人乳头瘤病毒与P53协同致膀胱移行细胞癌关系的研究
作者：陈廷 孔庆胜 曹卉 衣美英 李秀真 朱伟 刘昌平 山长武
单位：陈廷 曹卉 衣美英 李秀真 朱伟 刘昌平 山长武(济宁医学院病毒室 济宁 272113)；孔庆胜(生化研究室)
关键词：乳头状瘤病毒；人；膀胱移行细胞癌；基因；聚合酶链反应；病毒蛋白质类
中华实验和临床病毒学杂志000411 【摘要】 目的 研究人类乳头瘤病毒(HPV)6、11、16和18型及P53与膀胱移行细胞癌的关系。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法检测了75例膀胱移行细胞癌组织中HPV的感染，免疫组化SP法检测P53蛋白表达情况。结果 膀胱移行细胞癌组织中HPV6、11、16和18的阳性率分别为6.7%(5/75)，5.3%(4/75)，33.3%(25/75)和6.7%(5/75)。低危型HPV(6或11)阳性率为9.3%(7/75)，高危型HPV(16或18)阳性率为34.7%(26/75)。同一膀胱癌组织中两种以上(包括两种)HPV亚型感染8例，占10.6%。HPV6、16和18型之间感染阳性率在肿瘤有无转移组中差异显著(P<0.05)，HPV16、18的阳性率在肿瘤病理分级中差异有极显著性(P<0.01)。HPV DNA型别的分布在膀胱癌中以16型为主。P53蛋白在膀胱移行细胞癌组织中的阳性表达率为44%。结论 高危型HPV感染与膀胱癌发生有关。
, 百拇医药
The study on relation of human papillomavirus and P53 expression with bladder transitional cell carcinoma
CHEN Ting, KONG Qingsheng,CAO Hui
(Department of Virology, Jining Medical College,Jining 272113,China)
【Abstract】 Objective To study the relationship between the bladder transitional cell carcinoma and the human papillomavirus (HPV) types 6,11,16,18 and P53.Methods We used polymerase chain reaction (PCR) to test HPV type 6,11,16 and 18 infection from 75 cases of bladder cancer, and used immunohistochemisty method to detect P53 expression. Results The positive rates of HPV types 6,11,16 and 18 were 6.7%,5.3%,33.3% and 6.7%,respectively. The positive rate of low risk HPV type (6/11) was 9.3%(7/75), and that of high risk HPV types (16/18) was 34.7% (26/75). There were 8 cases with two or three HPV types mixed infection,accounting for 10.6%, HPV types 6,11,16,18 in tumor metastasis group were significantly higher than that in non-metastasis group. The positive rates of HPV 16,18 types in G3 were significantly higher than that in G1 and G2. HPV type 16 was the main type in bladder cancer. Positive rate of P53 expression was 44%. Conclusion These results implicated that the occurrence and development of bladder transitional cell carcinoma may be closely related to the high risk HPV type infection and P53 expression.
, 百拇医药
【Key words】 Papillomavirus,human ; Bladder transitional cell carcinoma; Genes; Polymerase chain reaction; P53 protein
人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染可能与膀胱癌发生有密切的关系。P53蛋白是一种抑癌基因，但发生突变后可转变为癌基因，已知HPV与P53蛋白协同与多种肿瘤发生可能有关。我们采用PCR和免疫组化方法对膀胱移行细胞癌组织进行HPV和P53蛋白检测，探讨HPV及P53与膀胱癌之间的关系。
1 材料和方法
1.1 病例资料 收集临沂市肿瘤医院1988～1997年间手术切除膀胱移行细胞癌标本75例。其中男62例，女13例，年龄24～81岁，平均年龄58.5岁。标本经10%多聚甲醛液固定，常规切片(厚3～5 μm)，每份标本共切11张，10张做PCR，另1张做免疫组化。肿瘤分期按国际抗癌联盟原发肿瘤、淋巴结及远处转移(UIC.TNM)标准，病理分级按WHO标准，G1 19例、G2 31例、G3 25例。表浅性肿瘤Tis(原位)-T1(器官内)47例、浸润性肿瘤T2(器官外)-T4(远处转移)28例；有淋巴结远处转移者15例，无淋巴结及远处转移者60例。另取10例正常膀胱粘膜标本作对照。
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1.2 PCR引物及来源 HPV6、11引物参照Pao等〔1〕的设计，HPV16、18引物参照Maki等〔2〕的设计，序列见表1。
表1 HPV型特异性引物及PCR扩增产物
Tab.1 Primers for HPV DNA amplification HPV and the PCR products HPV型别
HPV type
引物序列(5′→3′)
Primer sequence (5′ to 3′)
扩增片段(bp)
Length of
, 百拇医药
amplified DNA
HPV 6
AGACCAGTTGTGCAAGACGTTTAA
263
GCACGTCTAAGATGTCTTGTTTAG
HPV 11
AGACCAGTTGTGCAAGACGTTTAA
144
AAGGGAAAGTTGTCTCGCCACACA
HPV 16
AGCTCAGAGGAGGAGGATGA
, 百拇医药
203
GGTTTCTGAGAACAGATGGG
HPV 18
GAGCCCCAAAATGAAATTCC
244
CAAAGGACAGGGTGTTCAGA
1.3 PCR模板DNA的制备 标本首先对照光镜形态，用刀片最大程度去除癌组织中的正常组织成分。切片10张(5 μm)置Eppendorf管中，经二甲苯脱蜡2次，无水乙醇漂洗、沉淀凉干后加入100 μl消化液(50 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,0.5% Tween-20,100 μg/ml蛋白酶K)50℃浴2 h，最后100℃煮沸10 min，取上清作PCR模板DNA，免去酚、氯仿抽提等步骤。
, 百拇医药
1.4 PCR扩增 反应体系为25 μl，在0.5 ml离心管中依次加入5×反应缓冲液5 μl，200 μmmol/L dNTP 2.5 μl,型特异性引物对1 μl(20 μmol/L)，高纯10.5 μl，模板DNA 5 μl混匀后于94℃预变性10 min，加Taq DNA聚合酶1 μl(0.5 U/μl)，覆盖灭菌石蜡油25 μl进行PCR扩增。循环参数：94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个周期后终止反应。另外以HPV6、11、16和18 DNA克隆片段为阳性对照模板；阴性对照以灭菌生理盐水代替DNA，同时进行扩增。
1.5 扩增产物鉴定 扩增产物与上样缓冲液(含溴酚蓝，聚蔗糖)混匀后取10 μl行2.5%琼3脂凝胶电泳，时间30 min，紫外线检测仪上检测结果，若有与上述扩增片段相应的特异放大带即为阳性。
1.6 P53蛋白的检测 P53蛋白检测采用免疫组化SP法。P53(克隆Do7)单克隆抗体为美国Maxim公司产品，SP试剂盒为美国Zymed公司产品(购自武汉博士德生物公司)。实验步骤按试剂盒说明书进行，特异性第一抗体原液按1∶50稀释，阴性对照为用磷酸盐缓冲液代替特异性第一抗体；阳性对照为肺癌阳性切片。对染色阳性细胞，高倍镜下选择10个有代表性的视野计数；每个视野计100个肿瘤细胞，阳性细胞数0为(-)，占肿瘤细胞数15%以下为(+)，15%～30%为()，31%～50%为()，≥50%为()；(+)～()为低表达，()～()为高表达。
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1.7 统计学处理 所得数据采用χ2检验。
2 结果
2.1 膀胱癌标本和正常膀胱组织HPV DNA的PCR扩增结果 75例膀胱移行细胞癌石蜡包埋组织经型特异性引物扩增后，出现与阳性对照相符合的共39例，HPV DNA总阳性率为52%(39/75)。10例正常膀胱组织HPV DNA检出率为10%(1/10)，经统计学处理，两者差异有显著性意义(P<0.05)。见表2。
表2 两组膀胱组织HPV DNA的检测结果
Tab.2 Detectionof HPV DNA in different bladder tissue specimens by PCR 病理诊断Diagnosis
例数
, 百拇医药
Cases
HPV DNA阳性数
HPV DNA positive no. in different bladder tissue
阳性率
Positive rates
6
11
16
18
双重*
Dual infection*
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三重**
Triple infection**
膀胱移行细胞癌
Bladder transitional cell carcinoma
75
5
4
25
5
5
3
52%(39/75)△
, 百拇医药
正常膀胱组织
Normal bladder tissue
10
1
10%(1/10)
*：包括HPV 6+11(1例)，HPV 6+16(1例)，HPV11+16(1例)，HPV 16+18(2例)。**：包括HPV 6+11+16(1例)，HPV 6+16+18(1例)，HPV 11+16+18(1例)
*：Including HPV 6+11 (n=1),HPV 6+16 (n=1),HPV 11+16 (n=1),HPV 16+18(n=2),**：HPV 6+11+16 (n=1)，HPV 6+16+18 (n=1)，HPV 11+16+18 (n=1).△： χ2＝6.247 5，P<0.052.2 膀胱癌组织中HPV型别分布情况 75例膀胱移行细胞癌组织中，HPV阳性共39例，其中HPV 6型单独阳性例数5例，阳性率6.7%；HPV 11型单独阳性例数4例，阳性率5.3%；低危型HPV 6型或11型合计阳性(只计其中一项)例数7例，阳性率为9.3%；HPV 16型单独阳性例数为25例，阳性率33.3%(25/75)，HPV 18型单独阳性例数5例，阳性率为6.7%(5/75)，高危型HPV 16或18型合计阳性(只计其中一项)例数26例，阳性率34.7%。高危型HPV(16或18)与低危型HPV(6或11)在膀胱移行细胞癌组织中阳性率比较，经统计学处理，两者差异有非常显著性(P<0.005)，见表3。表3 高危型和低危型HPV与膀胱移行细胞癌的关系
, 百拇医药
Tab.3 The relationship of high risk HPV type and low risk
HPV type with bladder transitional cell carcinoma 组 别
Group
(16/18)
HPV DNA阳性数
HPV DNA positive no.
HPV DNA阳性率
HPV DNA positive rate
6
, 百拇医药
11
16
18
高危型HPV
High risk HPV type
25
1
34.7%(26/75)*
低危型HPV)
Low risk HPV type
5
2
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9.3%(7/75)
*：与低危型HPV比较，χ2＝17.37，P<0.005
*：Compared with the low risk HPV type,χ2＝17.37，P<0.005
2.3 HPV感染与肿瘤分级、分期和转移的关系 见表4。
2.4 P53蛋白表达与膀胱癌的关系 P53在正常膀胱组织中阴性表达，P53阳性表达为棕黄色或棕褐色的核染色。见图版ⅠC。75例膀胱移行细胞癌中P53蛋白阳性表达率为44%(33/75)，G1～G3组P53阳性率分别为36.8%(7/19)，38.7%(12/31)和56.0%(14/25)，三者比较，差异无显著性(P>0.05)；Tis-T1期阳性率为31.9%(15/47)，T2～T4期为64.3%(18/28)，两者比较，差异有非常显著性意义(P<0.01)；有淋巴结及远处转移组P53阳性率为66.7%(10/15)，无转移组为38.3%(23/60)，两者比较，差异有显著性意义(P<0.05)，见表4。
, 百拇医药
2.5 HPV感染与P53蛋白表达之间的关系 75例膀胱癌组织，HPV6型单独阳性5例中，P53无一例阳性；HPV 11单独4例阳性中，P53阳性1例，阳性率为25%；HPV 16单独25例阳性中，P53 23例阳性，阳性率为92%；HPV 18单独阳性5例中，P53阳性2例，阳性率为40%。经统计学处理，四组之间差异有极显著性意义(P<0.005)。见表5。
3 讨论
HPV是人类经常感染的病毒，已知HPV有70多种型别，可分为高危性HPV和低危型HPV，高危型病毒常见的有6、18、33、35等多种型别。与人类肿瘤发生有密切的关系。HPV感染的型别也存在着种族、环境、地区、生活习惯的差异。本研究采用高敏感性PCR方法检测HPV，检出率为52%，与文献报道基本一致〔3〕。
HPV的致癌机制目前尚不清楚，有证据表明，HPV早期区激活，编码产生一系列致癌蛋白如E6、E7蛋白。其中高危型HPV的E6蛋白能够干扰抑癌基因P53的翻译转化功能，并使P53经过辅酶Q途径降解失活加快，P53在细胞内的半衰期下降2～4倍〔4〕。因此E6蛋白对P53的灭活降解必然导致细胞生活周期失控，导致肿瘤发生〔5〕。由此可见，HPV的感染是膀胱肿瘤发生的重要因素之一。
, 百拇医药
表4 75例肿瘤病理分级、临床分期及转移与HPV的关系
Tab.4 The correlation of the tumor pathological grade,clinic stage and metastasis in 75
bladder transitional cell carcinoma patients with HPV 组别
Grouping
例数
Cases
阳性数(阳性率)
Positive no.(Positive rate)
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P53
HPV 6
HPV 11
HPV 16
HPV18
G1
19
7(36.8)
3(15.8)
2(10.5)
15(78.9)***
4(21.1)**
, 百拇医药
G2
31
12(38.7)
1(3.2)
1(3.2)
7(22.6)***
1(3.2)**
G3
25
14(56.0)
1(3.2)
1(3.2)
, 百拇医药
3(9.7)***
0(0)**
Tis-T1
47
15(31.9)
4(8.5)
3(6.4)
16(34)
3(11.1)
T2-T4
28
18(64.3)**
, 百拇医药
1(3.6)
1(3.6)
9(32.1)
2(7.1)
转 移
Metastasis
+
15
10(66.7)*
3(20)*
2(13.3)
10(66.7)**
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4(26.7)***
-
60
23(38.3)
2(3.3)
2(3.3)
15(25)
1(1.7)
* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.05表5 HPV感染与P53蛋白表达间的关系
Tab.5 The relationship between HPV infection
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and P53 gene expression HPV分型
HPV types
例数
Cases
P53蛋白阳性例数/阳性率(%)
P53 positive no./Positive rate(%)
HPV 6
5
0/0
HPV 11
4
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1/25
HPV 16
25
23/92
HPV 18
5
2/40
合计
Total
39
26/66.7
χ2＝21.94，P<0.005
, 百拇医药 本研究检测结果显示，在膀胱移行细胞癌和正常对照组中HPV阳性率存在显著性差异(P<0.05)。说明膀胱移行细胞癌的发生与HPV感染有密切联系。以HPV 16阳性率最高达33.3%，说明HPV 16型与膀胱癌的关系最为密切。而HPV 6、11、18型阳性率差异不大。通常认为，HPV 16、18是高危型致癌病毒。可导致感染细胞增生和恶性转化；而HPV 6、11为低危型病毒，多在生殖器疣、喉乳头状瘤等良性病变中。我们的研究印证了这一结果。在本组研究中，高危型HPV(16/18)在膀胱癌中的阳性率为34.7%，而低危型HPV 6/11阳性率为9.3%(P<0.05)，说明高危型HPV与膀胱肿瘤的发生关系极为密切。研究还发现，膀胱移行细胞癌中存在多重HPV感染(包括感染两种或两种以上型别)8例。可能说明多重感染在病毒整合到癌细胞基因中，发挥着一定的协同、促进作用。研究还显示，HPV阳性的39例中，P53蛋白表达26例，阳性表达率达66.7%(26/39)，与无HPV阳性组(7例)相比，差异有非常显著性(P<0.005)，说明HPV感染与p53突变有密切相关性。在HPV阳性组中，以HPV 16组P53阳性率最高达92%(23/25)，说明HPV 16对P53影响作用最大。其次为HPV 18。四组相比，有极显著性差异(P<0.05)，HPV DNA与P53的存在呈负相关性，HPV阳性表达率随着病理分极和临床分期的上升而降低，而P53蛋白阳性率却正好相反。HPV 16/18E6蛋白可与P53结合，使P53基因对正常细胞的负性调节作用丧失，利于细胞无限制生长、增生，引起肿瘤。而高危型HPV E6蛋白对P53的灭活作用包括野 生型和部分突变型p53。Martin等〔6〕用联合免疫沉淀检测突变的P53与E6蛋白的结合力。发现不同部位点突变的P53与E6蛋白的结合力有显著性差异，其中以273-RL的点突变P53才能表现出HPV与P53双阳性。这个现象对肿瘤的发展有着不可忽视的意义。P53点突变与肿瘤的恶性程度呈正相关，并且P53的过表达在许多情况下是肿瘤组织继发的中晚期基因事件之一〔7〕，是肿瘤向恶性程度增高方向进展的特征之一。本实验可见HPV感染的肿瘤组织以低病理分级和Tis-T1期肿瘤组织为主，与Musdtuo等〔8〕的发现相似。若HPV与P53同时阳性，则显示预后较差。因此，高危型HPV的感染后E6蛋白和P53基因产物的相互作用是膀胱癌发生发展过程中的一个重要基因事件。对膀胱癌的预后有着极期重要的意义。
, 百拇医药
感染病毒的NIH3T3细胞上LMP2蛋白的表达 A:阳性细胞； B: 阴性对照
Detection of the expressed LMP2 by IF test on NIH3T3 cells
A:Expressed LMP2 protein on virus infected NIH3T3 cells B:Negative control,the IF test of normal NIH3T3 cells
图版 ⅠC 陈廷等.人乳头瘤病毒与P 53协同致膀胱移行细胞癌关系的研究
Plate ⅠC CHEN Ting,et al.The study of relation of human papillomavirus and P 53 expression with bladder transitional cell carcinoma
, 百拇医药
(Original article on p.345)
本课题受山东省自然基金会项目资助(Y95C0931)
参 考 文 献
1，Pao CC,Lin CY,Maa JS,et al.Detection of human papillomavirus in cervico-vaginal cell using polymerase chain reaction. J Infect Dis,1990,161：113-117.
2，Maki H,Saito S,Ibaraki T,et al.Use of universal and type specific primers in the polymerase chain reaction for the detection and typing of genital human papillomaviruses Jpn J Cancer Res,1991,82：411-415.
, http://www.100md.com
3，Anwar K,Naiki H,Nakaruki K,et al.High frequency of human papillomavirus infection in carcinoma of the urinary bladder. Cancer,1992,70：1967-1971.
4，Lechmer M,Mack DH,Mack DH,et al.Human papillomavirus E6 proteins bind P53 in vivo and abrogate P53 mediated repression of transcription. EMBO J,1992,11：3045-3049.
5，Karen V.Interaction of human papillomavirus transforming protein with the products of tumor suppressor genes. FASEB,1993,7：872-876.
, http://www.100md.com
6，Martin S,Takashi T,Jon NH,et al.Interaction of the human papillomavirus type 16 E6 oncoprotein with wild-type and mutant P53 protein. J Virol,1992,66：5100-5106.
7，Fujimoto K,Yameta Y,Orajima F,et al.Frequent association of P53 gene mutation in invasive bladder cancer. Cancer Res,1992,52：1393-1397.
8，Mutsuo F,Keiji I,Yuji O,et al.High-risk human papillomavirus infections and overexpression of P53 protein as prognostic indicators in transitional cell carcinoma of the urinary bladder.Cancer Res,1993,53：4823-4826.
(收稿日期：2000-02-14)
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单位：陈廷 曹卉 衣美英 李秀真 朱伟 刘昌平 山长武(济宁医学院病毒室 济宁 272113)；孔庆胜(生化研究室)
关键词：乳头状瘤病毒；人；膀胱移行细胞癌；基因；聚合酶链反应；病毒蛋白质类
中华实验和临床病毒学杂志000411 【摘要】 目的 研究人类乳头瘤病毒(HPV)6、11、16和18型及P53与膀胱移行细胞癌的关系。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法检测了75例膀胱移行细胞癌组织中HPV的感染，免疫组化SP法检测P53蛋白表达情况。结果 膀胱移行细胞癌组织中HPV6、11、16和18的阳性率分别为6.7%(5/75)，5.3%(4/75)，33.3%(25/75)和6.7%(5/75)。低危型HPV(6或11)阳性率为9.3%(7/75)，高危型HPV(16或18)阳性率为34.7%(26/75)。同一膀胱癌组织中两种以上(包括两种)HPV亚型感染8例，占10.6%。HPV6、16和18型之间感染阳性率在肿瘤有无转移组中差异显著(P<0.05)，HPV16、18的阳性率在肿瘤病理分级中差异有极显著性(P<0.01)。HPV DNA型别的分布在膀胱癌中以16型为主。P53蛋白在膀胱移行细胞癌组织中的阳性表达率为44%。结论 高危型HPV感染与膀胱癌发生有关。
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The study on relation of human papillomavirus and P53 expression with bladder transitional cell carcinoma
CHEN Ting, KONG Qingsheng,CAO Hui
(Department of Virology, Jining Medical College,Jining 272113,China)
【Abstract】 Objective To study the relationship between the bladder transitional cell carcinoma and the human papillomavirus (HPV) types 6,11,16,18 and P53.Methods We used polymerase chain reaction (PCR) to test HPV type 6,11,16 and 18 infection from 75 cases of bladder cancer, and used immunohistochemisty method to detect P53 expression. Results The positive rates of HPV types 6,11,16 and 18 were 6.7%,5.3%,33.3% and 6.7%,respectively. The positive rate of low risk HPV type (6/11) was 9.3%(7/75), and that of high risk HPV types (16/18) was 34.7% (26/75). There were 8 cases with two or three HPV types mixed infection,accounting for 10.6%, HPV types 6,11,16,18 in tumor metastasis group were significantly higher than that in non-metastasis group. The positive rates of HPV 16,18 types in G3 were significantly higher than that in G1 and G2. HPV type 16 was the main type in bladder cancer. Positive rate of P53 expression was 44%. Conclusion These results implicated that the occurrence and development of bladder transitional cell carcinoma may be closely related to the high risk HPV type infection and P53 expression.
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【Key words】 Papillomavirus,human ; Bladder transitional cell carcinoma; Genes; Polymerase chain reaction; P53 protein
人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染可能与膀胱癌发生有密切的关系。P53蛋白是一种抑癌基因，但发生突变后可转变为癌基因，已知HPV与P53蛋白协同与多种肿瘤发生可能有关。我们采用PCR和免疫组化方法对膀胱移行细胞癌组织进行HPV和P53蛋白检测，探讨HPV及P53与膀胱癌之间的关系。
1 材料和方法
1.1 病例资料 收集临沂市肿瘤医院1988～1997年间手术切除膀胱移行细胞癌标本75例。其中男62例，女13例，年龄24～81岁，平均年龄58.5岁。标本经10%多聚甲醛液固定，常规切片(厚3～5 μm)，每份标本共切11张，10张做PCR，另1张做免疫组化。肿瘤分期按国际抗癌联盟原发肿瘤、淋巴结及远处转移(UIC.TNM)标准，病理分级按WHO标准，G1 19例、G2 31例、G3 25例。表浅性肿瘤Tis(原位)-T1(器官内)47例、浸润性肿瘤T2(器官外)-T4(远处转移)28例；有淋巴结远处转移者15例，无淋巴结及远处转移者60例。另取10例正常膀胱粘膜标本作对照。
, http://www.100md.com
1.2 PCR引物及来源 HPV6、11引物参照Pao等〔1〕的设计，HPV16、18引物参照Maki等〔2〕的设计，序列见表1。
表1 HPV型特异性引物及PCR扩增产物
Tab.1 Primers for HPV DNA amplification HPV and the PCR products HPV型别
HPV type
引物序列(5′→3′)
Primer sequence (5′ to 3′)
扩增片段(bp)
Length of
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amplified DNA
HPV 6
AGACCAGTTGTGCAAGACGTTTAA
263
GCACGTCTAAGATGTCTTGTTTAG
HPV 11
AGACCAGTTGTGCAAGACGTTTAA
144
AAGGGAAAGTTGTCTCGCCACACA
HPV 16
AGCTCAGAGGAGGAGGATGA
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203
GGTTTCTGAGAACAGATGGG
HPV 18
GAGCCCCAAAATGAAATTCC
244
CAAAGGACAGGGTGTTCAGA
1.3 PCR模板DNA的制备 标本首先对照光镜形态，用刀片最大程度去除癌组织中的正常组织成分。切片10张(5 μm)置Eppendorf管中，经二甲苯脱蜡2次，无水乙醇漂洗、沉淀凉干后加入100 μl消化液(50 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,0.5% Tween-20,100 μg/ml蛋白酶K)50℃浴2 h，最后100℃煮沸10 min，取上清作PCR模板DNA，免去酚、氯仿抽提等步骤。
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1.4 PCR扩增 反应体系为25 μl，在0.5 ml离心管中依次加入5×反应缓冲液5 μl，200 μmmol/L dNTP 2.5 μl,型特异性引物对1 μl(20 μmol/L)，高纯10.5 μl，模板DNA 5 μl混匀后于94℃预变性10 min，加Taq DNA聚合酶1 μl(0.5 U/μl)，覆盖灭菌石蜡油25 μl进行PCR扩增。循环参数：94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个周期后终止反应。另外以HPV6、11、16和18 DNA克隆片段为阳性对照模板；阴性对照以灭菌生理盐水代替DNA，同时进行扩增。
1.5 扩增产物鉴定 扩增产物与上样缓冲液(含溴酚蓝，聚蔗糖)混匀后取10 μl行2.5%琼3脂凝胶电泳，时间30 min，紫外线检测仪上检测结果，若有与上述扩增片段相应的特异放大带即为阳性。
1.6 P53蛋白的检测 P53蛋白检测采用免疫组化SP法。P53(克隆Do7)单克隆抗体为美国Maxim公司产品，SP试剂盒为美国Zymed公司产品(购自武汉博士德生物公司)。实验步骤按试剂盒说明书进行，特异性第一抗体原液按1∶50稀释，阴性对照为用磷酸盐缓冲液代替特异性第一抗体；阳性对照为肺癌阳性切片。对染色阳性细胞，高倍镜下选择10个有代表性的视野计数；每个视野计100个肿瘤细胞，阳性细胞数0为(-)，占肿瘤细胞数15%以下为(+)，15%～30%为()，31%～50%为()，≥50%为()；(+)～()为低表达，()～()为高表达。
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1.7 统计学处理 所得数据采用χ2检验。
2 结果
2.1 膀胱癌标本和正常膀胱组织HPV DNA的PCR扩增结果 75例膀胱移行细胞癌石蜡包埋组织经型特异性引物扩增后，出现与阳性对照相符合的共39例，HPV DNA总阳性率为52%(39/75)。10例正常膀胱组织HPV DNA检出率为10%(1/10)，经统计学处理，两者差异有显著性意义(P<0.05)。见表2。
表2 两组膀胱组织HPV DNA的检测结果
Tab.2 Detectionof HPV DNA in different bladder tissue specimens by PCR 病理诊断Diagnosis
例数
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Cases
HPV DNA阳性数
HPV DNA positive no. in different bladder tissue
阳性率
Positive rates
6
11
16
18
双重*
Dual infection*
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三重**
Triple infection**
膀胱移行细胞癌
Bladder transitional cell carcinoma
75
5
4
25
5
5
3
52%(39/75)△
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正常膀胱组织
Normal bladder tissue
10
1
10%(1/10)
*：包括HPV 6+11(1例)，HPV 6+16(1例)，HPV11+16(1例)，HPV 16+18(2例)。**：包括HPV 6+11+16(1例)，HPV 6+16+18(1例)，HPV 11+16+18(1例)
*：Including HPV 6+11 (n=1),HPV 6+16 (n=1),HPV 11+16 (n=1),HPV 16+18(n=2),**：HPV 6+11+16 (n=1)，HPV 6+16+18 (n=1)，HPV 11+16+18 (n=1).△： χ2＝6.247 5，P<0.052.2 膀胱癌组织中HPV型别分布情况 75例膀胱移行细胞癌组织中，HPV阳性共39例，其中HPV 6型单独阳性例数5例，阳性率6.7%；HPV 11型单独阳性例数4例，阳性率5.3%；低危型HPV 6型或11型合计阳性(只计其中一项)例数7例，阳性率为9.3%；HPV 16型单独阳性例数为25例，阳性率33.3%(25/75)，HPV 18型单独阳性例数5例，阳性率为6.7%(5/75)，高危型HPV 16或18型合计阳性(只计其中一项)例数26例，阳性率34.7%。高危型HPV(16或18)与低危型HPV(6或11)在膀胱移行细胞癌组织中阳性率比较，经统计学处理，两者差异有非常显著性(P<0.005)，见表3。表3 高危型和低危型HPV与膀胱移行细胞癌的关系
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Tab.3 The relationship of high risk HPV type and low risk
HPV type with bladder transitional cell carcinoma 组 别
Group
(16/18)
HPV DNA阳性数
HPV DNA positive no.
HPV DNA阳性率
HPV DNA positive rate
6
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11
16
18
高危型HPV
High risk HPV type
25
1
34.7%(26/75)*
低危型HPV)
Low risk HPV type
5
2
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9.3%(7/75)
*：与低危型HPV比较，χ2＝17.37，P<0.005
*：Compared with the low risk HPV type,χ2＝17.37，P<0.005
2.3 HPV感染与肿瘤分级、分期和转移的关系 见表4。
2.4 P53蛋白表达与膀胱癌的关系 P53在正常膀胱组织中阴性表达，P53阳性表达为棕黄色或棕褐色的核染色。见图版ⅠC。75例膀胱移行细胞癌中P53蛋白阳性表达率为44%(33/75)，G1～G3组P53阳性率分别为36.8%(7/19)，38.7%(12/31)和56.0%(14/25)，三者比较，差异无显著性(P>0.05)；Tis-T1期阳性率为31.9%(15/47)，T2～T4期为64.3%(18/28)，两者比较，差异有非常显著性意义(P<0.01)；有淋巴结及远处转移组P53阳性率为66.7%(10/15)，无转移组为38.3%(23/60)，两者比较，差异有显著性意义(P<0.05)，见表4。
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2.5 HPV感染与P53蛋白表达之间的关系 75例膀胱癌组织，HPV6型单独阳性5例中，P53无一例阳性；HPV 11单独4例阳性中，P53阳性1例，阳性率为25%；HPV 16单独25例阳性中，P53 23例阳性，阳性率为92%；HPV 18单独阳性5例中，P53阳性2例，阳性率为40%。经统计学处理，四组之间差异有极显著性意义(P<0.005)。见表5。
3 讨论
HPV是人类经常感染的病毒，已知HPV有70多种型别，可分为高危性HPV和低危型HPV，高危型病毒常见的有6、18、33、35等多种型别。与人类肿瘤发生有密切的关系。HPV感染的型别也存在着种族、环境、地区、生活习惯的差异。本研究采用高敏感性PCR方法检测HPV，检出率为52%，与文献报道基本一致〔3〕。
HPV的致癌机制目前尚不清楚，有证据表明，HPV早期区激活，编码产生一系列致癌蛋白如E6、E7蛋白。其中高危型HPV的E6蛋白能够干扰抑癌基因P53的翻译转化功能，并使P53经过辅酶Q途径降解失活加快，P53在细胞内的半衰期下降2～4倍〔4〕。因此E6蛋白对P53的灭活降解必然导致细胞生活周期失控，导致肿瘤发生〔5〕。由此可见，HPV的感染是膀胱肿瘤发生的重要因素之一。
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表4 75例肿瘤病理分级、临床分期及转移与HPV的关系
Tab.4 The correlation of the tumor pathological grade,clinic stage and metastasis in 75
bladder transitional cell carcinoma patients with HPV 组别
Grouping
例数
Cases
阳性数(阳性率)
Positive no.(Positive rate)
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P53
HPV 6
HPV 11
HPV 16
HPV18
G1
19
7(36.8)
3(15.8)
2(10.5)
15(78.9)***
4(21.1)**
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G2
31
12(38.7)
1(3.2)
1(3.2)
7(22.6)***
1(3.2)**
G3
25
14(56.0)
1(3.2)
1(3.2)
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3(9.7)***
0(0)**
Tis-T1
47
15(31.9)
4(8.5)
3(6.4)
16(34)
3(11.1)
T2-T4
28
18(64.3)**
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1(3.6)
1(3.6)
9(32.1)
2(7.1)
转 移
Metastasis
+
15
10(66.7)*
3(20)*
2(13.3)
10(66.7)**
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4(26.7)***
-
60
23(38.3)
2(3.3)
2(3.3)
15(25)
1(1.7)
* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.05表5 HPV感染与P53蛋白表达间的关系
Tab.5 The relationship between HPV infection
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and P53 gene expression HPV分型
HPV types
例数
Cases
P53蛋白阳性例数/阳性率(%)
P53 positive no./Positive rate(%)
HPV 6
5
0/0
HPV 11
4
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1/25
HPV 16
25
23/92
HPV 18
5
2/40
合计
Total
39
26/66.7
χ2＝21.94，P<0.005
, 百拇医药 本研究检测结果显示，在膀胱移行细胞癌和正常对照组中HPV阳性率存在显著性差异(P<0.05)。说明膀胱移行细胞癌的发生与HPV感染有密切联系。以HPV 16阳性率最高达33.3%，说明HPV 16型与膀胱癌的关系最为密切。而HPV 6、11、18型阳性率差异不大。通常认为，HPV 16、18是高危型致癌病毒。可导致感染细胞增生和恶性转化；而HPV 6、11为低危型病毒，多在生殖器疣、喉乳头状瘤等良性病变中。我们的研究印证了这一结果。在本组研究中，高危型HPV(16/18)在膀胱癌中的阳性率为34.7%，而低危型HPV 6/11阳性率为9.3%(P<0.05)，说明高危型HPV与膀胱肿瘤的发生关系极为密切。研究还发现，膀胱移行细胞癌中存在多重HPV感染(包括感染两种或两种以上型别)8例。可能说明多重感染在病毒整合到癌细胞基因中，发挥着一定的协同、促进作用。研究还显示，HPV阳性的39例中，P53蛋白表达26例，阳性表达率达66.7%(26/39)，与无HPV阳性组(7例)相比，差异有非常显著性(P<0.005)，说明HPV感染与p53突变有密切相关性。在HPV阳性组中，以HPV 16组P53阳性率最高达92%(23/25)，说明HPV 16对P53影响作用最大。其次为HPV 18。四组相比，有极显著性差异(P<0.05)，HPV DNA与P53的存在呈负相关性，HPV阳性表达率随着病理分极和临床分期的上升而降低，而P53蛋白阳性率却正好相反。HPV 16/18E6蛋白可与P53结合，使P53基因对正常细胞的负性调节作用丧失，利于细胞无限制生长、增生，引起肿瘤。而高危型HPV E6蛋白对P53的灭活作用包括野 生型和部分突变型p53。Martin等〔6〕用联合免疫沉淀检测突变的P53与E6蛋白的结合力。发现不同部位点突变的P53与E6蛋白的结合力有显著性差异，其中以273-RL的点突变P53才能表现出HPV与P53双阳性。这个现象对肿瘤的发展有着不可忽视的意义。P53点突变与肿瘤的恶性程度呈正相关，并且P53的过表达在许多情况下是肿瘤组织继发的中晚期基因事件之一〔7〕，是肿瘤向恶性程度增高方向进展的特征之一。本实验可见HPV感染的肿瘤组织以低病理分级和Tis-T1期肿瘤组织为主，与Musdtuo等〔8〕的发现相似。若HPV与P53同时阳性，则显示预后较差。因此，高危型HPV的感染后E6蛋白和P53基因产物的相互作用是膀胱癌发生发展过程中的一个重要基因事件。对膀胱癌的预后有着极期重要的意义。
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感染病毒的NIH3T3细胞上LMP2蛋白的表达 A:阳性细胞； B: 阴性对照
Detection of the expressed LMP2 by IF test on NIH3T3 cells
A:Expressed LMP2 protein on virus infected NIH3T3 cells B:Negative control,the IF test of normal NIH3T3 cells
图版 ⅠC 陈廷等.人乳头瘤病毒与P 53协同致膀胱移行细胞癌关系的研究
Plate ⅠC CHEN Ting,et al.The study of relation of human papillomavirus and P 53 expression with bladder transitional cell carcinoma
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(Original article on p.345)
本课题受山东省自然基金会项目资助(Y95C0931)
参 考 文 献
1，Pao CC,Lin CY,Maa JS,et al.Detection of human papillomavirus in cervico-vaginal cell using polymerase chain reaction. J Infect Dis,1990,161：113-117.
2，Maki H,Saito S,Ibaraki T,et al.Use of universal and type specific primers in the polymerase chain reaction for the detection and typing of genital human papillomaviruses Jpn J Cancer Res,1991,82：411-415.
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3，Anwar K,Naiki H,Nakaruki K,et al.High frequency of human papillomavirus infection in carcinoma of the urinary bladder. Cancer,1992,70：1967-1971.
4，Lechmer M,Mack DH,Mack DH,et al.Human papillomavirus E6 proteins bind P53 in vivo and abrogate P53 mediated repression of transcription. EMBO J,1992,11：3045-3049.
5，Karen V.Interaction of human papillomavirus transforming protein with the products of tumor suppressor genes. FASEB,1993,7：872-876.
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6，Martin S,Takashi T,Jon NH,et al.Interaction of the human papillomavirus type 16 E6 oncoprotein with wild-type and mutant P53 protein. J Virol,1992,66：5100-5106.
7，Fujimoto K,Yameta Y,Orajima F,et al.Frequent association of P53 gene mutation in invasive bladder cancer. Cancer Res,1992,52：1393-1397.
8，Mutsuo F,Keiji I,Yuji O,et al.High-risk human papillomavirus infections and overexpression of P53 protein as prognostic indicators in transitional cell carcinoma of the urinary bladder.Cancer Res,1993,53：4823-4826.
(收稿日期：2000-02-14)
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