人肝细胞癌放射敏感性与凋亡敏感性体外研究
作者：石卫民 陈龙华
单位：广州，中国人民解放军第一军医大学南方医院放射治疗科 510515
关键词：
中华放射肿瘤学杂志000417 肿瘤细胞的放射敏感性存在很大差异，同一肿瘤的不同细胞株，SF2可相差数十倍。在鼠肿瘤研究中发现，细胞放射反应与照射后凋亡水平具有相关性。那么人肝细胞癌的辐射敏感性怎样，是否与细胞受照射后的凋亡敏感性有关，本研究以3种人肝癌细胞株为模型用体外方法探讨这个问题。
1 材料和方法
1.1 细胞系及照射条件：人肝癌细胞系BEL-7402、QSG-7701、HepG2均为南方医院消化研究所提供。3株细胞均在37℃、5%CO2条件下，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中。细胞处于指数生长期时进行照射(换液后24h)。使用Varian 2100C直线加速器6 MV X线等中心照射，照射野10cm×10cm,剂量率400 cGy/min，照射时培养皿上下各置1.5 cm厚的有机玻璃板。
, 百拇医药
1.2 集落形成实验：处于指数生长期的细胞经质量浓度为2.5g/L胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，按照射剂量将102～105个细胞接种于直径3 cm培养皿中，分别给予2、4、6、8、10 Gy单剂量照射；培养12～14 d后终止培养，甲醇固定，Giemsa染色，镜下计数超过50个细胞的集落；计算细胞存活分数(SF)。每个剂量点设3个平行样品。
1.3 细胞凋亡的形态学分析：培养皿中的细胞照射5 Gy后，在不同时间取出细胞爬片，体积分数为0.04的多聚甲醛固定，HE染色。显微镜下任选3个视野计数200个细胞，计算凋亡细胞比例。
1.4 细胞凋亡流式细胞术分析：培养皿中的细胞照射5 Gy后，在不同时间消化收集细胞，每份样品细胞数105～106个。按文献方法进行PI单染色，流式细胞仪Epics Elite(Coulter Corporation,USA)测定其DNA含量。细胞凋亡时DNA content直方图上出现亚二倍体峰，用流式细胞仪的单参数统计计算其凋亡细胞比例。
, 百拇医药
1.5 统计方法：以上实验均重复3次，取其平均值。应用多靶单击模型[SF=1-(1-e-D/D0)N]计算细胞放射敏感性参数D0、Dq和N值。用SPSS统计软件进行检验。
2 结果
2.1 集落形成实验结果：用集落形成实验结果拟合细胞存活曲线，计算3种细胞株的放射敏感性参数，见表1。
2.2 细胞凋亡率分析结果：3种肝癌细胞株经照射后都出现了特征性的凋亡细胞形态改变。流式细胞术分析结果较镜下计数结果数值略低，但有同样趋势，详见图1。
表1 3种肝癌细胞株的放射敏感性参数比较 细胞系
D0(Gy)
, 百拇医药
Dq(Gy)
N
SF2
HepG2
1.5
0.8
1.8
0.45±0.05*
BEL-7402
1.6
1.3
2.4
, 百拇医药
0.63±0.05*
QSG-7701
1.8
1.6
2.6
0.79±0.07*
注：*经方差分析，F值=46.931，P<0.01
图1 照射后不同时间3种肝癌细胞株的凋亡率比较
3 讨论
近年来基于细胞乃至分子水平的放射生物学研究，使人们越来越清楚地认识到细胞的放射反应性是由基因决定的。现在已有大量的关于肿瘤细胞放射敏感性相关基因的研究报道，涉及较多的基因有p53、C-myc和Bcl-2等。这些基因既与肿瘤细胞照射后的损伤修复及细胞最后的命运紧密联系，有些又是细胞凋亡调控的重要环节。因此，自然有一个问题被提出来：细胞放射敏感性与受照射后细胞凋亡的发生有怎样的关系？本实验用3种人肝癌细胞株进行了初步探讨，并且发现所研究的3种细胞株在照射后的凋亡敏感性与该细胞的放射敏感性相关。HepG2细胞在5 Gy照射后最早出现了凋亡的镜下改变，而它是3种细胞株中放射敏感性最高的；BEL-7402细胞株较迟出现凋亡改变，也具有较低的放射敏感性；最迟出现凋亡反应的是QSG-7701细胞，同时它对X线也表现出最大的抗性。这个结果与一些国外学者的研究结果相似。现在已经知道p53不仅同细胞的放射敏感性密切关联，更对细胞受照后的凋亡反应起决定性的作用。本研究选取的3种人肝癌细胞株均为原发性肝癌手术切除标本传代培养的细胞株，仍具有肝细胞癌的特征，而且这3种细胞株的p53状态相同，都是野生型p53，因此在射线作用后都能够诱发出凋亡现象，并且射线诱导凋亡的敏感性与细胞对射线的放射敏感性是同步的且呈相对应关系。
收稿日期：2000-04-24, 百拇医药
单位：广州，中国人民解放军第一军医大学南方医院放射治疗科 510515
关键词：
中华放射肿瘤学杂志000417 肿瘤细胞的放射敏感性存在很大差异，同一肿瘤的不同细胞株，SF2可相差数十倍。在鼠肿瘤研究中发现，细胞放射反应与照射后凋亡水平具有相关性。那么人肝细胞癌的辐射敏感性怎样，是否与细胞受照射后的凋亡敏感性有关，本研究以3种人肝癌细胞株为模型用体外方法探讨这个问题。
1 材料和方法
1.1 细胞系及照射条件：人肝癌细胞系BEL-7402、QSG-7701、HepG2均为南方医院消化研究所提供。3株细胞均在37℃、5%CO2条件下，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中。细胞处于指数生长期时进行照射(换液后24h)。使用Varian 2100C直线加速器6 MV X线等中心照射，照射野10cm×10cm,剂量率400 cGy/min，照射时培养皿上下各置1.5 cm厚的有机玻璃板。
, 百拇医药
1.2 集落形成实验：处于指数生长期的细胞经质量浓度为2.5g/L胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，按照射剂量将102～105个细胞接种于直径3 cm培养皿中，分别给予2、4、6、8、10 Gy单剂量照射；培养12～14 d后终止培养，甲醇固定，Giemsa染色，镜下计数超过50个细胞的集落；计算细胞存活分数(SF)。每个剂量点设3个平行样品。
1.3 细胞凋亡的形态学分析：培养皿中的细胞照射5 Gy后，在不同时间取出细胞爬片，体积分数为0.04的多聚甲醛固定，HE染色。显微镜下任选3个视野计数200个细胞，计算凋亡细胞比例。
1.4 细胞凋亡流式细胞术分析：培养皿中的细胞照射5 Gy后，在不同时间消化收集细胞，每份样品细胞数105～106个。按文献方法进行PI单染色，流式细胞仪Epics Elite(Coulter Corporation,USA)测定其DNA含量。细胞凋亡时DNA content直方图上出现亚二倍体峰，用流式细胞仪的单参数统计计算其凋亡细胞比例。
, 百拇医药
1.5 统计方法：以上实验均重复3次，取其平均值。应用多靶单击模型[SF=1-(1-e-D/D0)N]计算细胞放射敏感性参数D0、Dq和N值。用SPSS统计软件进行检验。
2 结果
2.1 集落形成实验结果：用集落形成实验结果拟合细胞存活曲线，计算3种细胞株的放射敏感性参数，见表1。
2.2 细胞凋亡率分析结果：3种肝癌细胞株经照射后都出现了特征性的凋亡细胞形态改变。流式细胞术分析结果较镜下计数结果数值略低，但有同样趋势，详见图1。
表1 3种肝癌细胞株的放射敏感性参数比较 细胞系
D0(Gy)
, 百拇医药
Dq(Gy)
N
SF2
HepG2
1.5
0.8
1.8
0.45±0.05*
BEL-7402
1.6
1.3
2.4
, 百拇医药
0.63±0.05*
QSG-7701
1.8
1.6
2.6
0.79±0.07*
注：*经方差分析，F值=46.931，P<0.01
图1 照射后不同时间3种肝癌细胞株的凋亡率比较
3 讨论
近年来基于细胞乃至分子水平的放射生物学研究，使人们越来越清楚地认识到细胞的放射反应性是由基因决定的。现在已有大量的关于肿瘤细胞放射敏感性相关基因的研究报道，涉及较多的基因有p53、C-myc和Bcl-2等。这些基因既与肿瘤细胞照射后的损伤修复及细胞最后的命运紧密联系，有些又是细胞凋亡调控的重要环节。因此，自然有一个问题被提出来：细胞放射敏感性与受照射后细胞凋亡的发生有怎样的关系？本实验用3种人肝癌细胞株进行了初步探讨，并且发现所研究的3种细胞株在照射后的凋亡敏感性与该细胞的放射敏感性相关。HepG2细胞在5 Gy照射后最早出现了凋亡的镜下改变，而它是3种细胞株中放射敏感性最高的；BEL-7402细胞株较迟出现凋亡改变，也具有较低的放射敏感性；最迟出现凋亡反应的是QSG-7701细胞，同时它对X线也表现出最大的抗性。这个结果与一些国外学者的研究结果相似。现在已经知道p53不仅同细胞的放射敏感性密切关联，更对细胞受照后的凋亡反应起决定性的作用。本研究选取的3种人肝癌细胞株均为原发性肝癌手术切除标本传代培养的细胞株，仍具有肝细胞癌的特征，而且这3种细胞株的p53状态相同，都是野生型p53，因此在射线作用后都能够诱发出凋亡现象，并且射线诱导凋亡的敏感性与细胞对射线的放射敏感性是同步的且呈相对应关系。
收稿日期：2000-04-24, 百拇医药