HIV-1蛋白酶和逆转录酶抗药基因变异检测方法的建立及临床应用
作者：俞敏 William Kabat 王健伟 洪涛 Ram Yogev 赵玉琪
单位：俞敏 William Kabat 赵玉琪(美国西北大学附属儿童医院)；Ram Yogev 赵玉琪(美国西北大学附属儿童医院儿科系)；赵玉琪(免疫及微生物系)洪涛 赵玉琪 王健伟(中国预防医学科学病毒学研究所病毒形态学研究室)
关键词：HIV-1；蛋白酶；逆转录酶；序列分析；耐药性
中华实验和临床病毒学杂志000406 【摘要】 目的 应用现有DNA序列分析技术对人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的蛋白酶(PR)和逆转录酶(RT)基因进行简便、快速、准确的序列分析，在临床上为HIV-1患者治疗方案的确定提供可靠依据。方法 从HIV-1感染者血清中提取RNA，用套式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HIV-1的PR和RT基因片段，并对此片段进行核苷酸序列分析。结果 本方法对血清中HIV-1 RNA含量约2 000拷贝/ml以上的样品都能有效扩增。在序列分析时背景干扰少，对25%左右的混合序列均能准确反映。通过对临床治疗病人进行动态序列分析观察，发现在药物治疗过程中，病人血浆中HIV-1 RNA含量变化与PR和RT基因抗药性变异具有很大相关性。结论 PR和RT基因序列分析方法能够及时、准确地反映HIV-1患者在抗病毒药物治疗过程中病毒的变异情况。该方法的建立能在临床上能为不同患者治疗方案的确定提供直接、可靠的依据。
, 百拇医药
Rapid detection of drug resistant HIV-1 to reverse transcriptase and protease inhibitors in HIV-infected patients receiving highly active antiretroviral therapies
YU Min, KABAT William,WANG Jianwei
(Children′s Memorial Institute for Education and Research,Northwestern University Medical School,Illinois, USA)
【Abstract】 Objective To develop and validate a rapid and sensitive method that can be used to detect emergence of HIV-1 drug resistant viruses in HIV-infected patients receiving highly active antiretroviral therapies (HAART). Methods HIV-1 viral RNA was extracted from plasma and amplified by nested RT-PCR. Nucleotide sequences of the reverse transcriptase (RT) and protease (PR) genes were determined by automated DNA sequencing. Results RT and PR sequences can be reliably determined with a minimum 2 000 copies/ml of viral RNA in plasma. Emergence of drug resistant viruses can be detected as soon as it reached to >25% of the total viral populations. By using this method, drug-resistant viral populations were found to correlate with rebound of viral RNA level after prolonged antiretroviral therapies in HIV-infected children. Conclusion This rapid and sensitive HIV-1 genotyping method can be used to predict and confirm emergence of HIV-1 drug resistance in HIV-infected patients receiving HAART.
, http://www.100md.com
【Key words】 HIV-1; Reverse transcriptase; Protease; Sequence analysis; Drag resistance
随着人们对人类免疫缺陷病毒(HIV-1)在人体中复制过程的深入研究和各种抗病毒药物的不断出现〔1，2〕，HIV-1感染的治疗已取得重要进展。目前使用的HIV-1抗病毒药物主要通过抑制蛋白酶(Protease,PR)和逆转录酶(Reverse transcriptase,RT)的活性来减少病毒的复制。PR和RT抑制剂的60614,USA,E-mail:yzhao@northwestern.edu
联合使用(鸡尾酒疗法)，可有效抑制患者体内病毒的复制，使病人血浆和组织中的病毒数量明显下降，有些甚至可达<50拷贝/ml，病人的临床症状得到显著改善，存活时间延长〔3-5〕。
, 百拇医药 最新的研究发现，由于HIV-1病毒极易突变，尤其在药物作用下，会有选择地改变PR和RT部分位点上的氨基酸，从而产生耐药性〔5〕。例如RT第41位和215位氨基酸分别由Met和Thr改变为Leu和Phe时就会对AZT产生耐药性〔6〕。因此，在对HIV病人进行治疗的过程中，准确地对其HIV-1 RT和PR基因进行序列分析，有效检测体内病毒的基因变异，及时了解病毒的变异趋势，将为HIV-1感染的有效治疗提供有益指导。
1 材料和方法
1.1 样品来源 进行检测的血清分别来自美国ACTG(AIDS Clinical Trial Groups)各病毒质控实验室、ENVA(European Net-work for the Virological Evaluation of International Trials for new Anti-HIV Therapies) Panel Ⅱ以及在该院的临床治疗病人。
, 百拇医药
1.2 临床治疗所用药物 本文中HIV感染者使用了一种蛋白酶抑制剂和四种逆转录酶抑制剂，包括：Ritonavir(蛋白酶抑制剂，商标名Norvir,Abbott公司)；Combivir〔逆转录酶抑制剂，Lamivudine (3TC),Epivir和Zidovuding(AZT);Retrovir,混和药物，葛兰素-威康公司〕；Efavirenz(逆转录酶抑制剂，商标名：Sustiva,杜邦药业公司)；Stavudine (d4T)(逆转录酶抑制剂，商标名:Zerit,施贵宝公司)。
1.3 病毒RNA的提取 使用QIAGEN公司改良的QIAamp HCV RNA试剂盒提取血清中的病毒RNA。每个样品用300 μl血清，最终提取到的病毒RNA溶在50 μl水中，-70℃保存。
1.4 RNA的逆转录和套式PRC ①使用Life Technologies公司的Superscript One Step试剂盒，用引物RT21和MAW-26(见表1)完成逆转录和首轮PCR反应。反应体系为：0.5 μl浓度为50 pmol/μl的引物，Mg2+浓度为5 mmol/L，Superscript-Taq酶混合物10 U，10 μl提取的RNA，反应体积为50 μl。反应条件为45℃ 30min，94℃ 2 min，一个循环；94℃ 25 s，55℃ 20 s，72℃ 2 min，30个循环。最后72℃延伸10 min。②用引物RT20和USPR进行第2轮PCR扩增反应。反应体系为：0.2 μl浓度为50 pmol/μl的引物，Mg2+浓度为3.5 mmol/L，Taq Gold酶5 U，5 μl第1轮PCR反应产物，总反应体积100 μl。反应条件：95℃ 5 min,一个循环；95℃ 25 s，63℃ 20 s，72℃ 2 min，35个循环；72℃ 10 min。
, 百拇医药
1.5 PCR产物的纯化 用QIAGEN公司QIAquick PCR试剂盒纯化第2轮PCR产物，最终溶于50 μl水中。
1.6 核苷酸序列测定 使用PE Biosystems公司BIG Dye测序反应试剂盒进行测序反应。反应体系为：DNA模板用量为100 ng，引物量为5～10 pmol/L，反应体积20 μl。反应条件为：96℃ 10 s,50℃5 s,60℃ 3 min,25个循环。最终在PE Biosystems公司的ABI 377型自动DNA测序仪上进行序列测定。在测序时应用10个不同的测序引物对用套式RT-PCR扩增产生的DNA进行测序分析(表1，图1)。所测序列包括PR基因1～99密码子和RT基因
表1 RT-PCR扩增与HIV-1 PR-RT基因测序引物
Tab.1 RT-PCR and sequencing primers for HIV-1 PR-RT gene 引物Primer
, 百拇医药
引物序列(5′-3′)
Primer sequence(5′-3′)
5′/3′引物
5′/3′ primer
位置
Location
套式PCR
Nested PCR
第一轮RT-PCR
First round RT-PCR
MAW-26
, 百拇医药
TTG GAA ATG TGG AAA GGA AGG AC
5′
2028-2050
RT-21
CTG TAT TTC TGC TAT TAA GTC TTT TGA TGG G
3′
3509-3539
第二轮PCR
Second round PCR
PRO-1
CAG AGC CAA CAG CCC CAC CA
, 百拇医药
5′
2147-2166
RT-20
CTG CCA GTT CTA GCT CTG CTT C
3′
3441-3462
PR-RT基因测序
PR-RT gene sequenaing
A
TTC CCA TTA GTC CTA TT
5′
, 百拇医药
2548-2564
B
GGA TGG AAA GGA TCA CC
5′
3003-3019
C
CTG CGG GAT GTG GTA TTC CT
3′
2825-2844
D
GCA CTA TAG GCT GTA CTG TC
, http://www.100md.com 3′
3266-3285
3W
ATG TTT TTT GTC TGG TGT GGT
3′
3192-3212
M2661
GTA AAT CTG ACT TGC CCA AAT TC
3′
3340-3362
RT20
CTG CCA GTT CTA GCT CTG CTT C
, 百拇医药
3′
3441-3462
RPO-1
CAG AGCCAA CAG CCC CAC CA
5′
2147-2164
DSPR
GGG CCA TCC ATT CCT GGC
3′
2588-2605
PSR2
ATG CCT TTA TTT TTT CTT CTG TC
, 百拇医药
3′
2649-2672
图1 RT-PCR与DNA序列分析策略
Fig.1 Strategies of RT-PCR and DNA sequencing of HIV-1 PR-RT gene
1～280密码子。
1.7 序列分析和软件应用 测得的序列经PE Biosystems公司的Sequencing Analysis和Factura软件编辑后，用PE Biosystems公司的AutoAssembler和Navigator软件与HIV-1参比序列pNL4-3进行比较，以辨认特异的抗药变异。
, 百拇医药
2 结果
2.1 样品检测结果 用套式RT-PCR对20个来源于美国病毒质控实验室的血清标本进行DNA扩增。20个样品中HIV RNA含量高低不一，最高为1.0×105拷贝/ml，最低为2×103拷贝/ml。其中有4个阴性对照。所有阳性样品都扩增出一条特异的1.3 kb DNA条带(含PR和部分RT基因)，见表2，图2。
表2 不同样品中的HIV-1 RNA拷贝数
Tab.2 HIV-1 viral RNA copy numbers in different samples RNA copies/ml
样品编号Sample no.
0
, 百拇医药 2，5，11，18
2.0×103
1，4，6，10，13，15，17，20
8.0×103
3，7，9，12，16，19
1.0×105
8，14
图2 20份血清标本的RT-PCR检测结果
Fig.2 RT-PCR detection for HIV-1 PR-RT gene in 20 sera samples
, http://www.100md.com
2.2 本方法可区分出样品中不同变异的存在情况 图3所示是五个测序样品的部分RT(Codon 34-42)序列。五个样品的血清也来源于美国病毒质控实验室。A和E样品分别来自不同病人，他们在PR和RT基因上有不少位点的核苷酸是不同的。由图3可见，在Codon40和41有4个核苷酸不同。B、C、D是A和E两样品按不同比例的混合，B样品中A、E比例为3∶1，C为1∶1，而D为1∶3。由于A和E样品的序列差异，在进行B、C、D样品的序列分析时，本方法比较实际地反映出不同样品的混合情况。如图3所示，标本A为TTTT，E为GAGA，二者以不同比例混合后则均检测为KWKW，即均能反映出混合信号。
图3 含有两种不同RT基因序列的血清样品的序列分析结果
Fig.3 Results of sequencing of HIV-1 RT genes
, 百拇医药
which contained different gene sequences
2.3 应用实例 图4所示是一患者从1998年7月到1999年11月间体内RNA的变化情况。该患者1999年3月以前一直用Stavudine和Ritonavir联合治疗，1998年11月做PR和RT序列分析时发现在PR上已产生对Ritonavir抗药的突变位点，而在RT基因上几乎无耐药变异产生。为此，在1999年3月改用Zidovudine、Lamivudine和Efavirenz三药联合治疗。1999年4月，患者血浆中病毒的RNA含量急剧下降，表明药物对病毒起到明显抑制作用。但到了1999年6月病毒RNA含量又回升到原来水平，当1999年8月做第2次序列分析时，在RT基因上产生3个新的变异，其中103位氨基酸由Lys变为Asn，184位氨基酸由Met变为Val，而215位氨基酸由Thr变为Tyr。此时的病毒已分别对Efavirenz,Lamivudine,Zidovudine产生了抗药性(图5)〔7，8〕。
, 百拇医药
图4 在治疗过程中某病人血清中病毒RNA载量的动力学
Fig.4 Dynamics of viral RNA load of HIV-1 in a patient′s
serum observed during the treatment of different drugs
3 讨论
我们利用RT-PCR和DNA序列分析技术建立了分析HIV-1 PR和RT基因抗药变异的快速检测方法。应用本文所提出的方法，从血清中提取HIV-1 RNA到报告结果仅需3 d时间，而以往常用的病毒培养耐药试验需8周才能得到结果，这大大缩短了实验结果的等待时间。在序列分析过程中，最关键的一步就是从HIV-1 RNA含量较低的血浆中扩增出足够的DNA进行下一步的测序反应。本法对所有2 000拷贝/ml以上的样品都能有效扩增。如有必要，还可用超速离心机在17 000×g 4℃下离心1 h浓缩血清，可以检测RNA含量更低的样品。
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图5 某病人体内HIV-1基因变异及其产生的药物抗性
Fig.5 The drug-resistance corresponded to the RT
gene variation of HIV-1 in a patient′s blood
在药物治疗过程中，由于HIV-1产生变异而导致抗药使得疗效降低甚至于无效。这种变异发生在PR和RT个别相关核苷酸序列位点上，当病毒群体完全发生变异时，序列分析结果表现为某一核苷酸完全被另一核苷酸取代，而在早期仅有部分病毒变异时，序列分析显示两种核苷酸的混合图形。这种混合序列提示部分病毒已开始变异，及早发现该变异将为临床及时调整治疗方案提供可靠的依据。为此，一种好的序列分析方法应能准确、灵敏地分辨混合序列，以尽早发现处于初期阶段的病毒群体变化。图3所示是本方法对ENVA Panel Ⅱ进行测定的部分序列分析结果。ENVA Panel Ⅱ曾作为标准样品分发到世界几十个从事HIV-1 PR、RT序列分析的实验室以比较不同方法对混合序列的检验准确性和灵敏度。从图中可见，本法能准确反映25%左右的混合序列。
, 百拇医药
虽然新型的治疗方法，如鸡尾酒疗法，可显著抑制病人体内病毒的复制，使患者血浆中病毒数量明显下降，但也有一些病人无法获得很好的治疗效果。究其原因，约70%的治疗失败与病毒PR和RT产生抗药变异有关〔7-10〕。本文提及的患者在很短时间内产生了对新使用药物的相应变异，导致治疗失败。目前临床上在以下几个方面广泛应用HIV-1 PR，RT序列分析：首先，是在发现新患者并开始治疗时，治疗并不需要等到序列分析结果出来才开始，治疗方案可按序列分析结果进行调整，这样有助于得到最佳治疗效果，因有文献报道Zidovudine和Lamivudine抗药变异可在不少新患者中发现〔11〕。另外，在治疗失败和调整治疗方案时需进行序列分析，以了解治疗失败的原因并提出最佳的药物配伍。对患HIV的孕妇进行序列分析并选用适当药物还有助于减少母婴传播。
本文受国家自然科学基金资助(3000761748)
参 考 文 献
, 百拇医药
1，Ho DD,Neumann AU,Perelson AS.Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection.Nature,1995,373：123-126.
2，Wei X,Ghosh SK,Taylor ME,et al.Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection.Nature,1995,337：117-122.
3，Carpenter CCJ,Fischl MA,Hammer SM,et al.Antiretroviral therapy for HIV infection in 1997.JAMA,1997,227：1962-1969.
4，Gulick RM,Mellors JW,Havlir D,et al.Treatment with Indinavir,Zidovudine,and Lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy.N Eng J Med,1997,337：734-740.
, 百拇医药
5，Hammaer SM,Squired KE,Hughes MD,et al.A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less.N Eng J Med,1997,337：725-733.
6，Larder BA,Kemp SD,Harrigan R.Potential mechanism for sustained antiretroviral efficacy of AZT-3TC combination therapy.Science,1995,269：696-699.
7，Hirsch MS,Conway B,D′Aquila RT,et al. Antiretroviral drug resistance testing in adults with HIV infection.JAMA,1998,279：1984-1991.
, http://www.100md.com
8，Hirsch MS,Brun-Vezinet F,D′aquila RT,et al.Antiretroviral drug resistance testing in adults with HIV infection. JAMA,2000,283：2417-2426.
9，Schuurman R,Brambilla D,de Groot T,et al.Second worldwide evaluation of HIV-1 drug resistance genotyping quality using the ENVA2 panel. Antiviral Ther,1999,4(suppl 1)：41 Abstract 58.
10，Mayers DL,Gallahan DL,Martin GJ,et al.Drug resistant genotypes from plasma virus of HIV-1 infected patients failing combination drug therapy.International Workshop on HIV Drug Resistance,Treatment Strategies and Eradication,St Petersberg,FL.June 1997(Abstract80).
11，Conway B,Montessori V,Rouleau D,et al. Primary lamivudine resistance in acute/early human immunodeficiency virus infection.Clin Infect Dis,1999,28：910-911
(收稿日期：2000-08-01)
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单位：俞敏 William Kabat 赵玉琪(美国西北大学附属儿童医院)；Ram Yogev 赵玉琪(美国西北大学附属儿童医院儿科系)；赵玉琪(免疫及微生物系)洪涛 赵玉琪 王健伟(中国预防医学科学病毒学研究所病毒形态学研究室)
关键词：HIV-1；蛋白酶；逆转录酶；序列分析；耐药性
中华实验和临床病毒学杂志000406 【摘要】 目的 应用现有DNA序列分析技术对人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的蛋白酶(PR)和逆转录酶(RT)基因进行简便、快速、准确的序列分析，在临床上为HIV-1患者治疗方案的确定提供可靠依据。方法 从HIV-1感染者血清中提取RNA，用套式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HIV-1的PR和RT基因片段，并对此片段进行核苷酸序列分析。结果 本方法对血清中HIV-1 RNA含量约2 000拷贝/ml以上的样品都能有效扩增。在序列分析时背景干扰少，对25%左右的混合序列均能准确反映。通过对临床治疗病人进行动态序列分析观察，发现在药物治疗过程中，病人血浆中HIV-1 RNA含量变化与PR和RT基因抗药性变异具有很大相关性。结论 PR和RT基因序列分析方法能够及时、准确地反映HIV-1患者在抗病毒药物治疗过程中病毒的变异情况。该方法的建立能在临床上能为不同患者治疗方案的确定提供直接、可靠的依据。
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Rapid detection of drug resistant HIV-1 to reverse transcriptase and protease inhibitors in HIV-infected patients receiving highly active antiretroviral therapies
YU Min, KABAT William,WANG Jianwei
(Children′s Memorial Institute for Education and Research,Northwestern University Medical School,Illinois, USA)
【Abstract】 Objective To develop and validate a rapid and sensitive method that can be used to detect emergence of HIV-1 drug resistant viruses in HIV-infected patients receiving highly active antiretroviral therapies (HAART). Methods HIV-1 viral RNA was extracted from plasma and amplified by nested RT-PCR. Nucleotide sequences of the reverse transcriptase (RT) and protease (PR) genes were determined by automated DNA sequencing. Results RT and PR sequences can be reliably determined with a minimum 2 000 copies/ml of viral RNA in plasma. Emergence of drug resistant viruses can be detected as soon as it reached to >25% of the total viral populations. By using this method, drug-resistant viral populations were found to correlate with rebound of viral RNA level after prolonged antiretroviral therapies in HIV-infected children. Conclusion This rapid and sensitive HIV-1 genotyping method can be used to predict and confirm emergence of HIV-1 drug resistance in HIV-infected patients receiving HAART.
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【Key words】 HIV-1; Reverse transcriptase; Protease; Sequence analysis; Drag resistance
随着人们对人类免疫缺陷病毒(HIV-1)在人体中复制过程的深入研究和各种抗病毒药物的不断出现〔1，2〕，HIV-1感染的治疗已取得重要进展。目前使用的HIV-1抗病毒药物主要通过抑制蛋白酶(Protease,PR)和逆转录酶(Reverse transcriptase,RT)的活性来减少病毒的复制。PR和RT抑制剂的60614,USA,E-mail:yzhao@northwestern.edu
联合使用(鸡尾酒疗法)，可有效抑制患者体内病毒的复制，使病人血浆和组织中的病毒数量明显下降，有些甚至可达<50拷贝/ml，病人的临床症状得到显著改善，存活时间延长〔3-5〕。
, 百拇医药 最新的研究发现，由于HIV-1病毒极易突变，尤其在药物作用下，会有选择地改变PR和RT部分位点上的氨基酸，从而产生耐药性〔5〕。例如RT第41位和215位氨基酸分别由Met和Thr改变为Leu和Phe时就会对AZT产生耐药性〔6〕。因此，在对HIV病人进行治疗的过程中，准确地对其HIV-1 RT和PR基因进行序列分析，有效检测体内病毒的基因变异，及时了解病毒的变异趋势，将为HIV-1感染的有效治疗提供有益指导。
1 材料和方法
1.1 样品来源 进行检测的血清分别来自美国ACTG(AIDS Clinical Trial Groups)各病毒质控实验室、ENVA(European Net-work for the Virological Evaluation of International Trials for new Anti-HIV Therapies) Panel Ⅱ以及在该院的临床治疗病人。
, 百拇医药
1.2 临床治疗所用药物 本文中HIV感染者使用了一种蛋白酶抑制剂和四种逆转录酶抑制剂，包括：Ritonavir(蛋白酶抑制剂，商标名Norvir,Abbott公司)；Combivir〔逆转录酶抑制剂，Lamivudine (3TC),Epivir和Zidovuding(AZT);Retrovir,混和药物，葛兰素-威康公司〕；Efavirenz(逆转录酶抑制剂，商标名：Sustiva,杜邦药业公司)；Stavudine (d4T)(逆转录酶抑制剂，商标名:Zerit,施贵宝公司)。
1.3 病毒RNA的提取 使用QIAGEN公司改良的QIAamp HCV RNA试剂盒提取血清中的病毒RNA。每个样品用300 μl血清，最终提取到的病毒RNA溶在50 μl水中，-70℃保存。
1.4 RNA的逆转录和套式PRC ①使用Life Technologies公司的Superscript One Step试剂盒，用引物RT21和MAW-26(见表1)完成逆转录和首轮PCR反应。反应体系为：0.5 μl浓度为50 pmol/μl的引物，Mg2+浓度为5 mmol/L，Superscript-Taq酶混合物10 U，10 μl提取的RNA，反应体积为50 μl。反应条件为45℃ 30min，94℃ 2 min，一个循环；94℃ 25 s，55℃ 20 s，72℃ 2 min，30个循环。最后72℃延伸10 min。②用引物RT20和USPR进行第2轮PCR扩增反应。反应体系为：0.2 μl浓度为50 pmol/μl的引物，Mg2+浓度为3.5 mmol/L，Taq Gold酶5 U，5 μl第1轮PCR反应产物，总反应体积100 μl。反应条件：95℃ 5 min,一个循环；95℃ 25 s，63℃ 20 s，72℃ 2 min，35个循环；72℃ 10 min。
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1.5 PCR产物的纯化 用QIAGEN公司QIAquick PCR试剂盒纯化第2轮PCR产物，最终溶于50 μl水中。
1.6 核苷酸序列测定 使用PE Biosystems公司BIG Dye测序反应试剂盒进行测序反应。反应体系为：DNA模板用量为100 ng，引物量为5～10 pmol/L，反应体积20 μl。反应条件为：96℃ 10 s,50℃5 s,60℃ 3 min,25个循环。最终在PE Biosystems公司的ABI 377型自动DNA测序仪上进行序列测定。在测序时应用10个不同的测序引物对用套式RT-PCR扩增产生的DNA进行测序分析(表1，图1)。所测序列包括PR基因1～99密码子和RT基因
表1 RT-PCR扩增与HIV-1 PR-RT基因测序引物
Tab.1 RT-PCR and sequencing primers for HIV-1 PR-RT gene 引物Primer
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引物序列(5′-3′)
Primer sequence(5′-3′)
5′/3′引物
5′/3′ primer
位置
Location
套式PCR
Nested PCR
第一轮RT-PCR
First round RT-PCR
MAW-26
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TTG GAA ATG TGG AAA GGA AGG AC
5′
2028-2050
RT-21
CTG TAT TTC TGC TAT TAA GTC TTT TGA TGG G
3′
3509-3539
第二轮PCR
Second round PCR
PRO-1
CAG AGC CAA CAG CCC CAC CA
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5′
2147-2166
RT-20
CTG CCA GTT CTA GCT CTG CTT C
3′
3441-3462
PR-RT基因测序
PR-RT gene sequenaing
A
TTC CCA TTA GTC CTA TT
5′
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2548-2564
B
GGA TGG AAA GGA TCA CC
5′
3003-3019
C
CTG CGG GAT GTG GTA TTC CT
3′
2825-2844
D
GCA CTA TAG GCT GTA CTG TC
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3266-3285
3W
ATG TTT TTT GTC TGG TGT GGT
3′
3192-3212
M2661
GTA AAT CTG ACT TGC CCA AAT TC
3′
3340-3362
RT20
CTG CCA GTT CTA GCT CTG CTT C
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3′
3441-3462
RPO-1
CAG AGCCAA CAG CCC CAC CA
5′
2147-2164
DSPR
GGG CCA TCC ATT CCT GGC
3′
2588-2605
PSR2
ATG CCT TTA TTT TTT CTT CTG TC
, 百拇医药
3′
2649-2672
图1 RT-PCR与DNA序列分析策略
Fig.1 Strategies of RT-PCR and DNA sequencing of HIV-1 PR-RT gene
1～280密码子。
1.7 序列分析和软件应用 测得的序列经PE Biosystems公司的Sequencing Analysis和Factura软件编辑后，用PE Biosystems公司的AutoAssembler和Navigator软件与HIV-1参比序列pNL4-3进行比较，以辨认特异的抗药变异。
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2 结果
2.1 样品检测结果 用套式RT-PCR对20个来源于美国病毒质控实验室的血清标本进行DNA扩增。20个样品中HIV RNA含量高低不一，最高为1.0×105拷贝/ml，最低为2×103拷贝/ml。其中有4个阴性对照。所有阳性样品都扩增出一条特异的1.3 kb DNA条带(含PR和部分RT基因)，见表2，图2。
表2 不同样品中的HIV-1 RNA拷贝数
Tab.2 HIV-1 viral RNA copy numbers in different samples RNA copies/ml
样品编号Sample no.
0
, 百拇医药 2，5，11，18
2.0×103
1，4，6，10，13，15，17，20
8.0×103
3，7，9，12，16，19
1.0×105
8，14
图2 20份血清标本的RT-PCR检测结果
Fig.2 RT-PCR detection for HIV-1 PR-RT gene in 20 sera samples
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2.2 本方法可区分出样品中不同变异的存在情况 图3所示是五个测序样品的部分RT(Codon 34-42)序列。五个样品的血清也来源于美国病毒质控实验室。A和E样品分别来自不同病人，他们在PR和RT基因上有不少位点的核苷酸是不同的。由图3可见，在Codon40和41有4个核苷酸不同。B、C、D是A和E两样品按不同比例的混合，B样品中A、E比例为3∶1，C为1∶1，而D为1∶3。由于A和E样品的序列差异，在进行B、C、D样品的序列分析时，本方法比较实际地反映出不同样品的混合情况。如图3所示，标本A为TTTT，E为GAGA，二者以不同比例混合后则均检测为KWKW，即均能反映出混合信号。
图3 含有两种不同RT基因序列的血清样品的序列分析结果
Fig.3 Results of sequencing of HIV-1 RT genes
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which contained different gene sequences
2.3 应用实例 图4所示是一患者从1998年7月到1999年11月间体内RNA的变化情况。该患者1999年3月以前一直用Stavudine和Ritonavir联合治疗，1998年11月做PR和RT序列分析时发现在PR上已产生对Ritonavir抗药的突变位点，而在RT基因上几乎无耐药变异产生。为此，在1999年3月改用Zidovudine、Lamivudine和Efavirenz三药联合治疗。1999年4月，患者血浆中病毒的RNA含量急剧下降，表明药物对病毒起到明显抑制作用。但到了1999年6月病毒RNA含量又回升到原来水平，当1999年8月做第2次序列分析时，在RT基因上产生3个新的变异，其中103位氨基酸由Lys变为Asn，184位氨基酸由Met变为Val，而215位氨基酸由Thr变为Tyr。此时的病毒已分别对Efavirenz,Lamivudine,Zidovudine产生了抗药性(图5)〔7，8〕。
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图4 在治疗过程中某病人血清中病毒RNA载量的动力学
Fig.4 Dynamics of viral RNA load of HIV-1 in a patient′s
serum observed during the treatment of different drugs
3 讨论
我们利用RT-PCR和DNA序列分析技术建立了分析HIV-1 PR和RT基因抗药变异的快速检测方法。应用本文所提出的方法，从血清中提取HIV-1 RNA到报告结果仅需3 d时间，而以往常用的病毒培养耐药试验需8周才能得到结果，这大大缩短了实验结果的等待时间。在序列分析过程中，最关键的一步就是从HIV-1 RNA含量较低的血浆中扩增出足够的DNA进行下一步的测序反应。本法对所有2 000拷贝/ml以上的样品都能有效扩增。如有必要，还可用超速离心机在17 000×g 4℃下离心1 h浓缩血清，可以检测RNA含量更低的样品。
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图5 某病人体内HIV-1基因变异及其产生的药物抗性
Fig.5 The drug-resistance corresponded to the RT
gene variation of HIV-1 in a patient′s blood
在药物治疗过程中，由于HIV-1产生变异而导致抗药使得疗效降低甚至于无效。这种变异发生在PR和RT个别相关核苷酸序列位点上，当病毒群体完全发生变异时，序列分析结果表现为某一核苷酸完全被另一核苷酸取代，而在早期仅有部分病毒变异时，序列分析显示两种核苷酸的混合图形。这种混合序列提示部分病毒已开始变异，及早发现该变异将为临床及时调整治疗方案提供可靠的依据。为此，一种好的序列分析方法应能准确、灵敏地分辨混合序列，以尽早发现处于初期阶段的病毒群体变化。图3所示是本方法对ENVA Panel Ⅱ进行测定的部分序列分析结果。ENVA Panel Ⅱ曾作为标准样品分发到世界几十个从事HIV-1 PR、RT序列分析的实验室以比较不同方法对混合序列的检验准确性和灵敏度。从图中可见，本法能准确反映25%左右的混合序列。
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虽然新型的治疗方法，如鸡尾酒疗法，可显著抑制病人体内病毒的复制，使患者血浆中病毒数量明显下降，但也有一些病人无法获得很好的治疗效果。究其原因，约70%的治疗失败与病毒PR和RT产生抗药变异有关〔7-10〕。本文提及的患者在很短时间内产生了对新使用药物的相应变异，导致治疗失败。目前临床上在以下几个方面广泛应用HIV-1 PR，RT序列分析：首先，是在发现新患者并开始治疗时，治疗并不需要等到序列分析结果出来才开始，治疗方案可按序列分析结果进行调整，这样有助于得到最佳治疗效果，因有文献报道Zidovudine和Lamivudine抗药变异可在不少新患者中发现〔11〕。另外，在治疗失败和调整治疗方案时需进行序列分析，以了解治疗失败的原因并提出最佳的药物配伍。对患HIV的孕妇进行序列分析并选用适当药物还有助于减少母婴传播。
本文受国家自然科学基金资助(3000761748)
参 考 文 献
, 百拇医药
1，Ho DD,Neumann AU,Perelson AS.Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection.Nature,1995,373：123-126.
2，Wei X,Ghosh SK,Taylor ME,et al.Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection.Nature,1995,337：117-122.
3，Carpenter CCJ,Fischl MA,Hammer SM,et al.Antiretroviral therapy for HIV infection in 1997.JAMA,1997,227：1962-1969.
4，Gulick RM,Mellors JW,Havlir D,et al.Treatment with Indinavir,Zidovudine,and Lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy.N Eng J Med,1997,337：734-740.
, 百拇医药
5，Hammaer SM,Squired KE,Hughes MD,et al.A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less.N Eng J Med,1997,337：725-733.
6，Larder BA,Kemp SD,Harrigan R.Potential mechanism for sustained antiretroviral efficacy of AZT-3TC combination therapy.Science,1995,269：696-699.
7，Hirsch MS,Conway B,D′Aquila RT,et al. Antiretroviral drug resistance testing in adults with HIV infection.JAMA,1998,279：1984-1991.
, http://www.100md.com
8，Hirsch MS,Brun-Vezinet F,D′aquila RT,et al.Antiretroviral drug resistance testing in adults with HIV infection. JAMA,2000,283：2417-2426.
9，Schuurman R,Brambilla D,de Groot T,et al.Second worldwide evaluation of HIV-1 drug resistance genotyping quality using the ENVA2 panel. Antiviral Ther,1999,4(suppl 1)：41 Abstract 58.
10，Mayers DL,Gallahan DL,Martin GJ,et al.Drug resistant genotypes from plasma virus of HIV-1 infected patients failing combination drug therapy.International Workshop on HIV Drug Resistance,Treatment Strategies and Eradication,St Petersberg,FL.June 1997(Abstract80).
11，Conway B,Montessori V,Rouleau D,et al. Primary lamivudine resistance in acute/early human immunodeficiency virus infection.Clin Infect Dis,1999,28：910-911
(收稿日期：2000-08-01)
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