瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕角朊细胞VEGF的表达
作者：李军辉 邢新 倪灿荣 欧阳天祥 文军慧 郭恩覃
单位：
关键词：血管内皮生长因子；角朊细胞；瘢痕疙瘩；增殖性瘢痕
第二军医大学学报000425 【摘要】目的:探讨瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕中血管内皮生长因子(VEGF)的表达及其意义。方法:应用免疫组织化学染色技术，以正常皮肤和正常瘢痕作对照，观察了瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕中VEGF的表达。结果:瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕角朊细胞均有大量VEGF表达，阳性细胞主要位于基底层，染色颗粒在细胞质内，真皮层少见阳性细胞。而正常皮肤和正常瘢痕中VEGF的表达均较弱，与瘢痕疙瘩或增殖性瘢痕比较均有显著差异。结论:瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕基底层的角朊细胞大量VEGF表达，它可能与瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕的形成密切相关。
【中国分类号】R 619.6 【文献标识码】A
, 百拇医药
【文章编号】0258-879X(2000)04-0384-03
Vascular endothelial growth factor expression in keratinocytes in keloids and hypertrophic scars
LI Jun-Hui,XING Xin,OUYANG Tian-Xiang，WEN Jun-Hui，GUO En-Tan
(Department of Plastic Surgery,Changhai Hospital，Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
NI Can-Rong
(Department of Pathologic Anatomy)
, 百拇医药
【ABSTRACT】Objective：To investigate the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) in keloids and hypertrophic scars.Methods：With immunohistochemistry technique,the expression of VEGF in 12 keloids and 10 hypertrophic scars was investigated,and the normal skins from 10 blepharoplasty patients,the normal scars from 10 scar-excision patients served as controls.Results：The expression of VEGF on keratinocytes in keloids and hypertrophic scars was higher than controls (normal scars or normal skins).The positive cells were almost on basal layer in epidermis,and there were rare positive cells in dermis.Conclusion：There is enhanced expression of VEGF on basal cells in keloids and hypertrophic scars,and it may play a role in the formation of keloid and hypertrophic scar.
, 百拇医药
【KEY WORDS】vascular endothelial growth factor; keratinocyte; keloid; hypertrophic scar
研究证实[1,2]，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管内皮细胞的特异有丝分裂原，在正常皮肤角朊细胞有低度的表达，而在上皮肿瘤或伤口愈合过程中其表达明显升高。其他研究[3,4]亦证实，多种细胞因子能调节培养角朊细胞VEGF的表达，VEGF在上皮肿瘤的形成及伤口愈合中具有重要的作用。但伤口愈合后形成的瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕等异常瘢痕中角朊细胞VEGF的表达鲜见研究。我们观察了瘢痕疙瘩、增殖性瘢痕、正常瘢痕和正常皮肤角朊细胞VEGF的表达，并对其意义进行了初步探讨。
1 材料和方法
1.1 组织标本 (1)瘢痕疙瘩组织标本来源于1995年4月至1998年4月我院收治的患者12例，术后经病理检查并结合临床均明确诊断为瘢痕疙瘩；(2)增殖性瘢痕标本取自1998年4月至1998年8月收治的10例烧伤创面愈合后的增殖性瘢痕患者，均为伤后半年左右，瘢痕处于增殖期；(3)正常瘢痕和；(4)正常皮肤组织来源于门诊切除的已软化瘢痕和重睑手术标本，均为10例。所有标本以中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，5 μm切片。
, http://www.100md.com
1.2 免疫组织化学染色 兔抗人VEGF多克隆抗体和LSAB试剂盒分别购自Santa Cruz和DAKO公司，按照试剂盒说明并参照Imoto[4]的染色方法进行染色。简要步骤如下：切片经二甲苯脱蜡并梯度脱水，0.3%过氧化氢孵育30 min阻断内源性过氧化物酶活性，1:200稀释的VEGF抗体于室温下反应2 h，PBS漂洗后加生物素化的二抗(1：400稀释)室温下反应30 min，再漂洗后加结合过氧化物酶的avidin(1：400稀释)室温下反应30 min，DAB底物显色，苏木精衬染。同时切片作空白对照染色，避免假阳性。另有组织切片作常规苏木精-伊红(H-E)染色。
1.3 结果判断 于显微镜下观察，细胞质内有棕褐色颗粒为阳性细胞，在低倍镜下测定切片中上皮长度，在高倍镜下计数阳性细胞数目，计算每mm长度上皮中阳性细胞数目。
1.4 统计学处理 数据以
±s表示,采用F检验,并计算组间差异。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 免疫组织化学染色 在瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕标本均中有较强的VEGF表达，阳性细胞主要位于基底层的角朊细胞(图1，见封三上)，染色颗粒位于细胞质内，真皮层少见阳性细胞。正常皮肤和正常瘢痕组织角朊细胞VEGF有弱的表达，无论其阳性细胞数目或染色颗粒深度均与瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕有非常显著的差异(表1)。
2.2 H-E染色 在瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕均有大量的胶原沉积，真皮内尤其乳头层有大量的微小血管，较正常皮肤和正常瘢痕组织明显增多，以Ⅷ因子特异性单抗染色进一步证实是微小血管。
表 1 瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕中VEGF的表达
Tab 1 The expression of VEGF in keratinocytes
in keloids and hypertrophic scars
, 百拇医药
(±s) Group
n
Numbers of positive cell
Normal skin(A)
10
8.4±4.5
Normal scar(B)
10
15.6±8.7
Hypertrophic scar(C)
, 百拇医药
10
65.9±18.7**
Keloid(D)
12
78.3±13.8**
** P<0.01 vs A and B group 3 讨 论
研究证实，VEGF是血管内皮细胞的特异有丝分裂原，能促进内皮细胞的增殖、分化，它能够诱导并形成大量新生血管[1]。Viac等[2]发现VEGF在正常皮肤角朊细胞中有低度的表达，而在鳞状细胞癌及病毒性皮肤患者的角朊细胞中其表达明显增高，VEGF的表达与角朊细胞的增殖、分化状态有关。伤口愈合过程中角朊细胞中VEGF表达亦明显升高，体外实验亦证实，多种细胞因子如表皮生长因子(EGF)、角朊细胞生长因子(KGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)等均能上调角朊细胞VEGF的表达，这些细胞因子在伤口愈合中均有表达，VEGF在伤口愈合有重要的作用[3,5]。但伤口愈合后形成的瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕等异常瘢痕角朊细胞VEGF的表达尚未见文献报道。我们应用免疫组化技术，发现瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕组织标本中有较强的VEGF表达，阳性细胞主要位于基底层的角朊细胞，染色颗粒位于细胞质内，真皮内少见阳性细胞；正常皮肤和正常瘢痕角朊细胞VEGF有较弱的表达，无论阳性细胞数目或染色颗粒深度与瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕比较均有显著的差异。本研究亦观察到在瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕的真皮层有大量微血管。我们认为瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕的形成可能与角朊细胞中VEGF过度表达有密切关系。推测其机制，可能为瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕角朊细胞中VEGF通过旁分泌机制作用于血管内皮细胞，在真皮内诱导生成大量新生血管，并能通过某种机制调节成纤维细胞的活性[6]，影响胶原的代谢，这与Detmar等[3]的观点一致。瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕均是伤口过度愈合所形成的异常瘢痕，在这些异常瘢痕组织中存在多量高度增殖活性的角朊细胞，他们有大量的VEGF mRNA[5]表达，加之有组织缺氧[7，8]，而缺氧也可刺激细胞分泌VEGF[9]，因此瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕角朊细胞中VEGF的大量表达，既与角朊细胞的增殖活性程度有关，又与组织细胞缺氧相关。但增殖性瘢痕随着时间的流逝，颜色将渐变浅，质地变软，角朊细胞的增殖活性程度降低，与正常瘢痕组织逐渐接近；而瘢痕疙瘩却出现一种向周围正常组织侵润的特性，角朊细胞仍保持高度的增殖活性，这两种不同转归的机制有待于进一步研究。
, 百拇医药
异常瘢痕的形成受诸多细胞及细胞外基质的影响，本实验应用免疫组化技术证实瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕基底层角朊细胞大量VEGF表达，推测VEGF的高表达在异常瘢痕的形成中具有重要的作用，但其具体作用机制有待于进一步研究。
【参考文献】
[1]Dvorak HF,Brown LF,Detmar M,et al.Vascular permeability factor/ vascular endothelial growth factor,microvascular hyperpermeability,and angiogenesis[J].Am J Pathol,1995,146(5):1029-1039.
[2]Viac J,Palacio S,Schmitt D,et al.Expression of vascular endothelial growth factor in normal epidermis,epithelial tumors and cultured keratinocytes[J].Arch Dermatol Res,1997,289(3):158-163.
, 百拇医药
[3]Detmar M,Yeo KT,Nagy JA,et al.Keratinocyte-derived vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) is a potent mitogen for dermal microvascular endothelial cells[J].J Invest Dermatol,1995,105(1):44-50.
[4]Imoto H,Osaki T,Taga S,et al.Vascular endothelial growth factor expression in non-small-cell lung cancer:prognostic significance in squamous cell carcinoma[J].J Thorac Cardiovasc Surg,1998,115(5):1007 -1014.
, 百拇医药 [5]Frank S,Hubner G,Breier G,et al.Regulation of vascular endothelial growth factor expression in cultured keratinocytes.Implications for normal and impaired wound healing[J].J Biol Chem,1995,270(21):12607-12613.
[6]Garner WL.Epidermal regulation of dermal fibroblast activity[J].Plast Reconstr Surg,1998,102(1):135-139.
[7]Appletori I,Brown NJ,Willoughby DA.Apoptosis,necrosis,and proliferation possible implications in the etiology of keloids[J].Am J Pathol,1996,149(5):1441-1447.
, 百拇医药
[8]Machesney M,Tidman N,Waseem A,et al.Activated keratinocytes in the epidermis of hypertrophic scars[J].Am J Pathol,1998,152(5):1133-1441.
[9]Detmar M,Brown LF,Berse B,et al.Hypoxia regulars the expression of vascular permeability factor/ vascular endothelial growth factor (VPF/VEGF) and its receptors in human skin[J].J Invest Dermatol,1997,108(3):263-268.
【收稿日期】1999-11-23
【修回日期】2000-03-06, 百拇医药
单位：
关键词：血管内皮生长因子；角朊细胞；瘢痕疙瘩；增殖性瘢痕
第二军医大学学报000425 【摘要】目的:探讨瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕中血管内皮生长因子(VEGF)的表达及其意义。方法:应用免疫组织化学染色技术，以正常皮肤和正常瘢痕作对照，观察了瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕中VEGF的表达。结果:瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕角朊细胞均有大量VEGF表达，阳性细胞主要位于基底层，染色颗粒在细胞质内，真皮层少见阳性细胞。而正常皮肤和正常瘢痕中VEGF的表达均较弱，与瘢痕疙瘩或增殖性瘢痕比较均有显著差异。结论:瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕基底层的角朊细胞大量VEGF表达，它可能与瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕的形成密切相关。
【中国分类号】R 619.6 【文献标识码】A
, 百拇医药
【文章编号】0258-879X(2000)04-0384-03
Vascular endothelial growth factor expression in keratinocytes in keloids and hypertrophic scars
LI Jun-Hui,XING Xin,OUYANG Tian-Xiang，WEN Jun-Hui，GUO En-Tan
(Department of Plastic Surgery,Changhai Hospital，Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
NI Can-Rong
(Department of Pathologic Anatomy)
, 百拇医药
【ABSTRACT】Objective：To investigate the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) in keloids and hypertrophic scars.Methods：With immunohistochemistry technique,the expression of VEGF in 12 keloids and 10 hypertrophic scars was investigated,and the normal skins from 10 blepharoplasty patients,the normal scars from 10 scar-excision patients served as controls.Results：The expression of VEGF on keratinocytes in keloids and hypertrophic scars was higher than controls (normal scars or normal skins).The positive cells were almost on basal layer in epidermis,and there were rare positive cells in dermis.Conclusion：There is enhanced expression of VEGF on basal cells in keloids and hypertrophic scars,and it may play a role in the formation of keloid and hypertrophic scar.
, 百拇医药
【KEY WORDS】vascular endothelial growth factor; keratinocyte; keloid; hypertrophic scar
研究证实[1,2]，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管内皮细胞的特异有丝分裂原，在正常皮肤角朊细胞有低度的表达，而在上皮肿瘤或伤口愈合过程中其表达明显升高。其他研究[3,4]亦证实，多种细胞因子能调节培养角朊细胞VEGF的表达，VEGF在上皮肿瘤的形成及伤口愈合中具有重要的作用。但伤口愈合后形成的瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕等异常瘢痕中角朊细胞VEGF的表达鲜见研究。我们观察了瘢痕疙瘩、增殖性瘢痕、正常瘢痕和正常皮肤角朊细胞VEGF的表达，并对其意义进行了初步探讨。
1 材料和方法
1.1 组织标本 (1)瘢痕疙瘩组织标本来源于1995年4月至1998年4月我院收治的患者12例，术后经病理检查并结合临床均明确诊断为瘢痕疙瘩；(2)增殖性瘢痕标本取自1998年4月至1998年8月收治的10例烧伤创面愈合后的增殖性瘢痕患者，均为伤后半年左右，瘢痕处于增殖期；(3)正常瘢痕和；(4)正常皮肤组织来源于门诊切除的已软化瘢痕和重睑手术标本，均为10例。所有标本以中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，5 μm切片。
, http://www.100md.com
1.2 免疫组织化学染色 兔抗人VEGF多克隆抗体和LSAB试剂盒分别购自Santa Cruz和DAKO公司，按照试剂盒说明并参照Imoto[4]的染色方法进行染色。简要步骤如下：切片经二甲苯脱蜡并梯度脱水，0.3%过氧化氢孵育30 min阻断内源性过氧化物酶活性，1:200稀释的VEGF抗体于室温下反应2 h，PBS漂洗后加生物素化的二抗(1：400稀释)室温下反应30 min，再漂洗后加结合过氧化物酶的avidin(1：400稀释)室温下反应30 min，DAB底物显色，苏木精衬染。同时切片作空白对照染色，避免假阳性。另有组织切片作常规苏木精-伊红(H-E)染色。
1.3 结果判断 于显微镜下观察，细胞质内有棕褐色颗粒为阳性细胞，在低倍镜下测定切片中上皮长度，在高倍镜下计数阳性细胞数目，计算每mm长度上皮中阳性细胞数目。
1.4 统计学处理 数据以
±s表示,采用F检验,并计算组间差异。, 百拇医药
2 结 果
2.1 免疫组织化学染色 在瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕标本均中有较强的VEGF表达，阳性细胞主要位于基底层的角朊细胞(图1，见封三上)，染色颗粒位于细胞质内，真皮层少见阳性细胞。正常皮肤和正常瘢痕组织角朊细胞VEGF有弱的表达，无论其阳性细胞数目或染色颗粒深度均与瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕有非常显著的差异(表1)。
2.2 H-E染色 在瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕均有大量的胶原沉积，真皮内尤其乳头层有大量的微小血管，较正常皮肤和正常瘢痕组织明显增多，以Ⅷ因子特异性单抗染色进一步证实是微小血管。
表 1 瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕中VEGF的表达
Tab 1 The expression of VEGF in keratinocytes
in keloids and hypertrophic scars
, 百拇医药
(
±s) Groupn
Numbers of positive cell
Normal skin(A)
10
8.4±4.5
Normal scar(B)
10
15.6±8.7
Hypertrophic scar(C)
, 百拇医药
10
65.9±18.7**
Keloid(D)
12
78.3±13.8**
** P<0.01 vs A and B group 3 讨 论
研究证实，VEGF是血管内皮细胞的特异有丝分裂原，能促进内皮细胞的增殖、分化，它能够诱导并形成大量新生血管[1]。Viac等[2]发现VEGF在正常皮肤角朊细胞中有低度的表达，而在鳞状细胞癌及病毒性皮肤患者的角朊细胞中其表达明显增高，VEGF的表达与角朊细胞的增殖、分化状态有关。伤口愈合过程中角朊细胞中VEGF表达亦明显升高，体外实验亦证实，多种细胞因子如表皮生长因子(EGF)、角朊细胞生长因子(KGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)等均能上调角朊细胞VEGF的表达，这些细胞因子在伤口愈合中均有表达，VEGF在伤口愈合有重要的作用[3,5]。但伤口愈合后形成的瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕等异常瘢痕角朊细胞VEGF的表达尚未见文献报道。我们应用免疫组化技术，发现瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕组织标本中有较强的VEGF表达，阳性细胞主要位于基底层的角朊细胞，染色颗粒位于细胞质内，真皮内少见阳性细胞；正常皮肤和正常瘢痕角朊细胞VEGF有较弱的表达，无论阳性细胞数目或染色颗粒深度与瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕比较均有显著的差异。本研究亦观察到在瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕的真皮层有大量微血管。我们认为瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕的形成可能与角朊细胞中VEGF过度表达有密切关系。推测其机制，可能为瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕角朊细胞中VEGF通过旁分泌机制作用于血管内皮细胞，在真皮内诱导生成大量新生血管，并能通过某种机制调节成纤维细胞的活性[6]，影响胶原的代谢，这与Detmar等[3]的观点一致。瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕均是伤口过度愈合所形成的异常瘢痕，在这些异常瘢痕组织中存在多量高度增殖活性的角朊细胞，他们有大量的VEGF mRNA[5]表达，加之有组织缺氧[7，8]，而缺氧也可刺激细胞分泌VEGF[9]，因此瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕角朊细胞中VEGF的大量表达，既与角朊细胞的增殖活性程度有关，又与组织细胞缺氧相关。但增殖性瘢痕随着时间的流逝，颜色将渐变浅，质地变软，角朊细胞的增殖活性程度降低，与正常瘢痕组织逐渐接近；而瘢痕疙瘩却出现一种向周围正常组织侵润的特性，角朊细胞仍保持高度的增殖活性，这两种不同转归的机制有待于进一步研究。
, 百拇医药
异常瘢痕的形成受诸多细胞及细胞外基质的影响，本实验应用免疫组化技术证实瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕基底层角朊细胞大量VEGF表达，推测VEGF的高表达在异常瘢痕的形成中具有重要的作用，但其具体作用机制有待于进一步研究。
【参考文献】
[1]Dvorak HF,Brown LF,Detmar M,et al.Vascular permeability factor/ vascular endothelial growth factor,microvascular hyperpermeability,and angiogenesis[J].Am J Pathol,1995,146(5):1029-1039.
[2]Viac J,Palacio S,Schmitt D,et al.Expression of vascular endothelial growth factor in normal epidermis,epithelial tumors and cultured keratinocytes[J].Arch Dermatol Res,1997,289(3):158-163.
, 百拇医药
[3]Detmar M,Yeo KT,Nagy JA,et al.Keratinocyte-derived vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) is a potent mitogen for dermal microvascular endothelial cells[J].J Invest Dermatol,1995,105(1):44-50.
[4]Imoto H,Osaki T,Taga S,et al.Vascular endothelial growth factor expression in non-small-cell lung cancer:prognostic significance in squamous cell carcinoma[J].J Thorac Cardiovasc Surg,1998,115(5):1007 -1014.
, 百拇医药 [5]Frank S,Hubner G,Breier G,et al.Regulation of vascular endothelial growth factor expression in cultured keratinocytes.Implications for normal and impaired wound healing[J].J Biol Chem,1995,270(21):12607-12613.
[6]Garner WL.Epidermal regulation of dermal fibroblast activity[J].Plast Reconstr Surg,1998,102(1):135-139.
[7]Appletori I,Brown NJ,Willoughby DA.Apoptosis,necrosis,and proliferation possible implications in the etiology of keloids[J].Am J Pathol,1996,149(5):1441-1447.
, 百拇医药
[8]Machesney M,Tidman N,Waseem A,et al.Activated keratinocytes in the epidermis of hypertrophic scars[J].Am J Pathol,1998,152(5):1133-1441.
[9]Detmar M,Brown LF,Berse B,et al.Hypoxia regulars the expression of vascular permeability factor/ vascular endothelial growth factor (VPF/VEGF) and its receptors in human skin[J].J Invest Dermatol,1997,108(3):263-268.
【收稿日期】1999-11-23
【修回日期】2000-03-06, 百拇医药