深圳市HIV-1 E亚型感染毒株的分子流行病学分析
作者：冯铁建 邵一鸣 李良成 苏玲 张顺祥 赵全壁 袁建中
单位：李良成 张顺祥(深圳市卫生防疫站 518020)；邵一呜 苏玲 赵全壁 袁建中(卫生部艾滋病预防控制中心参比实验室)
关键词：HIV-1；基因；病毒；聚合酶链反应
中华实验和临床病毒学杂志000407 【摘要】 目的 了解人类免疫缺陷病毒1型E亚型毒株在深圳市不同人群中流行传播情况、流行时间和传播规律。方法 应用聚合酶链反应(PCR)方法对1996年深圳市检出的3份人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者外周血单个核细胞样本进行扩增，获得HIV-1膜蛋白(env)基因片段，并对C2-V3及其邻区350～450个核苷酸序列进行测定和分析。结果 这3份血样为HIV-1 E亚型毒株感染(sz-E)，彼此间的基因离散率为2.6%;与A-E国际参考亚型及国内部分地区流行的BE型代表株比较，sz-E与A-D参考亚型共享序列及国内B亚型代表株间的基因离散率均大于24%，而与主要代表泰国E亚型(Econ)间的基因离散率仅为6.2%。系统树分析显示，sz-E与Econ聚集在一起，远离其他国际亚型毒株序列。结论 HIV-1E亚型在深圳的流行时间约为2～3年，主要经共用针具等行为首先在静脉药瘾人群中流行，且具有向职业献血员中传播蔓延的潜在危险。
, 百拇医药
Molecular epidemiology analysis of HIV-1 subtype E strains found in Shenzhen
FENG Tiejian, SHAO Yiming, Li Liangcheng
(Shenzhen Hygiene and Anti-epidemic Station, Shenzhen 518020, China)
【Abstract】 Objective To investigate the prevalent status of HIV-1 subtype E epidemic among different populations in Shenzhen. Methods HIV-1 proviral DNA. from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of 3 HIV-infected individuals found in Shenzhen was amplified by nested-PCR. The C2-V3 and its flanking region (350-450 nucleotides) of HIV-1 env gene were sequenced directly from the PCR products and analysed.Results These 3 cases were confirmed to be infected with HIV-1 subtype E strain (sz-E). The innergroups distance of sz-E was 2.6%. In comparison with the consesus sequence of intenational A-E subgroups and some of subtype B epidemic in China, the genetic distances among sz-E and each of A-D subgroups and some of subtype B were more than 24%. Furthermore, the phylogenetic tree analysis showed that sz-E clustered closely to Econ.Conclusion These findings suggested that the epidemic time for HIV-1 subtype E , which was mainly prevalent among IDUs population and some professional blood donors, had been about 2-3 years in Shenzhen.
, 百拇医药
【Key words】 HIV-1; Gene, viral; Polymerase chain reaction
人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种具有高度变异性的逆转录病毒。随着HIV流行时间的延长，其基因变异程度不断增大并产生许多具有相对独立基因序列特性的亚型。根据HIV-1基因组中变异性最大的膜蛋白基因(env)核苷酸和氨基酸序列特点，目前确定的HIV-1亚型至少有十种即A-I和O亚型〔1-3〕。最先发现于泰国并主要在性传播人群中流行的HIV-1 E亚型毒株已于近年传人我国，并在云南、广西和广东等地的静脉吸毒人群中流行，但尚未有在献血员感染者中流行的报道。我们对1996年检出的部分HIV-1型感染者的env基因C1-V3区进行序列测定分析后，发现3例为HIV-1亚型毒株感染。
1 材料和方法
1.1 标本来源3例在深圳市检出的HIV-1抗体阳性者中，2例(sz-2,sz-5)为分别来自黑龙江省哈尔滨市和陕西省西安市的静脉吸毒者;另1例(sz-1)为来自河南省驻马店地区的职业献血员(自述有吸毒史，否认性乱史)。每名对象采集外周静脉血3 ml～5 ml,肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)，PBS洗两遍后，加入0.5 ml裂解缓冲液(0.1 mmol/L Tris-HCl,pH8.3,10 mmol/L EDTA,10 mmol/L NaCl,体积分数为0.5%的SDS,200 μg/ml蛋白酶K)混匀，55℃温育2 h后，95℃ 15 min灭活蛋白酶K。用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀物经真空干燥后，加入100 μl无菌去离子水溶解，-20℃保存备用。
, 百拇医药
1.2 聚合酶链反应 按nested-PCR方法，设计合成多对PCR引物(表1)，扩增HIV-1 env基因。以env-L/env-i为外侧引物，进行第1次PCR反应，条件为:95℃ 1 min变性;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 120 s,30个循环;72℃ 10 min。取十分之一PCR产物，以env-C/env-K为内侧引物，按上述条件进行第2次PCR,扩增env-K基因C2-V3区。
表1 PCR引物序列
Tab.1 Primers used for PCR and sequence analysis 引物
Primers
用途
Usage
(5′-3′)
, http://www.100md.com
序 列
Sequence
在env基因
中的定位
Location in
env gene
env-L
PCR
TGGGGTACCTGTGTGGAAA
192
env-i
PCR
, 百拇医药
TATCCCTGCCTAACTCTATT
2056
env-k
PCR
GCCCATAGTGCTTCCTGCTGCTCC
1536
env-C
PCR
CCAATTCCCATACATTATTG
607
env-D3
Seq
, http://www.100md.com
CTGTTAAATGGCAGTCTAGCAG
782
env-f2
Seq
GTGGAGGGGAATTTTTCTACTG
1109
1.3 PCR产物的纯化 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，与marker对照判断无误后，切下特异扩增带，用Qiaegen公司的Qiaex试剂，按说明提纯扩增的HIV-1 DNA片段。回收的DNA溶于10mmol/L Tris-HCl(pH8.7)，经琼脂糖凝胶电泳与相对分子质量标准比较估算核酸浓度。
1.4 核苷酸序列测定 分别使用env-D3和env-f2为测序引物，以提纯的PCR产物为模板，用ABI公司荧光标记末端终止物循环测序试剂盒，在PE公司9600型PCR仪上进行测序反应，模板用量约1μg，引物用量为6pmol/L。反应产物经提纯后用自动DNA序列分析仪进行序列测定。
, http://www.100md.com
1.5 序列分析 测得的序列用SepEd和DNA软件进行编辑校正，每个样品C2-V3区核苷酸的最终序列根据两个同向测序引物所测结果重叠校核后确定。序列的排列、比较和同源性等分析，使用威斯康星GCG公司软件包完成，具体包括:用pileup程序对样品及国际标准序列的排列和比较;用Pretty程序计算一组序列的共享序列(Consensus sequence);用distances计算一组序列间的基因离散率;用groutree程序做系统树(Phylogenetic)分析。
2 结果
2.1 深圳HIV-1 E(sz-E)毒株氨基酸序列与国际标准毒株的比较 经nested-PCR扩增后，从3份HIV-1感染者PBMC样品中获得可用于序列测定的HIV-1env基因目的片段。将env-D3和env-f2引物测序结果进行编辑整理后，测得C2-V3及其相邻区的核苷酸序列。应用pileup和pretty程序进行有关排列和比较计算出其共享序列(图1)。
, http://www.100md.com
2.2 深圳地区HIV-1E亚型毒株与A-E国际亚型和部分参考毒株基因离散率比较 将sz-E核苷酸序列与国际A-E5个亚型的共享序列(Acon-Econ)及国内部分B亚型代表株核苷酸序列进行比较，计算彼此间的基因离散率(表2)，结果发现，其与A、B、C、D亚型共享序列间的离散率均在24%以上，与主要代表泰国E亚型的Econ间仅为6.2%,与属泰国B亚型毒株的云南、湖北、河南、四川代表株间的离散率均在24%以上。
2.3 深圳地区HIV-1E亚型毒株的系统树分析 系统树分析显示，3个sz-E毒株与国际标准E亚型聚集在一起，但远离其他国际亚型毒株(图2)。
图1 深圳地区HIV-1 E亚型毒株的氨基酸序列及其共享序列
Fig.1 Predicted aminoacid sequence alignment and consensus sequence of HIV-1 subtype E strains of Shenzhen表2 sz-E毒株与A-E国际亚型和部分参考毒株基因离散率比较(
±s)
, 百拇医药
Tab.2 Genetic distances among sz-E and 5 intemational HIV-1 subtypes as well as some reference HIV-1 strains(±s) 毒株
strains
本型内
Innergroup
Acon
B
C con
D con
E con
, http://www.100md.com
con
yn-B
hub-B
hen-B
sc-B
sz-E
2.6
24.1±1.7
24.5±1.1
24.4±1.1
25.2±0.8
27.1±0.9
, http://www.100md.com 25.4±0.8
27.6±1.8
30.7±1.9
6.2±1.6
注：序列基因离散率是用GCG程序计算C2-V3区第165-450核苷酸序列得到
Notes:Genetic distances were calculated by GCG distance program based on nucleotide sequence (nt165-450) of C2-V3 region
图2 深圳HIV-1流行毒株的系统树分析
, 百拇医药
Fig.2 Phylogenetic tree analysis of HIV-1 strains
epidemic in Shenzhen
3 讨论
HIV-1E亚型毒株于1989年最先在泰国发现，并且主要在该国的性传播人群中引起了第二次大范围的HIV流行扩散，随后经有静脉毒瘾的妓女和嫖客而造成在吸毒人群中的广泛传播。目前泰国吸毒人群中E亚型感染者人数不断增加，改变了以住B亚型感染为主的流行格局〔4-6〕，近年来，HIV-1E亚型毒株己经吸贩毒通道向金三角及其周边地区如中国云南、广东、广西等地扩散蔓延，并在静脉吸毒者和性乱人群中流行传播〔7,8〕。深圳邻近香港和泰国、缅甸、马来西亚等HIV-1E亚型感染者人数最多的国家和地区，1996年我们首次在深圳的吸毒人群中检出2例HIV感染者，本研究证实其系HIV-1E亚型毒株，与泰国E亚型具有高度同源性，彼此间的基因离散率仅为6.2%,对gp120中最重要的中和抗体决定簇所在V3环顶端多肽序列进行分析比较亦支持这一结论，3个sz-E毒株均具有GPGQ这一典型泰国E亚型V3环顶部多肽序列特征。
, 百拇医药
根据流行病学资料，2名吸毒者曾在6个月前因互相共用针具静脉吸毒而感染，二者env基因序列极其相似，其基因离散率仅为0.6%，说明系同一传染源传播所致。值得注意的是，我们在对一名来自河南的有职业献血史的HIV盛染者的env基因序列分析后，发现其亦为E亚型毒株感染者，这在我国尚属首次报道。提示某些己感染病毒的静脉药瘾者为了获取毒资有可能经卖血将HIV-1E亚型毒株传播给其他献血员或受血者，因而具有在该类人群中造成流行的潜在危险。
从本研究HIV-1基因离散率分析的结果看出，sz-E亚型毒株间的基因离散率为2.6%左右，根据HIV-1毒株基因平均每年以0.5%～1%的速率变异计算〔1〕，E亚型毒株在深圳的流行时间约为2～3年。
参 考 文 献
1，Myers G,korber S,Wain-hobson Rf,et al.Human Retroviruses and AIDS 1993.Los Alamos,New Mexico:Los Alamos National Laboratory,1993.
, http://www.100md.com
2，Weniger BG,Takebe Y,Ou CY,et al.The molecular epidemiology of HIV in Asia.AIDS,1994,8(Suppl 2)：S1.
3，Janssons W.Genetic and phylogenetic analysis of env subtypes G and H in central Africa. AIDS Res Hum Retroviruses,1994,10：87.
4，Kalish ML.Baldwin A,Raktham S,et al.The evolving molecular epidemiology of HIV-1 envelope subtypes in IDU in Bangkok,Thailand:implications for HIV vaccine trials.AIDS,1995,9：851.
, http://www.100md.com
5，Wasi C,Herring B,Raktham S,et al.Determination of HIV-1 subtype in IDU in Bangkok,Thailand using peptide-binding enzyme immunoassay and heteroduplex mobility assay :evidence of increasing infection with HIV-1 subtype E.AIDS,1995,9：843.
6，Nerukar VR.HIV type Ⅰ subtype E in commercial sex workers and IDU in southrn Vietnam.AIDS Res Hum Retroviruses,1996,9：841.
7，邵一鸣，赵全璧，管永军.1995年云南瑞丽HIV-1毒株的基因变异和分析.病毒学报，1996，12：9.
8，邵一鸣，赵全璧，王斌，等.我国云南德宏地区HIV感染者HIV毒株膜蛋白基因的序列测定分析.病毒学报，1994，10：219.
(收稿日期：1999-11-24), 百拇医药
单位：李良成 张顺祥(深圳市卫生防疫站 518020)；邵一呜 苏玲 赵全壁 袁建中(卫生部艾滋病预防控制中心参比实验室)
关键词：HIV-1；基因；病毒；聚合酶链反应
中华实验和临床病毒学杂志000407 【摘要】 目的 了解人类免疫缺陷病毒1型E亚型毒株在深圳市不同人群中流行传播情况、流行时间和传播规律。方法 应用聚合酶链反应(PCR)方法对1996年深圳市检出的3份人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者外周血单个核细胞样本进行扩增，获得HIV-1膜蛋白(env)基因片段，并对C2-V3及其邻区350～450个核苷酸序列进行测定和分析。结果 这3份血样为HIV-1 E亚型毒株感染(sz-E)，彼此间的基因离散率为2.6%;与A-E国际参考亚型及国内部分地区流行的BE型代表株比较，sz-E与A-D参考亚型共享序列及国内B亚型代表株间的基因离散率均大于24%，而与主要代表泰国E亚型(Econ)间的基因离散率仅为6.2%。系统树分析显示，sz-E与Econ聚集在一起，远离其他国际亚型毒株序列。结论 HIV-1E亚型在深圳的流行时间约为2～3年，主要经共用针具等行为首先在静脉药瘾人群中流行，且具有向职业献血员中传播蔓延的潜在危险。
, 百拇医药
Molecular epidemiology analysis of HIV-1 subtype E strains found in Shenzhen
FENG Tiejian, SHAO Yiming, Li Liangcheng
(Shenzhen Hygiene and Anti-epidemic Station, Shenzhen 518020, China)
【Abstract】 Objective To investigate the prevalent status of HIV-1 subtype E epidemic among different populations in Shenzhen. Methods HIV-1 proviral DNA. from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of 3 HIV-infected individuals found in Shenzhen was amplified by nested-PCR. The C2-V3 and its flanking region (350-450 nucleotides) of HIV-1 env gene were sequenced directly from the PCR products and analysed.Results These 3 cases were confirmed to be infected with HIV-1 subtype E strain (sz-E). The innergroups distance of sz-E was 2.6%. In comparison with the consesus sequence of intenational A-E subgroups and some of subtype B epidemic in China, the genetic distances among sz-E and each of A-D subgroups and some of subtype B were more than 24%. Furthermore, the phylogenetic tree analysis showed that sz-E clustered closely to Econ.Conclusion These findings suggested that the epidemic time for HIV-1 subtype E , which was mainly prevalent among IDUs population and some professional blood donors, had been about 2-3 years in Shenzhen.
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【Key words】 HIV-1; Gene, viral; Polymerase chain reaction
人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种具有高度变异性的逆转录病毒。随着HIV流行时间的延长，其基因变异程度不断增大并产生许多具有相对独立基因序列特性的亚型。根据HIV-1基因组中变异性最大的膜蛋白基因(env)核苷酸和氨基酸序列特点，目前确定的HIV-1亚型至少有十种即A-I和O亚型〔1-3〕。最先发现于泰国并主要在性传播人群中流行的HIV-1 E亚型毒株已于近年传人我国，并在云南、广西和广东等地的静脉吸毒人群中流行，但尚未有在献血员感染者中流行的报道。我们对1996年检出的部分HIV-1型感染者的env基因C1-V3区进行序列测定分析后，发现3例为HIV-1亚型毒株感染。
1 材料和方法
1.1 标本来源3例在深圳市检出的HIV-1抗体阳性者中，2例(sz-2,sz-5)为分别来自黑龙江省哈尔滨市和陕西省西安市的静脉吸毒者;另1例(sz-1)为来自河南省驻马店地区的职业献血员(自述有吸毒史，否认性乱史)。每名对象采集外周静脉血3 ml～5 ml,肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)，PBS洗两遍后，加入0.5 ml裂解缓冲液(0.1 mmol/L Tris-HCl,pH8.3,10 mmol/L EDTA,10 mmol/L NaCl,体积分数为0.5%的SDS,200 μg/ml蛋白酶K)混匀，55℃温育2 h后，95℃ 15 min灭活蛋白酶K。用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀物经真空干燥后，加入100 μl无菌去离子水溶解，-20℃保存备用。
, 百拇医药
1.2 聚合酶链反应 按nested-PCR方法，设计合成多对PCR引物(表1)，扩增HIV-1 env基因。以env-L/env-i为外侧引物，进行第1次PCR反应，条件为:95℃ 1 min变性;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 120 s,30个循环;72℃ 10 min。取十分之一PCR产物，以env-C/env-K为内侧引物，按上述条件进行第2次PCR,扩增env-K基因C2-V3区。
表1 PCR引物序列
Tab.1 Primers used for PCR and sequence analysis 引物
Primers
用途
Usage
(5′-3′)
, http://www.100md.com
序 列
Sequence
在env基因
中的定位
Location in
env gene
env-L
PCR
TGGGGTACCTGTGTGGAAA
192
env-i
PCR
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TATCCCTGCCTAACTCTATT
2056
env-k
PCR
GCCCATAGTGCTTCCTGCTGCTCC
1536
env-C
PCR
CCAATTCCCATACATTATTG
607
env-D3
Seq
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CTGTTAAATGGCAGTCTAGCAG
782
env-f2
Seq
GTGGAGGGGAATTTTTCTACTG
1109
1.3 PCR产物的纯化 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，与marker对照判断无误后，切下特异扩增带，用Qiaegen公司的Qiaex试剂，按说明提纯扩增的HIV-1 DNA片段。回收的DNA溶于10mmol/L Tris-HCl(pH8.7)，经琼脂糖凝胶电泳与相对分子质量标准比较估算核酸浓度。
1.4 核苷酸序列测定 分别使用env-D3和env-f2为测序引物，以提纯的PCR产物为模板，用ABI公司荧光标记末端终止物循环测序试剂盒，在PE公司9600型PCR仪上进行测序反应，模板用量约1μg，引物用量为6pmol/L。反应产物经提纯后用自动DNA序列分析仪进行序列测定。
, http://www.100md.com
1.5 序列分析 测得的序列用SepEd和DNA软件进行编辑校正，每个样品C2-V3区核苷酸的最终序列根据两个同向测序引物所测结果重叠校核后确定。序列的排列、比较和同源性等分析，使用威斯康星GCG公司软件包完成，具体包括:用pileup程序对样品及国际标准序列的排列和比较;用Pretty程序计算一组序列的共享序列(Consensus sequence);用distances计算一组序列间的基因离散率;用groutree程序做系统树(Phylogenetic)分析。
2 结果
2.1 深圳HIV-1 E(sz-E)毒株氨基酸序列与国际标准毒株的比较 经nested-PCR扩增后，从3份HIV-1感染者PBMC样品中获得可用于序列测定的HIV-1env基因目的片段。将env-D3和env-f2引物测序结果进行编辑整理后，测得C2-V3及其相邻区的核苷酸序列。应用pileup和pretty程序进行有关排列和比较计算出其共享序列(图1)。
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2.2 深圳地区HIV-1E亚型毒株与A-E国际亚型和部分参考毒株基因离散率比较 将sz-E核苷酸序列与国际A-E5个亚型的共享序列(Acon-Econ)及国内部分B亚型代表株核苷酸序列进行比较，计算彼此间的基因离散率(表2)，结果发现，其与A、B、C、D亚型共享序列间的离散率均在24%以上，与主要代表泰国E亚型的Econ间仅为6.2%,与属泰国B亚型毒株的云南、湖北、河南、四川代表株间的离散率均在24%以上。
2.3 深圳地区HIV-1E亚型毒株的系统树分析 系统树分析显示，3个sz-E毒株与国际标准E亚型聚集在一起，但远离其他国际亚型毒株(图2)。
图1 深圳地区HIV-1 E亚型毒株的氨基酸序列及其共享序列
Fig.1 Predicted aminoacid sequence alignment and consensus sequence of HIV-1 subtype E strains of Shenzhen表2 sz-E毒株与A-E国际亚型和部分参考毒株基因离散率比较(
±s), 百拇医药
Tab.2 Genetic distances among sz-E and 5 intemational HIV-1 subtypes as well as some reference HIV-1 strains(
±s) 毒株strains
本型内
Innergroup
Acon
B
C con
D con
E con
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con
yn-B
hub-B
hen-B
sc-B
sz-E
2.6
24.1±1.7
24.5±1.1
24.4±1.1
25.2±0.8
27.1±0.9
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27.6±1.8
30.7±1.9
6.2±1.6
注：序列基因离散率是用GCG程序计算C2-V3区第165-450核苷酸序列得到
Notes:Genetic distances were calculated by GCG distance program based on nucleotide sequence (nt165-450) of C2-V3 region
图2 深圳HIV-1流行毒株的系统树分析
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Fig.2 Phylogenetic tree analysis of HIV-1 strains
epidemic in Shenzhen
3 讨论
HIV-1E亚型毒株于1989年最先在泰国发现，并且主要在该国的性传播人群中引起了第二次大范围的HIV流行扩散，随后经有静脉毒瘾的妓女和嫖客而造成在吸毒人群中的广泛传播。目前泰国吸毒人群中E亚型感染者人数不断增加，改变了以住B亚型感染为主的流行格局〔4-6〕，近年来，HIV-1E亚型毒株己经吸贩毒通道向金三角及其周边地区如中国云南、广东、广西等地扩散蔓延，并在静脉吸毒者和性乱人群中流行传播〔7,8〕。深圳邻近香港和泰国、缅甸、马来西亚等HIV-1E亚型感染者人数最多的国家和地区，1996年我们首次在深圳的吸毒人群中检出2例HIV感染者，本研究证实其系HIV-1E亚型毒株，与泰国E亚型具有高度同源性，彼此间的基因离散率仅为6.2%,对gp120中最重要的中和抗体决定簇所在V3环顶端多肽序列进行分析比较亦支持这一结论，3个sz-E毒株均具有GPGQ这一典型泰国E亚型V3环顶部多肽序列特征。
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根据流行病学资料，2名吸毒者曾在6个月前因互相共用针具静脉吸毒而感染，二者env基因序列极其相似，其基因离散率仅为0.6%，说明系同一传染源传播所致。值得注意的是，我们在对一名来自河南的有职业献血史的HIV盛染者的env基因序列分析后，发现其亦为E亚型毒株感染者，这在我国尚属首次报道。提示某些己感染病毒的静脉药瘾者为了获取毒资有可能经卖血将HIV-1E亚型毒株传播给其他献血员或受血者，因而具有在该类人群中造成流行的潜在危险。
从本研究HIV-1基因离散率分析的结果看出，sz-E亚型毒株间的基因离散率为2.6%左右，根据HIV-1毒株基因平均每年以0.5%～1%的速率变异计算〔1〕，E亚型毒株在深圳的流行时间约为2～3年。
参 考 文 献
1，Myers G,korber S,Wain-hobson Rf,et al.Human Retroviruses and AIDS 1993.Los Alamos,New Mexico:Los Alamos National Laboratory,1993.
, http://www.100md.com
2，Weniger BG,Takebe Y,Ou CY,et al.The molecular epidemiology of HIV in Asia.AIDS,1994,8(Suppl 2)：S1.
3，Janssons W.Genetic and phylogenetic analysis of env subtypes G and H in central Africa. AIDS Res Hum Retroviruses,1994,10：87.
4，Kalish ML.Baldwin A,Raktham S,et al.The evolving molecular epidemiology of HIV-1 envelope subtypes in IDU in Bangkok,Thailand:implications for HIV vaccine trials.AIDS,1995,9：851.
, http://www.100md.com
5，Wasi C,Herring B,Raktham S,et al.Determination of HIV-1 subtype in IDU in Bangkok,Thailand using peptide-binding enzyme immunoassay and heteroduplex mobility assay :evidence of increasing infection with HIV-1 subtype E.AIDS,1995,9：843.
6，Nerukar VR.HIV type Ⅰ subtype E in commercial sex workers and IDU in southrn Vietnam.AIDS Res Hum Retroviruses,1996,9：841.
7，邵一鸣，赵全璧，管永军.1995年云南瑞丽HIV-1毒株的基因变异和分析.病毒学报，1996，12：9.
8，邵一鸣，赵全璧，王斌，等.我国云南德宏地区HIV感染者HIV毒株膜蛋白基因的序列测定分析.病毒学报，1994，10：219.
(收稿日期：1999-11-24), 百拇医药