糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞信号转导物DAG的影响
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中国糖尿病杂志 2000年第4期第8卷 短篇报道
镇江市第四人民医院心内科(邮政编码 212001)；严金川(现在第二军医大学附属长征医院心内科)；刘乃丰(现在第二军医大学附属长征医院心内科) 严金川 刘乃丰
关键词：
摘要：
中国糖尿病杂志000418 近年来，有关细胞内信号转导与细胞功能的研究越来越引起人们 的关注，二酰基甘油是细胞内重要的信号转导系统[1]。本研究采用薄层层析、放 射自显影和放射标记方法检测糖基化终产物(AGEs)对人脐静脉内皮细胞信号转导物DAG含量 影响以及抗氧化剂VitE的干预保护作用，以期揭示糖尿病病人发生微血管病变的分子机制和 预防措施。
材料和方法
一、人脐静脉内皮细胞培养
, 百拇医药 无菌条件下取健康新生儿脐带25～30cm，PBS冲洗干净后，灌入0.1%胶原酶Ⅱ型12ml，37℃ 孵育15分钟，分离、调节细胞数在3×105/ml，用RPMI 1640培养液接种于6孔培养板，2～ 3天后细胞铺满板底，换液后即可用于实验。内皮细胞鉴定采用Ⅷ因子相关抗原免疫组化染 色。
二、糖基化终产物的制备
将葡萄糖用pH7.4 PBS液配制成0.5mol/L溶液，无菌过滤，4℃保存，取牛血清白蛋白(BSA)5 .0g/L加入一定量葡萄糖，使终浓度为50mmol/L。在37℃无菌孵育，上述孵育液中一同加入 终浓度为0.5mmol/L的EDTA，以减少氧化反应产生。实验前用pH7.4 PBS透析去除未结合的葡 萄糖。对照组BSA中不含葡萄糖，余条件一致。
三、实验方法
1.分组：当细胞培养至融合状态后，换成含0.5%胎牛血清培养液过夜，分别加入不同浓度 的AGEs和不同作用时间、不同糖化程度(葡萄糖与牛血清白蛋白分别孵育4周、8周、12周代 表糖化轻、中、重度)和不同葡萄糖修饰的AGEs。VitE组AGEs干预前4小时分别加入不同浓度 的VitE共同孵育。
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2.试剂和仪器：DAG KIT(含DAG激酶)为Amersham公司产品，RPMI 1640、VitE为Sigma公司产 品，[γ-32P]ATP为北京原子能公司产品，液闪仪为Beckman LS-5000TD型 ，美国产品。
3.细胞内DAG的提取和测定：将细胞用3ml氯仿∶甲醇(1∶2v/v)抽取细胞总脂，采用DAG激酶 转磷酸反应，同时用[γ-32P]ATP标记，使ATP的32P转至DAG形成 带32P的磷脂酸(PA)，利用薄层层析、放射自显影法分离未标记的DAG，取下显影 点，测其液闪值，根据DAG标准曲线求出对应的DAG含量。
四、统计学处理
结果均以
±s表示，采用小样本t检验。
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结 果
一、AGEs对内皮细胞DAG水平影响的时间效应
DAG的产生具有双时相性变化，分别在15秒和10分钟出现二个峰值，然后缓慢下降，其DAG水 平分别为439.17±15.20pmol/L和677.5±26.14pmol/L。
二、不同浓度AGEs、不同糖化程度和不同葡萄糖修饰的BSA对内皮细胞DAG含量的影响
附表所示：随AGEs浓度增加，糖化程度加重，葡萄糖浓度升高，其DAG水平逐渐升高，与对 照组相比具有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。
附表 不同浓度AGEs、不同糖化程度和不同葡萄糖
修饰的BSA对内皮细胞DAG含量的影响
, 百拇医药
(孵育10分钟，n=3，±s) 项 目
DAG(pmol/L)
AGEs浓度(mg/ml)
0(control)
222.50±18.52
50
340.50±14.36*
100
677.50±26.14**
200
, http://www.100md.com
873.30±17.64**
糖化程度(周)
0(control)
222.50±18.52
4
276.80±19.09*
8
340.50±14.36*
12
396.08±12.42**
葡萄糖浓度(mmol/L)
, 百拇医药
0(control)
222.50±18.52
20
364.50±28.26*
50
677.50±26.14**
与对照组比较 * P<0.05，**P<0.01
三、抗氧化剂VitE对AGEs干预内皮细胞DAG含量的影响
AGEs干预前4小时分别加入不同浓度的VitE(50、100mmol)共同孵育，然后用相同浓度的AGEs (200mg/L)刺激内皮细胞。随着VitE浓度加大，DAG水平明显减少，从873.3±17.64pmol/L 降为441.3±15.8pmol/L，具有浓度依赖效应，但仍然较正常对照组BSA为高，并未完全抑 制。
, 百拇医药
讨 论
近年来，AGEs与细胞特异性受体结合后，通过激活胞内第二信使途径发挥其细胞生物学效应 [2]。特别是二酰基甘油-蛋白激酶C(DAG-PKC)信号转导途径越来越受到关注。DA G是细胞内重要信使物质，它可将外界的刺激信号通过激活细胞内蛋白激酶C(PKC)，并磷 酸化底物蛋白，产生相应的生物学效应。众多研究表明，在内皮细胞(EC)、平滑肌细胞及单 核巨噬细胞等表面存在高亲和特异性AGEs受体，AGEs与受体结合后引起一系列的细胞效应。 我们已经证实平滑肌细胞膜上有高亲和特异性AGEs受体，并促进平滑肌细胞增殖和胞内Ca 2+的升高[3，4]。这一过程与AGEs的浓度、干预时间、糖化程度以及葡萄糖浓 度呈正相关[4]。近来我们进一步证实AGEs刺激平滑肌细胞，引起胞内DAG含量的变 化也与AGEs的浓度、干预时间、糖化程度以及葡萄糖浓度呈正相关。而本实验中应用AGEs在 充分透析除去葡萄糖因素下对内皮细胞干预，发现DAG的变化具有双时相性，并且随浓度、 糖化程度加重以及修饰葡萄糖浓度的增加而增高。这就进一步从分子水平证实AGEs引起的细 胞增殖是与信号转导密切相关的。因此，AGEs引起的DAG/PKC信号转导通路的异常可能是糖 尿病血管并发症的重要发病机制。
, 百拇医药
VitE是体内重要的抗氧化剂，大量的证据进一步证实了抗氧化剂在动脉硬化中具有保护内皮 细胞及血管壁功能完整性的作用。本实验应用VitE预先处理培养的EC，然后给予AGEs进 行干预，结果发现其DAG含量明显减少，呈浓度依赖效应。这与Tran等应用VitE预处理人脐 静脉EC后，发现EC产生DAG的能力明显减弱的结果相似。进一步研究证实，VitE激活了胞内D AG激酶活性，加速了DAG的降解。因此，我们推测上述效应也是由于VitE激活DAG激酶活性， 导致DAG的含量减低。然而，VitE抑制EC产生DAG是否与抗氧化剂的保护作用密切相关，目前 尚不清楚，结果有待进一步探讨。
参 考 文 献
1，Ishizuka Y.Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C.Scince,1992,258:607.
, http://www.100md.com
2，Neeper M,Schmidt AM,Yan SD,et al.Cloning and expression of a cell surface rece ptor for advanced glycosylation end products of proteins.J Biol Chem,1992,267:14 998.
3，Zhou QG,Liu NF,Xie PL.Expression of receptor for advanced glycosylation end pr oducts and inhibition of AGEs induced cytosolic calcium elevation by diltiazem i n cultured rat aortic smooth muscle cells.Acta Pharmacol Sinica,1997,18:425.
4，Jin H,Liu NF,Tang R.Effects of advanced glycosylation end products on prolifer ation and cytosolic free calcium in cultured rat aortic smooth muscle cells.Acta Pharmacol Sinica,1997,18:422.
收稿：1999-10-15
修回：2000-02-28, http://www.100md.com
关键词：
摘要：
中国糖尿病杂志000418 近年来，有关细胞内信号转导与细胞功能的研究越来越引起人们 的关注，二酰基甘油是细胞内重要的信号转导系统[1]。本研究采用薄层层析、放 射自显影和放射标记方法检测糖基化终产物(AGEs)对人脐静脉内皮细胞信号转导物DAG含量 影响以及抗氧化剂VitE的干预保护作用，以期揭示糖尿病病人发生微血管病变的分子机制和 预防措施。
材料和方法
一、人脐静脉内皮细胞培养
, 百拇医药 无菌条件下取健康新生儿脐带25～30cm，PBS冲洗干净后，灌入0.1%胶原酶Ⅱ型12ml，37℃ 孵育15分钟，分离、调节细胞数在3×105/ml，用RPMI 1640培养液接种于6孔培养板，2～ 3天后细胞铺满板底，换液后即可用于实验。内皮细胞鉴定采用Ⅷ因子相关抗原免疫组化染 色。
二、糖基化终产物的制备
将葡萄糖用pH7.4 PBS液配制成0.5mol/L溶液，无菌过滤，4℃保存，取牛血清白蛋白(BSA)5 .0g/L加入一定量葡萄糖，使终浓度为50mmol/L。在37℃无菌孵育，上述孵育液中一同加入 终浓度为0.5mmol/L的EDTA，以减少氧化反应产生。实验前用pH7.4 PBS透析去除未结合的葡 萄糖。对照组BSA中不含葡萄糖，余条件一致。
三、实验方法
1.分组：当细胞培养至融合状态后，换成含0.5%胎牛血清培养液过夜，分别加入不同浓度 的AGEs和不同作用时间、不同糖化程度(葡萄糖与牛血清白蛋白分别孵育4周、8周、12周代 表糖化轻、中、重度)和不同葡萄糖修饰的AGEs。VitE组AGEs干预前4小时分别加入不同浓度 的VitE共同孵育。
, http://www.100md.com
2.试剂和仪器：DAG KIT(含DAG激酶)为Amersham公司产品，RPMI 1640、VitE为Sigma公司产 品，[γ-32P]ATP为北京原子能公司产品，液闪仪为Beckman LS-5000TD型 ，美国产品。
3.细胞内DAG的提取和测定：将细胞用3ml氯仿∶甲醇(1∶2v/v)抽取细胞总脂，采用DAG激酶 转磷酸反应，同时用[γ-32P]ATP标记，使ATP的32P转至DAG形成 带32P的磷脂酸(PA)，利用薄层层析、放射自显影法分离未标记的DAG，取下显影 点，测其液闪值，根据DAG标准曲线求出对应的DAG含量。
四、统计学处理
结果均以
±s表示，采用小样本t检验。, http://www.100md.com
结 果
一、AGEs对内皮细胞DAG水平影响的时间效应
DAG的产生具有双时相性变化，分别在15秒和10分钟出现二个峰值，然后缓慢下降，其DAG水 平分别为439.17±15.20pmol/L和677.5±26.14pmol/L。
二、不同浓度AGEs、不同糖化程度和不同葡萄糖修饰的BSA对内皮细胞DAG含量的影响
附表所示：随AGEs浓度增加，糖化程度加重，葡萄糖浓度升高，其DAG水平逐渐升高，与对 照组相比具有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。
附表 不同浓度AGEs、不同糖化程度和不同葡萄糖
修饰的BSA对内皮细胞DAG含量的影响
, 百拇医药
(孵育10分钟，n=3，
±s) 项 目DAG(pmol/L)
AGEs浓度(mg/ml)
0(control)
222.50±18.52
50
340.50±14.36*
100
677.50±26.14**
200
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873.30±17.64**
糖化程度(周)
0(control)
222.50±18.52
4
276.80±19.09*
8
340.50±14.36*
12
396.08±12.42**
葡萄糖浓度(mmol/L)
, 百拇医药
0(control)
222.50±18.52
20
364.50±28.26*
50
677.50±26.14**
与对照组比较 * P<0.05，**P<0.01
三、抗氧化剂VitE对AGEs干预内皮细胞DAG含量的影响
AGEs干预前4小时分别加入不同浓度的VitE(50、100mmol)共同孵育，然后用相同浓度的AGEs (200mg/L)刺激内皮细胞。随着VitE浓度加大，DAG水平明显减少，从873.3±17.64pmol/L 降为441.3±15.8pmol/L，具有浓度依赖效应，但仍然较正常对照组BSA为高，并未完全抑 制。
, 百拇医药
讨 论
近年来，AGEs与细胞特异性受体结合后，通过激活胞内第二信使途径发挥其细胞生物学效应 [2]。特别是二酰基甘油-蛋白激酶C(DAG-PKC)信号转导途径越来越受到关注。DA G是细胞内重要信使物质，它可将外界的刺激信号通过激活细胞内蛋白激酶C(PKC)，并磷 酸化底物蛋白，产生相应的生物学效应。众多研究表明，在内皮细胞(EC)、平滑肌细胞及单 核巨噬细胞等表面存在高亲和特异性AGEs受体，AGEs与受体结合后引起一系列的细胞效应。 我们已经证实平滑肌细胞膜上有高亲和特异性AGEs受体，并促进平滑肌细胞增殖和胞内Ca 2+的升高[3，4]。这一过程与AGEs的浓度、干预时间、糖化程度以及葡萄糖浓 度呈正相关[4]。近来我们进一步证实AGEs刺激平滑肌细胞，引起胞内DAG含量的变 化也与AGEs的浓度、干预时间、糖化程度以及葡萄糖浓度呈正相关。而本实验中应用AGEs在 充分透析除去葡萄糖因素下对内皮细胞干预，发现DAG的变化具有双时相性，并且随浓度、 糖化程度加重以及修饰葡萄糖浓度的增加而增高。这就进一步从分子水平证实AGEs引起的细 胞增殖是与信号转导密切相关的。因此，AGEs引起的DAG/PKC信号转导通路的异常可能是糖 尿病血管并发症的重要发病机制。
, 百拇医药
VitE是体内重要的抗氧化剂，大量的证据进一步证实了抗氧化剂在动脉硬化中具有保护内皮 细胞及血管壁功能完整性的作用。本实验应用VitE预先处理培养的EC，然后给予AGEs进 行干预，结果发现其DAG含量明显减少，呈浓度依赖效应。这与Tran等应用VitE预处理人脐 静脉EC后，发现EC产生DAG的能力明显减弱的结果相似。进一步研究证实，VitE激活了胞内D AG激酶活性，加速了DAG的降解。因此，我们推测上述效应也是由于VitE激活DAG激酶活性， 导致DAG的含量减低。然而，VitE抑制EC产生DAG是否与抗氧化剂的保护作用密切相关，目前 尚不清楚，结果有待进一步探讨。
参 考 文 献
1，Ishizuka Y.Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C.Scince,1992,258:607.
, http://www.100md.com
2，Neeper M,Schmidt AM,Yan SD,et al.Cloning and expression of a cell surface rece ptor for advanced glycosylation end products of proteins.J Biol Chem,1992,267:14 998.
3，Zhou QG,Liu NF,Xie PL.Expression of receptor for advanced glycosylation end pr oducts and inhibition of AGEs induced cytosolic calcium elevation by diltiazem i n cultured rat aortic smooth muscle cells.Acta Pharmacol Sinica,1997,18:425.
4，Jin H,Liu NF,Tang R.Effects of advanced glycosylation end products on prolifer ation and cytosolic free calcium in cultured rat aortic smooth muscle cells.Acta Pharmacol Sinica,1997,18:422.
收稿：1999-10-15
修回：2000-02-28, http://www.100md.com