血管紧张素Ⅰ转换酶基因多态性与2型糖尿病缺血性脑病相关性研究
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中国糖尿病杂志 2000年第4期第8卷 短篇报道
山东医科大学附属医院内分泌科(邮政编码 250012)；南海荣 王德全 许玲 徐金元 李甲芬(现在山东省滨州地区人民医院内分泌科) 南海荣 王德全 许玲 徐金元 李甲芬
关键词：
摘要：
中国糖尿病杂志000419 中国糖尿病性脑血管病发生率为3.63%～17.19%[1]，尤 其是在2型糖尿病患者中，其患病率高，发病早，易反复发生，严重威胁糖尿病患者的生命 及生活质量。近年来，多采用研究候选基因这一方法，从分子遗传学角度探讨其发病机制。 肾素-血管紧张素系统(RAS)在调节血压和水、电解质平衡中起重要作用，血管紧张素Ⅰ 转换酶(ACE)基因是RAS系统的重要组成部分，其插入/缺失(I/D)多态性和脑血管病有关 [2]。我们利用PCR技术，研究了中国汉族人2型糖尿病缺血性脑病和ACE基因I/D多态性 的关系，报告如下。
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对象与方法
一、对象
收集1997年7月～1998年12月在滨州地区人民医院及山东医科大学附属医院就诊或查体无 血缘关系的汉族人168例，分为二组。
1.2型糖尿病(DM)组：104例，年龄63.4±6.8岁，男61例，女43例，病程6.8±5.1(0～22)年 。按WHO 1985年诊断标准进一步分为2个亚组：糖尿病伴缺血性脑病组[DM-IC(+)]，51 例，年龄64.3±6.1岁，男30例，女21例，病程7.8±4.7(0～20)年；糖尿病无缺血性脑病组 [DM-IC(-)]，53例，年龄62.3±7.3岁，男31例，女22例，病程6.5±4.6(0～22)年。
2.健康对照(C)组：64例，年龄60.1±7.6岁，男38例，女26例，均无血缘关系，无糖尿病， 无缺血性脑病史。
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二、方法
所有研究对象经空腹12～14小时后，于次晨采集静脉血3ml，EDTA抗凝，用异硫氰酸胍无毒 抽提法[3]从白细胞中提取DNA。基因扩增引物由上海细胞生物研究所合成。引物序 列为：①5′-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3′；②5′-GAT GTG GTG GCC ATC AC A TTC ATC AGA T-3′。25μl的PCR反应体系中含模板DNA 1μg，Tag酶(Promega公司)1U， 4dNTp(Promega公司)各1μl，引物各1μl，25μmo/氯化镁1μ1，10×缓冲夜5μ1。在PCR 仪上94℃预变性1分钟，然后扩
附表 2型糖尿病者和健康对照者ACE基因第16内含子I/D多 态等位基因及
基因型频率比较(%，例) 类别
例数
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等位基因
基因型
D
I
DD
ID
II
DM总组
104
47.6(99)
52.4(109)
26.9(28)
41.4(43)
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31.7(33)[ BHDWG1*2〗DM-IC(+)组
51
66.7(68)
33.3(34)
43.1(22)
47.1(24)
9.8(5)
DM-IC(-)组
53
29.3(31)
71.7(75)
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11.4(6)
35.8(19)
52.8(28)
C组
64
39.1(50)
60.9(78)
17.2(11)
43.7(28)
39.1(25 )
DM-IC(+)组与C组及DM-IC(-)组比较 P<0.001，P<0.01
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增35个循环：94℃变性45秒、55℃退火35秒、72℃延伸70秒，最后72 ℃延伸4分钟。取PCR产物8μ1，在2%琼脂糖凝胶上电泳观察结果。取空腹静脉血3ml，测定 空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)、高密度脂蛋 白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)等。
三、统计学处理
采用Microsoft公司SAS6.11统计软件，计数资料的比较使用χ2检验，用Logistic回归法 分析各检测指标与糖尿病缺血性脑病的相关性及参与发病的独立性，以比数比表示各检测指 标参与发病的风险率。
结 果
一、ACE基因型分布(附表)
以DM组与C组比较，ACE(I/D)的等位基因及基因型频率间均无显著性差异。DM-IC(+)组D型 等位基因(66.7%)和DD基因型(43.1%)频率高于C组(39.1%和17.2%)(χ2分别为17.3和9.34 ，P分别为<0.001和<0.01)和DM-IC(-)组29.3%和11.4%(χ2分别为29.2和13.4，P 均<0.001),II基因型频率(9.8%)显著低于C组(39.1%)(χ2为12.6)和DM-IC(-)组(52.8% )(χ2为22.2，P均<0.001)。DM-IC(-)组和C组的D型等位基因和DD基因型频率无显著 性差异(P均>0.05)。
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二、2型糖尿病缺血性脑病危险因素分析
多变量Logistic回归分析结果：DD、ID基因型及收缩压与缺血性脑病相关(P分别为0.00 1，0.021，0.050)，其比数比分别为3.5(2.1～6.5)、2.4(1.3～4.7)、1.9(1.1～3.8)。
讨 论
ACE基因是RAS系统的重要组成部分，它催化10肽血管紧张素Ⅰ转化为强缩血管物 质--8肽血管紧张素Ⅱ，并灭活有舒血管作用的缓激肽。编码ACE的基因位于人17q2.3， 含有26个外显子和25个内含子，其16内含子I/D多态性和血浆ACE水平有关，DD型纯合子血浆 ACE水平增高[4，5]。
Catto等[2]研究发现，携带D型等位基因脑缺血患者急性期死亡危险性增加。Kario 等[6]研究结论认为，D型等位基因与日本高血压患者缺血性脑病相关，而且可能是 高血压患者发生脑血管病的独立危险因素。本组结果提示：ACE基因I/D多态性与中国2型糖 尿病缺血性脑病相关，D型等位基因参与后者的发病。
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糖尿病缺血性脑病的发病与大、微血管病变均有关，而且脂代谢紊乱、高胰岛素血症、多元 醇途径代谢障碍等诸多因素亦参与其中。近年研究发现D型等位基因是糖尿病患者颈动脉管 壁增厚的危险因子[7]。颈动脉壁增厚是脑缺血的直接原因。我们的研究对象为中 国汉族人，两组患者病史、吸烟史、饮酒史等均有可比性。计数等位基因频率后，经检验符 合Hardy-weinburg平衡。本研究提示：ACE基因第16内含子I/D多态性与2型糖尿病缺血性脑 病相关，D型等位基因是后者的重要危险因子，II基因型可能是保护性因子，在2型糖尿病患 者中检测ACE基因I/D多态，有利于确定、监测缺血性脑病高危人群，以便及早预防、治疗。
参 考 文 献
1，蒋国彦.实用糖尿病学.第一版.北京：人民卫生出版社.1992：36.
2，Catto A,Carte AM,Barrett JH,et al.Angiotensin-converting enzyme insertion/del etion polymorphism and cerebrovascular disease.Stroke,1996,27:435.
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3，马维芳，张基增，徐湘民.用异硫氰酸胍自外周血抽提DNA，临床检验杂志，1995，13：14 2.
4，Hubert C,Houot AM,Corvol P,et al.Structure of the angiotensin I converting enz yme gene.J Biol Chem,1991,266:15377.
5，Tiret L,Rigat B,Visvikis S,et al.Evidence from combined segregation and linkag e analysis that a variant of the angiotensin I converting enzyme gene controls p lasma ACE levels.Am J Genet,1992,51:197.
6，Kario K,Kanai N,Saito K,et al.Ischemic stroke and the gene for angiotensin-co nverting enzyme in Japanese hypertensins.Circulation,1996,93:1630.
7，Hosoi M,Nishizawa Y,Kogawa K,et al.Angiotensin-converting enzyme gene polymor phism is associated with arterial wall thickness in non-insulin dependent diabe tic patients.Circulation,1996,94:704.
收稿：1998-10-26
修回：2000-01-28, 百拇医药
关键词：
摘要：
中国糖尿病杂志000419 中国糖尿病性脑血管病发生率为3.63%～17.19%[1]，尤 其是在2型糖尿病患者中，其患病率高，发病早，易反复发生，严重威胁糖尿病患者的生命 及生活质量。近年来，多采用研究候选基因这一方法，从分子遗传学角度探讨其发病机制。 肾素-血管紧张素系统(RAS)在调节血压和水、电解质平衡中起重要作用，血管紧张素Ⅰ 转换酶(ACE)基因是RAS系统的重要组成部分，其插入/缺失(I/D)多态性和脑血管病有关 [2]。我们利用PCR技术，研究了中国汉族人2型糖尿病缺血性脑病和ACE基因I/D多态性 的关系，报告如下。
, 百拇医药
对象与方法
一、对象
收集1997年7月～1998年12月在滨州地区人民医院及山东医科大学附属医院就诊或查体无 血缘关系的汉族人168例，分为二组。
1.2型糖尿病(DM)组：104例，年龄63.4±6.8岁，男61例，女43例，病程6.8±5.1(0～22)年 。按WHO 1985年诊断标准进一步分为2个亚组：糖尿病伴缺血性脑病组[DM-IC(+)]，51 例，年龄64.3±6.1岁，男30例，女21例，病程7.8±4.7(0～20)年；糖尿病无缺血性脑病组 [DM-IC(-)]，53例，年龄62.3±7.3岁，男31例，女22例，病程6.5±4.6(0～22)年。
2.健康对照(C)组：64例，年龄60.1±7.6岁，男38例，女26例，均无血缘关系，无糖尿病， 无缺血性脑病史。
, 百拇医药
二、方法
所有研究对象经空腹12～14小时后，于次晨采集静脉血3ml，EDTA抗凝，用异硫氰酸胍无毒 抽提法[3]从白细胞中提取DNA。基因扩增引物由上海细胞生物研究所合成。引物序 列为：①5′-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3′；②5′-GAT GTG GTG GCC ATC AC A TTC ATC AGA T-3′。25μl的PCR反应体系中含模板DNA 1μg，Tag酶(Promega公司)1U， 4dNTp(Promega公司)各1μl，引物各1μl，25μmo/氯化镁1μ1，10×缓冲夜5μ1。在PCR 仪上94℃预变性1分钟，然后扩
附表 2型糖尿病者和健康对照者ACE基因第16内含子I/D多 态等位基因及
基因型频率比较(%，例) 类别
例数
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等位基因
基因型
D
I
DD
ID
II
DM总组
104
47.6(99)
52.4(109)
26.9(28)
41.4(43)
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31.7(33)[ BHDWG1*2〗DM-IC(+)组
51
66.7(68)
33.3(34)
43.1(22)
47.1(24)
9.8(5)
DM-IC(-)组
53
29.3(31)
71.7(75)
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11.4(6)
35.8(19)
52.8(28)
C组
64
39.1(50)
60.9(78)
17.2(11)
43.7(28)
39.1(25 )
DM-IC(+)组与C组及DM-IC(-)组比较 P<0.001，P<0.01
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增35个循环：94℃变性45秒、55℃退火35秒、72℃延伸70秒，最后72 ℃延伸4分钟。取PCR产物8μ1，在2%琼脂糖凝胶上电泳观察结果。取空腹静脉血3ml，测定 空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)、高密度脂蛋 白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)等。
三、统计学处理
采用Microsoft公司SAS6.11统计软件，计数资料的比较使用χ2检验，用Logistic回归法 分析各检测指标与糖尿病缺血性脑病的相关性及参与发病的独立性，以比数比表示各检测指 标参与发病的风险率。
结 果
一、ACE基因型分布(附表)
以DM组与C组比较，ACE(I/D)的等位基因及基因型频率间均无显著性差异。DM-IC(+)组D型 等位基因(66.7%)和DD基因型(43.1%)频率高于C组(39.1%和17.2%)(χ2分别为17.3和9.34 ，P分别为<0.001和<0.01)和DM-IC(-)组29.3%和11.4%(χ2分别为29.2和13.4，P 均<0.001),II基因型频率(9.8%)显著低于C组(39.1%)(χ2为12.6)和DM-IC(-)组(52.8% )(χ2为22.2，P均<0.001)。DM-IC(-)组和C组的D型等位基因和DD基因型频率无显著 性差异(P均>0.05)。
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二、2型糖尿病缺血性脑病危险因素分析
多变量Logistic回归分析结果：DD、ID基因型及收缩压与缺血性脑病相关(P分别为0.00 1，0.021，0.050)，其比数比分别为3.5(2.1～6.5)、2.4(1.3～4.7)、1.9(1.1～3.8)。
讨 论
ACE基因是RAS系统的重要组成部分，它催化10肽血管紧张素Ⅰ转化为强缩血管物 质--8肽血管紧张素Ⅱ，并灭活有舒血管作用的缓激肽。编码ACE的基因位于人17q2.3， 含有26个外显子和25个内含子，其16内含子I/D多态性和血浆ACE水平有关，DD型纯合子血浆 ACE水平增高[4，5]。
Catto等[2]研究发现，携带D型等位基因脑缺血患者急性期死亡危险性增加。Kario 等[6]研究结论认为，D型等位基因与日本高血压患者缺血性脑病相关，而且可能是 高血压患者发生脑血管病的独立危险因素。本组结果提示：ACE基因I/D多态性与中国2型糖 尿病缺血性脑病相关，D型等位基因参与后者的发病。
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糖尿病缺血性脑病的发病与大、微血管病变均有关，而且脂代谢紊乱、高胰岛素血症、多元 醇途径代谢障碍等诸多因素亦参与其中。近年研究发现D型等位基因是糖尿病患者颈动脉管 壁增厚的危险因子[7]。颈动脉壁增厚是脑缺血的直接原因。我们的研究对象为中 国汉族人，两组患者病史、吸烟史、饮酒史等均有可比性。计数等位基因频率后，经检验符 合Hardy-weinburg平衡。本研究提示：ACE基因第16内含子I/D多态性与2型糖尿病缺血性脑 病相关，D型等位基因是后者的重要危险因子，II基因型可能是保护性因子，在2型糖尿病患 者中检测ACE基因I/D多态，有利于确定、监测缺血性脑病高危人群，以便及早预防、治疗。
参 考 文 献
1，蒋国彦.实用糖尿病学.第一版.北京：人民卫生出版社.1992：36.
2，Catto A,Carte AM,Barrett JH,et al.Angiotensin-converting enzyme insertion/del etion polymorphism and cerebrovascular disease.Stroke,1996,27:435.
, 百拇医药
3，马维芳，张基增，徐湘民.用异硫氰酸胍自外周血抽提DNA，临床检验杂志，1995，13：14 2.
4，Hubert C,Houot AM,Corvol P,et al.Structure of the angiotensin I converting enz yme gene.J Biol Chem,1991,266:15377.
5，Tiret L,Rigat B,Visvikis S,et al.Evidence from combined segregation and linkag e analysis that a variant of the angiotensin I converting enzyme gene controls p lasma ACE levels.Am J Genet,1992,51:197.
6，Kario K,Kanai N,Saito K,et al.Ischemic stroke and the gene for angiotensin-co nverting enzyme in Japanese hypertensins.Circulation,1996,93:1630.
7，Hosoi M,Nishizawa Y,Kogawa K,et al.Angiotensin-converting enzyme gene polymor phism is associated with arterial wall thickness in non-insulin dependent diabe tic patients.Circulation,1996,94:704.
收稿：1998-10-26
修回：2000-01-28, 百拇医药