观察指标 以拖尾细胞率和拖尾细胞尾长为观察指标。每张片计数200个细胞，记录拖尾细胞数，用目镜测微尺测量拖尾细胞的总长与头长。拖尾细胞率=拖尾细胞数/200×100%。拖尾细胞尾长=总长-头长。
1.7 统计学检验 用χ2检验和t检验。
2 结果
, 百拇医药
两种方式活化B(a)P与2-AF的彗星试验结果见表1。不加S9的彗星试验，各实验浓度组与阴性对照比较，差异无显著性(P>0.05)，均为阴性结果(除B(a)P最高浓度1.0 μg/ml外)。两种方式活化的B(a)P与2-AF，其拖尾细胞率和拖尾细胞尾长均随着浓度的增加而增加，与阴性对照比较，差异有显著性(P<0.01)。预孵法和混合法两种活化方式比较，在阴性对照组，拖尾细胞率和拖尾细胞尾长差异均无显著性；B(a)P 0.5～1.0 μg/ml和2-AF 10～50 μg/ml浓度组，预孵法的拖尾细胞尾长大于混合法(P<0.01)；2-AF剂量为10 μg/ml时，预孵法拖尾细胞率高于混合法(P<0.01)。
表1 两种活化方式的彗星试验结果 受试物
浓度
(μg/ml)
拖尾细胞率(%)
, http://www.100md.com
拖尾细胞尾长(μm,
±s)-S9
混合
预孵
-S9
混合
预孵
阴性对照
0
3
5
6
, 百拇医药
9.6±1.5
10.8±2.4
11.2± 2.1
B(a)P
0.05
3
5
8
10.5±2.0
10.2±1.8
12.3± 3.2
0.1
5
, 百拇医药
50
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11.5±2.2
11.2±2.8
17.6± 3.6
0.5
5
90
90
11.8±2.3
29.3±3.8
66.3± 5.5*
, 百拇医药
1.0
90
100
100
21.5±3.2
142.4±8.3
163.8±10.7*
2-AF
5.0
2
3
5
8.6±1.6
, 百拇医药
10.2±2.2
11.2± 2.5
10.0
3
50
80*
10.6±2.0
12.9±3.2
13.6± 2.3
20.0
5
90
, 百拇医药 95
12.0±2.5
18.6±5.0
30.5± 2.5*
50.0
5
100
100
13.6±2.6
100.8±8.6
120.9± 5.5*
暴露时间为2 h；与阴性对照组比，*P<0.01 不同暴露时间的彗星试验结果显示随暴露时间延长，拖尾细胞率逐渐增加。受试物最低浓度仅3.0 h时间点检出DNA损伤效应。由表2可见：拖尾细胞尾长随时间延长而增加，同剂量组1.5 h与1.0 h、3.0 h与2.0 h比较，差异有显著性(P<0.01)，2.0 h与1.5 h比较，拖尾细胞尾长差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
不同S9浓度的彗星试验结果见表3、4。由表可见：随着S9浓度增加，拖尾细胞率及拖尾细胞尾长均明显增加，S9浓度体积分数为10%时活化效果最佳。表2 预孵法不同暴露时间的拖尾细胞尾长 受试物
浓度
(μg/ml)
拖尾细胞尾长(μm,
±s)1.0 h
1.5 h
2.0 h
3.0 h
B(a)P
, http://www.100md.com
0.05
10.5±4.2
10.6±3.6
12.3± 3.2
13.2± 3.5
0.1
12.5±3.4
20.6±3.4*
31.0± 4.3
61.3± 4.9*
0.5
32.8±2.9
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76.5±4.5*
86.4± 5.8
113.2± 9.6*
1.0
58.5±5.6
165.0±8.6*
176.2±13.2
182.0±15.3
2-AF
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11.4±5.8
11.3± 2.5
11.6± 2.6*
10.0
7.5±2.2
12.8±3.3*
13.6± 4.2
15.2± 3.2
20.0
15.6±3.4
35.5±2.4*
, 百拇医药
40.5± 4.5
68.4± 3.5*
50.0
61.4±5.6
130.0±9.5*
140.2± 8.6
162.9± 18.6*
阴性对照
0
0
9.6±2.8
, 百拇医药
1.2±2.1
12.9±5.6
同剂量组1.5 h与1.0 h，3.0 h与2.0 h比较，*P<0.01表3 预孵法不同浓度S9对拖尾细胞率的影响(%) 受试物
浓度
(μg/ml)
不同浓度S9的拖尾细胞率
0%
2%
5%
10%
B(a)P
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0.05
3
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2
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20.0
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80*
100*
阴性对照
0
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3
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暴露时间为1.5 h；与同剂量组较低S9浓度的实验结果比较，*P<0.01表4 预孵法不同浓度S9对拖尾细胞尾长的影响(
±s) 受试物浓度
, 百拇医药
(μg/ml)
不同浓度S9的拖尾细胞尾长(μm)
0%
2%
5%
10%
B(a)P
0.05
6.2±2.9
4.8±3.5
7.8±4.3
9.8± 3.8
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7.9±3.5
8.0±4.0
15.6±2.9*
22.6± 2.4*
0.5
8.5±4.2
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36.8±5.8*
78.5± 6.5*
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10.0±5.6
25.6±3.5*
86.5±6.6*
168.0± 7.6*
2-AF
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4.0±2.5
5.8±3.6
9.5± 5.2
10.0
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5.2±1.8
6.2±4.5
13.5± 3.2*
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10.8±2.2
38.5± 4.2*
50.0
6.8±3.5
7.6±4.2
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28.4±3.4
135.0±11.6*
阴性对照
0
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3.9±2.3
5.0±2.5
9.6±5.2
暴露时间为1.5 h；与同剂量组较低S9浓度的实验结果比较，*P<0.01
3 讨论
试验结果表明：彗星试验中，预孵法和混合法两种方式均能有效活化间接致突变物，预孵法活化效果优于混合法。随暴露时间延长和S9浓度增加，DNA损伤效应增强。本文推荐彗星试验的体外活化试验条件为：化学物以体积分数为10%的S9-mix预孵活化0.5 h，细胞暴露1.5 h。
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Ames试验常规应用混合法活化间接致突变物，但多数学者认为：某些类型化学物用预孵法检测更为有效[1]。本试验结果表明：彗星试验中，预孵法活化效果优于混合法。其原因可能是：在预孵法中，由于预孵时细胞悬液未加入，活化反应在较小的体积中进行，反应液中S9浓度相对较高，增加了活化反应的速度。
Myhr和Mayo[6]在小鼠淋巴瘤细胞L5178Y基因突变试验中发现：暴露时间延长至8 h，或加S9预培养18 h后暴露4 h，可引起突变频率明显增加。而McGregor[7]报道，在L5178Y细胞基因突变试验中，随着S9浓度的增加，突变频数增加。本试验所涉及的暴露时间与S9浓度未检出S9的细胞毒性与遗传毒性。
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(收稿日期：1999-07-26), http://www.100md.com