二次放射促进p14ARF诱导的低再群体化肺癌细胞凋亡
作者：胡义德 高楠 曹晓运 李栋良 张凤坤 曹世龙
单位：胡义德(重庆,中国人民解放军第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所 400037)；高楠 曹晓运 李栋良 张凤坤 曹世龙 上海医科大学肿瘤医院放射治疗科 200032)
关键词：
中华放射肿瘤学杂志000416 抑癌蛋白p14ARF是细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)抑制蛋白(p16INK4a)可变读框基因(ARF)编码的产物，具有显著的细胞周期抑制效应。本实验在前期研究证实了p14ARF可抑制肺癌细胞放射后加速再群体化(accelerated repopulation)的基础上，对p14ARF诱导的低再群体化肺癌细胞实施2次放射打击，观察细胞凋亡变化。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 载体和细胞系：选pCI-neo-p14ARF为人p14ARF真核表达载体，用存在ARF基因原发纯合缺失但表达野生型p53的人肺腺癌A549和H460细胞系为靶细胞。
1.2 放射线处理：采用180kV X线，空气中、室温照射，源皮距40?cm，照射面积10?cm×15?cm，剂量率162?cGy/min。
1.3 潜在倍增时间(Tpot)测定：按Patterson方法计算细胞在对数增殖期的群体倍增时间Td。再按Nias公式：Tpot＝Td*(1-Φ)计算，细胞丢失因子Φ=1-活细胞比率。活细胞比率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)。
1.4 克隆存活率测定：按1×103细胞/孔,将各种状态下的细胞接种于6孔培养板中培养21?d,倒置显微镜下计数≥50个细胞的克隆个数，计算克隆存活率(%)。
, 百拇医药
1.5 基因转染：在6孔细胞培养板中，每孔接种3×105细胞，培养达到60%饱和密度。给予6?Gy的X线一次性照射，照射后96?h时间点处用Fugene 6基因转染试剂盒(宝灵曼公司)进行基因转染。经转染的细胞培养48?h后换培养液，加入G418(宝灵曼公司)，使其终浓度为400?μg/mL,筛选21?d，挑取阳性克隆，行免疫组织化学、Tpot检测。
1.6 2次放射：转染后48?h再给予6?Gy X线一次性放射，48?h后进行凋亡率和克隆存活率检测。
1.7 细胞周期分布、凋亡率检测：流式细胞仪常规方法检测。
1.8 统计学处理：采用t检验。
2 结果
2.1 放射后ARF基因转染引起肺癌细胞Tpot、凋亡率及克隆形成率的变化：结果显示，在放射后未转染和空载体转染A549和H460细胞Tpot缩短的同时，与放射前比较，两细胞的克隆存活率下降(P<0.01)，但凋亡率增加均不显著(P>0.05)；放射后ARF基因转染A549和H460细胞Tpot均延长并接近放射前水平,与放射后未转染和空载体转染A549和H460细胞比较，克隆存活率进一步下降(P<0.05)，凋亡率亦显著增加(P<0.05)。详见表1。
, http://www.100md.com
2.2 2次放射打击引起p14ARF诱导的低再群体化肺癌细胞凋亡率及克隆存活率变化：结果显示，经2次放射打击后凋亡率非常显著地增加(P<0.01)，而克隆存活率均非常显著地下降(P<0.01)。详见表2。
3 讨论
细胞凋亡是肿瘤放射治疗的重要生物学效应之一。然而，放射后克隆源性肿瘤细胞的加速再群体化是基础和临床研究中较为常见的现象，由于它的出现，使肿瘤细胞群显示出明显的辐射抗性特性。本研究发现，ARF基因转染并恢复p14ARF的功能，可明显减少加速再群体化，与此同时，可一定程度地增加凋亡。而缺失p14ARF功能者，放射后Tpot明显缩短，加速再群体化显著，凋亡发生率较低，表明放射后低凋亡率与加速再群体化密切相关。对p14ARF功能已恢复的细胞进行2次放射打击结果显示，凋亡率显著增加，克隆存活率显著下降，表明2次放射可促进p14ARF诱导的低再群体化A549和H460细胞凋亡。此效应可能与p14ARF对p53的正调控作用密切相关。
, 百拇医药
表1 放射后ARF基因转染引起肺癌细胞Tpot、凋亡率及克隆存活率的变化 (
±s，n=3) 分 组
A549细胞
Tpot(h) 凋亡率(%) 克隆存活率(%)
A460细胞
Tpot(h) 凋亡率(%) 克隆存活率(%)
0?Gy
26.9±2.2
4.6±0.5
69.4±5.4
, 百拇医药
24.4±1.6
3.6±0.4
64.3±4.7
6?Gy
20.1±1.7
7.6±0.5
32.6±3.7
17.6±1.5
5.9±0.6
30.4±4.2
6?Gy+pCI-neo
20.9±1.9
, http://www.100md.com
8.2±1.4
30.3±2.5
16.7±1.4
5.4±1.3
31.8±2.6
6?Gy+ARF
26.3±1.8
21.4±2.2
23.8±2.6
22.9±2.7
12.2±1.1
24.3±3.7
, http://www.100md.com
表2 2次放射打击引起p14ARF诱导的低再群体化肺癌细胞凋亡及克隆存活率变化(
±s，n=3) 分 组
A549细胞
凋亡率(%) 克隆存活率(%)
A460细胞
凋亡率(%) 克隆存活率(%)
0?Gy+6?Gy
7.3±0.6
33.4±5.3
6.6±0.7
, http://www.100md.com
34.1±4.3
6?Gy+6?Gy
17.6±1.5
22.3±3.4
14.9±1.6
20.4±3.2
6?Gy+pCI-neo+6?Gy
15.2±1.8
20.3±2.6
16.5±1.9
21.3±2.6
6?Gy+ARF + 6?Gy
52.4±4.2
8.8±1.6
48.6±5.1
7.4±0.7
基金项目：上海市科技发展基金资助项目(974119037)收稿日期：2000-01-16, http://www.100md.com
单位：胡义德(重庆,中国人民解放军第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所 400037)；高楠 曹晓运 李栋良 张凤坤 曹世龙 上海医科大学肿瘤医院放射治疗科 200032)
关键词：
中华放射肿瘤学杂志000416 抑癌蛋白p14ARF是细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)抑制蛋白(p16INK4a)可变读框基因(ARF)编码的产物，具有显著的细胞周期抑制效应。本实验在前期研究证实了p14ARF可抑制肺癌细胞放射后加速再群体化(accelerated repopulation)的基础上，对p14ARF诱导的低再群体化肺癌细胞实施2次放射打击，观察细胞凋亡变化。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 载体和细胞系：选pCI-neo-p14ARF为人p14ARF真核表达载体，用存在ARF基因原发纯合缺失但表达野生型p53的人肺腺癌A549和H460细胞系为靶细胞。
1.2 放射线处理：采用180kV X线，空气中、室温照射，源皮距40?cm，照射面积10?cm×15?cm，剂量率162?cGy/min。
1.3 潜在倍增时间(Tpot)测定：按Patterson方法计算细胞在对数增殖期的群体倍增时间Td。再按Nias公式：Tpot＝Td*(1-Φ)计算，细胞丢失因子Φ=1-活细胞比率。活细胞比率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)。
1.4 克隆存活率测定：按1×103细胞/孔,将各种状态下的细胞接种于6孔培养板中培养21?d,倒置显微镜下计数≥50个细胞的克隆个数，计算克隆存活率(%)。
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1.5 基因转染：在6孔细胞培养板中，每孔接种3×105细胞，培养达到60%饱和密度。给予6?Gy的X线一次性照射，照射后96?h时间点处用Fugene 6基因转染试剂盒(宝灵曼公司)进行基因转染。经转染的细胞培养48?h后换培养液，加入G418(宝灵曼公司)，使其终浓度为400?μg/mL,筛选21?d，挑取阳性克隆，行免疫组织化学、Tpot检测。
1.6 2次放射：转染后48?h再给予6?Gy X线一次性放射，48?h后进行凋亡率和克隆存活率检测。
1.7 细胞周期分布、凋亡率检测：流式细胞仪常规方法检测。
1.8 统计学处理：采用t检验。
2 结果
2.1 放射后ARF基因转染引起肺癌细胞Tpot、凋亡率及克隆形成率的变化：结果显示，在放射后未转染和空载体转染A549和H460细胞Tpot缩短的同时，与放射前比较，两细胞的克隆存活率下降(P<0.01)，但凋亡率增加均不显著(P>0.05)；放射后ARF基因转染A549和H460细胞Tpot均延长并接近放射前水平,与放射后未转染和空载体转染A549和H460细胞比较，克隆存活率进一步下降(P<0.05)，凋亡率亦显著增加(P<0.05)。详见表1。
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2.2 2次放射打击引起p14ARF诱导的低再群体化肺癌细胞凋亡率及克隆存活率变化：结果显示，经2次放射打击后凋亡率非常显著地增加(P<0.01)，而克隆存活率均非常显著地下降(P<0.01)。详见表2。
3 讨论
细胞凋亡是肿瘤放射治疗的重要生物学效应之一。然而，放射后克隆源性肿瘤细胞的加速再群体化是基础和临床研究中较为常见的现象，由于它的出现，使肿瘤细胞群显示出明显的辐射抗性特性。本研究发现，ARF基因转染并恢复p14ARF的功能，可明显减少加速再群体化，与此同时，可一定程度地增加凋亡。而缺失p14ARF功能者，放射后Tpot明显缩短，加速再群体化显著，凋亡发生率较低，表明放射后低凋亡率与加速再群体化密切相关。对p14ARF功能已恢复的细胞进行2次放射打击结果显示，凋亡率显著增加，克隆存活率显著下降，表明2次放射可促进p14ARF诱导的低再群体化A549和H460细胞凋亡。此效应可能与p14ARF对p53的正调控作用密切相关。
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表1 放射后ARF基因转染引起肺癌细胞Tpot、凋亡率及克隆存活率的变化 (
±s，n=3) 分 组A549细胞
Tpot(h) 凋亡率(%) 克隆存活率(%)
A460细胞
Tpot(h) 凋亡率(%) 克隆存活率(%)
0?Gy
26.9±2.2
4.6±0.5
69.4±5.4
, 百拇医药
24.4±1.6
3.6±0.4
64.3±4.7
6?Gy
20.1±1.7
7.6±0.5
32.6±3.7
17.6±1.5
5.9±0.6
30.4±4.2
6?Gy+pCI-neo
20.9±1.9
, http://www.100md.com
8.2±1.4
30.3±2.5
16.7±1.4
5.4±1.3
31.8±2.6
6?Gy+ARF
26.3±1.8
21.4±2.2
23.8±2.6
22.9±2.7
12.2±1.1
24.3±3.7
, http://www.100md.com
表2 2次放射打击引起p14ARF诱导的低再群体化肺癌细胞凋亡及克隆存活率变化(
±s，n=3) 分 组A549细胞
凋亡率(%) 克隆存活率(%)
A460细胞
凋亡率(%) 克隆存活率(%)
0?Gy+6?Gy
7.3±0.6
33.4±5.3
6.6±0.7
, http://www.100md.com
34.1±4.3
6?Gy+6?Gy
17.6±1.5
22.3±3.4
14.9±1.6
20.4±3.2
6?Gy+pCI-neo+6?Gy
15.2±1.8
20.3±2.6
16.5±1.9
21.3±2.6
6?Gy+ARF + 6?Gy
52.4±4.2
8.8±1.6
48.6±5.1
7.4±0.7
基金项目：上海市科技发展基金资助项目(974119037)收稿日期：2000-01-16, http://www.100md.com