糖尿病大鼠视网膜组织中三磷酸腺苷酶活性变化的实验研究
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中国糖尿病杂志 2000年第4期第8卷 短篇报道
何剑峰(柳州市人民医院 邮政编码545001)；仇宜解(青岛大学医学院附属医院)；鲍连云(连云港市第一人民医院) 何剑峰 仇宜解 鲍连云
关键词：
摘要：
中国糖尿病杂志000416 为了解糖尿病大鼠视网膜组织中三磷酸腺苷酶活性的变化情况， 我们动态地观察了糖尿病大鼠发病后不同时期视网膜组织中Na+-K+-ATPase活性的 变化，现将其结果报告如下。
材料和方法
1.实验动物：成年雄性Wistar大鼠48只，体重210～240g。适应性饲养7天，禁食12小时后按 体重随机分成二组，每组24只大鼠。一组为实验组，另一组为对照组。实验组大鼠腹腔注射 链脲佐菌素(65mg/kg),用0.1mol/L pH4.5柠檬酸盐缓冲液配制诱发糖尿病；对照组大鼠腹 腔注射等量柠檬酸盐缓冲液。动物单笼喂养，自由进食和饮水，于注射链脲佐菌素的第三天 起测空腹血糖，血糖≥16.5mmol/L且尿糖持续阳性时确定为实验组。在糖尿病发病后4、6 、12和16周4个时点，每组各取6只动物，禁食12小时后麻醉下尾静脉采血做空腹血糖及糖基 化血红蛋白检测。并摘取双侧眼球取出视网膜组织，精密天平称重，以0.05mol/L冰冷磷酸 缓冲液(pH7.8含0.1mmol/L EDTA)，冰浴下制成10%组织匀浆。
, 百拇医药
2.视网膜Na+-K+-ATPase活性测定：采用孔雀绿比色分析法。酶活力表示以每克蛋白 视网膜组织与底物在37℃水浴中温育2小时，水解ATP释放出的无机磷以微摩尔数表示，酶活 力单位为(μmol Pi mg*pro)/2h。
3.视网膜组织中K+、Na+含量测定：采用原子吸收法，结果以微摩尔/每毫克蛋白数表 示(μmol/mg*prol)。
4.糖基化血红蛋白(HbA1c)测定用微柱层析法，空腹血糖(FBG)测定用葡萄糖氧化法。
5.统计方法：实验数据用
±s表示，统计方法采用t检验及直线相关分析。
结 果
, 百拇医药
1.两组大鼠FBG变化：实验组大鼠FBG均在16.5mmol/L以上，对照组大鼠则均低于6.0m mo/L(表1)。
2.两组大鼠HbAlc变化：在各实验时点，实验组大鼠HbAlc均显著高于对照组(表2)。
表1 两组大鼠FBG变化(±s，mmol/L) 组别
例数
4周
6周
12周
16周
实验组
, 百拇医药
对照组
6
6
16.5±2.5*
5.4±1.3
18.1±1.4*
5.6±1.2
19.2±2.3*
5.5±1.4
19.8±2.8*
5.4±1.2
, 百拇医药
与对照组比较 *P<0.001表2 两组大鼠HbAlc变化(±s，%) 组别
例数
4周
6周
12周
16周
实验组
对照组
6
6
8.6±1.6 *
, http://www.100md.com
4.8±1.2
8.9±1.4*
4.7±2.3
9 .6±1.8*
4.9±1.3
10.1±2.1*
4.8±1.6[ JB)〗
与对照组比较 *P<0.001表3 两组大鼠视网膜组织Na+-K+-ATPase活性
变 化(±s，μmol Pi mg*prol/2h) 组别
, http://www.100md.com
例数
4周
6周
12周
16周
实验组
对照组
6
6
14.37±5.14*
20.48±4.32
12.16±3.28*
, 百拇医药
19.87±5.26
10.85±2.96**
20 .67±4.26
8.96±2.75**
20.53±4.39
与对照组比较 *P<0.01，**P<0.001表4 两组大鼠视网膜组织中Na+含量
的变化(±s，mmol/L) 组别
例数
4周
, 百拇医药
6周
12周
16周
实验组
对照组
6
6
9.4±1.5*
7. 6±1.4
10.3±2.1*
7.8±1.3
11 .9±2.6**
, http://www.100md.com
7.5±1.3
12.2±2.5**
7.7±1.2
与对照组比较 *P<0.05，**P<0.01
3.两组大鼠视网膜组织中Na+-K+-ATPase活性变化：实验组大鼠视网膜组织中Na+ -K+-ATPase活性显著低于对照组，且随病程延长其活性下降更显著(表3)。
4.两组大鼠视网膜组织中Na+含量变化：实验组大鼠视网膜组织中Na+含量均高于对照组 水平，均有显著性差异(表4)。
5.两组大鼠视网膜组织中K+含量变化：实验组大鼠视网膜组织中K+含量显著低于对照组 ，均有显著性差异(表5)。
, http://www.100md.com
6.Na+-K+-ATPase活性变化与其它指标间的直线相关分析：直线相关分析表明，Na +-K+-ATPase活性下降与FBG、HbAlc、Na+、病程呈高度负相关(r值分别为-7.8 641、-7.4273、-6.7952、-6.5879，P均<0.001)，而与K+呈正相关(r值=7 .6582，P<0.001)。表5 两组大鼠视网膜组织中K+含量
的 变化(±s，mmol/L) 组别
n
不同时间K+含量值
4周
, http://www.100md.com
6周
12周
16周
实验组
对照组
6
6
69.8±4.7*
86 .3±4.5
60.2±3.7*
87.4±3.9
56.8± 5.3**
, 百拇医药
87.3±4.1
57.6±4.6**
86.9±4.4
与对照组比较 *P<0.01，**P<0.001
讨 论
研究证实糖尿病患者神经、心脏、肾脏、血管内皮、红细胞膜等组织细胞中ATPase活性均有 改变。本实验结果显示，糖尿病组大鼠视网膜组织中Na+-K+-ATPase活性显著下降， K+含量降低，而Na+含量则增加，这些变化随糖尿病大鼠病程延长而更显著。直线相关 分析表明，糖尿病大鼠视网膜组织中Na+-K+-ATPase活性下降，与FBG、HbAlc、Na +含量及病程呈高度负相关，而与K+含量呈高度正相关。FBG和HbAlc是反应糖代谢紊乱控 制好坏的客观指标，已证实糖代谢紊乱控制好坏和糖尿病病程的长短与糖尿病视网膜病变的 发生发展密切相关[Shoji K，et al.J Diab Comp,1994,8:13]。Na+-K+-ATPase是 存在于 细胞膜和某些细胞器质膜上的一种ATPase，通过分解ATP而获得能量，同时逆浓度差主动地 将细胞外液的K+移入细胞内，将细胞内的Na+移出膜外，以维持细胞内外的离子梯度， 从而控制细胞体积。由此可见，Na+-K+-ATPase是维持组织细胞中离子含量的关键酶 ，其活性下降势必导致视网膜组织细胞内离子含量和分布的异常，而致细胞体积的改变和 视网膜电生理的异常。同时视网膜组织中离子的异常可干扰视网膜组织的代谢，而糖尿病累 及视网膜是先有视网膜代谢的改变，然后才有组织学或检眼镜下所见的血管异常。糖尿病大 鼠视网膜组织中Na+-K+-ATPase活性下降的原因可能与糖代谢障碍致视网膜糖酵解供 能障碍、ATP生成减少有关。我们认为视网膜组织中Na+-K+-ATPase下降以及由此导 致的离子含量改变，可能参与了糖尿病视网膜病变的发生发展过程，但其确切机制有待于进 一步探索。
收稿：1999-09-28
修回：2000-04-21, 百拇医药
关键词：
摘要：
中国糖尿病杂志000416 为了解糖尿病大鼠视网膜组织中三磷酸腺苷酶活性的变化情况， 我们动态地观察了糖尿病大鼠发病后不同时期视网膜组织中Na+-K+-ATPase活性的 变化，现将其结果报告如下。
材料和方法
1.实验动物：成年雄性Wistar大鼠48只，体重210～240g。适应性饲养7天，禁食12小时后按 体重随机分成二组，每组24只大鼠。一组为实验组，另一组为对照组。实验组大鼠腹腔注射 链脲佐菌素(65mg/kg),用0.1mol/L pH4.5柠檬酸盐缓冲液配制诱发糖尿病；对照组大鼠腹 腔注射等量柠檬酸盐缓冲液。动物单笼喂养，自由进食和饮水，于注射链脲佐菌素的第三天 起测空腹血糖，血糖≥16.5mmol/L且尿糖持续阳性时确定为实验组。在糖尿病发病后4、6 、12和16周4个时点，每组各取6只动物，禁食12小时后麻醉下尾静脉采血做空腹血糖及糖基 化血红蛋白检测。并摘取双侧眼球取出视网膜组织，精密天平称重，以0.05mol/L冰冷磷酸 缓冲液(pH7.8含0.1mmol/L EDTA)，冰浴下制成10%组织匀浆。
, 百拇医药
2.视网膜Na+-K+-ATPase活性测定：采用孔雀绿比色分析法。酶活力表示以每克蛋白 视网膜组织与底物在37℃水浴中温育2小时，水解ATP释放出的无机磷以微摩尔数表示，酶活 力单位为(μmol Pi mg*pro)/2h。
3.视网膜组织中K+、Na+含量测定：采用原子吸收法，结果以微摩尔/每毫克蛋白数表 示(μmol/mg*prol)。
4.糖基化血红蛋白(HbA1c)测定用微柱层析法，空腹血糖(FBG)测定用葡萄糖氧化法。
5.统计方法：实验数据用
±s表示，统计方法采用t检验及直线相关分析。结 果
, 百拇医药
1.两组大鼠FBG变化：实验组大鼠FBG均在16.5mmol/L以上，对照组大鼠则均低于6.0m mo/L(表1)。
2.两组大鼠HbAlc变化：在各实验时点，实验组大鼠HbAlc均显著高于对照组(表2)。
表1 两组大鼠FBG变化(
±s，mmol/L) 组别例数
4周
6周
12周
16周
实验组
, 百拇医药
对照组
6
6
16.5±2.5*
5.4±1.3
18.1±1.4*
5.6±1.2
19.2±2.3*
5.5±1.4
19.8±2.8*
5.4±1.2
, 百拇医药
与对照组比较 *P<0.001表2 两组大鼠HbAlc变化(
±s，%) 组别例数
4周
6周
12周
16周
实验组
对照组
6
6
8.6±1.6 *
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4.8±1.2
8.9±1.4*
4.7±2.3
9 .6±1.8*
4.9±1.3
10.1±2.1*
4.8±1.6[ JB)〗
与对照组比较 *P<0.001表3 两组大鼠视网膜组织Na+-K+-ATPase活性
变 化(
±s，μmol Pi mg*prol/2h) 组别, http://www.100md.com
例数
4周
6周
12周
16周
实验组
对照组
6
6
14.37±5.14*
20.48±4.32
12.16±3.28*
, 百拇医药
19.87±5.26
10.85±2.96**
20 .67±4.26
8.96±2.75**
20.53±4.39
与对照组比较 *P<0.01，**P<0.001表4 两组大鼠视网膜组织中Na+含量
的变化(
±s，mmol/L) 组别例数
4周
, 百拇医药
6周
12周
16周
实验组
对照组
6
6
9.4±1.5*
7. 6±1.4
10.3±2.1*
7.8±1.3
11 .9±2.6**
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7.5±1.3
12.2±2.5**
7.7±1.2
与对照组比较 *P<0.05，**P<0.01
3.两组大鼠视网膜组织中Na+-K+-ATPase活性变化：实验组大鼠视网膜组织中Na+ -K+-ATPase活性显著低于对照组，且随病程延长其活性下降更显著(表3)。
4.两组大鼠视网膜组织中Na+含量变化：实验组大鼠视网膜组织中Na+含量均高于对照组 水平，均有显著性差异(表4)。
5.两组大鼠视网膜组织中K+含量变化：实验组大鼠视网膜组织中K+含量显著低于对照组 ，均有显著性差异(表5)。
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6.Na+-K+-ATPase活性变化与其它指标间的直线相关分析：直线相关分析表明，Na +-K+-ATPase活性下降与FBG、HbAlc、Na+、病程呈高度负相关(r值分别为-7.8 641、-7.4273、-6.7952、-6.5879，P均<0.001)，而与K+呈正相关(r值=7 .6582，P<0.001)。表5 两组大鼠视网膜组织中K+含量
的 变化(
±s，mmol/L) 组别n
不同时间K+含量值
4周
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6周
12周
16周
实验组
对照组
6
6
69.8±4.7*
86 .3±4.5
60.2±3.7*
87.4±3.9
56.8± 5.3**
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87.3±4.1
57.6±4.6**
86.9±4.4
与对照组比较 *P<0.01，**P<0.001
讨 论
研究证实糖尿病患者神经、心脏、肾脏、血管内皮、红细胞膜等组织细胞中ATPase活性均有 改变。本实验结果显示，糖尿病组大鼠视网膜组织中Na+-K+-ATPase活性显著下降， K+含量降低，而Na+含量则增加，这些变化随糖尿病大鼠病程延长而更显著。直线相关 分析表明，糖尿病大鼠视网膜组织中Na+-K+-ATPase活性下降，与FBG、HbAlc、Na +含量及病程呈高度负相关，而与K+含量呈高度正相关。FBG和HbAlc是反应糖代谢紊乱控 制好坏的客观指标，已证实糖代谢紊乱控制好坏和糖尿病病程的长短与糖尿病视网膜病变的 发生发展密切相关[Shoji K，et al.J Diab Comp,1994,8:13]。Na+-K+-ATPase是 存在于 细胞膜和某些细胞器质膜上的一种ATPase，通过分解ATP而获得能量，同时逆浓度差主动地 将细胞外液的K+移入细胞内，将细胞内的Na+移出膜外，以维持细胞内外的离子梯度， 从而控制细胞体积。由此可见，Na+-K+-ATPase是维持组织细胞中离子含量的关键酶 ，其活性下降势必导致视网膜组织细胞内离子含量和分布的异常，而致细胞体积的改变和 视网膜电生理的异常。同时视网膜组织中离子的异常可干扰视网膜组织的代谢，而糖尿病累 及视网膜是先有视网膜代谢的改变，然后才有组织学或检眼镜下所见的血管异常。糖尿病大 鼠视网膜组织中Na+-K+-ATPase活性下降的原因可能与糖代谢障碍致视网膜糖酵解供 能障碍、ATP生成减少有关。我们认为视网膜组织中Na+-K+-ATPase下降以及由此导 致的离子含量改变，可能参与了糖尿病视网膜病变的发生发展过程，但其确切机制有待于进 一步探索。
收稿：1999-09-28
修回：2000-04-21, 百拇医药