人朊蛋白基因外显子Ⅰ及其上游序列具有启动子样活性
作者：孙宪锋 董小平 周伟 洪涛
单位：中国预防医学科学院病毒学研究所病毒形态研究室 北京 100052
关键词：朊蛋白基因；启动区(遗传学)；转录；遗传；转染
中华实验和临床病毒学杂志000401 【摘要】 目的 鉴定朊蛋白(PrP)基因转录启动子位置。方法 利用聚合酶链反应(PCR)扩增人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列，序列鉴定后插入CAT报道质粒pBL-CAT6，分别转染HeLa、COS7和Sh-sy5y细胞系，检测CAT表达值；提取三种细胞蛋白，以条带移动实验检测细胞转录激活因子SP1含量。结果 人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列为GC富含，带有多个SP1可能性结合位点，但无明显TATA盒；瞬时转染结果显示这段序列可诱导2～3倍的CAT表达增强；定量移动条带实验证明HeLa细胞中含有较高浓度的SP1，而COS7和Sh-sy5y细胞中SP1含量极低。结论 人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列具有启动子样功能，为弱的非TATA盒启动子；不同组织来源的细胞中SP1含量不同，在神经细胞系Sh-sy5y中人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列的启动子活性似乎不依赖于SP1蛋白。
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The sequence of the human PrP gene Exon Ⅰ and its upstream segment has promoter-like activity
SUN Xianfeng, DONG Xiaoping, ZHOU Wei
(Institute of Virology,Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, China)
【Abstract】 Objective The human PrP gene locates at the short-arm of the 20th chromosome. This article is was to map the promoter that transcribes the human PrP gene. Methods The sequence of the human PrP gene Exon Ⅰ and its upstream segment were amplified using PCR, and inserted into a CAT reporter plasmid pBL-CAT6 after sequence analysis. The values of the relative CAT expression under the control of this fragment were evaluated after transiently transfected into HeLa, COS7 and Sh-sy5y cell lines. The amounts of transcription activator SP1 in these three cell lines were calculated with band-shift assays. Results Analysis of the human PrP gene Exon Ⅰ and its upstream segment showed a GC-rich sequence, with several potential SP1 binding sites, but without any TATA-box. Under the control of this fragment, the CAT expressions were 2-3 folds increased in transient transfection. Quantity band-shift assays revealed that SP1 was enriched in HeLa cells, but undetectable in COS7 and Sh-sy5y cells. Conclusion The sequence of the human PrP gene Exon Ⅰ and its upstream segment functions as a promoter-like sequence, probably being as a weak TATA-less promoter. Cells derived from different tissues contain different amount of SP1. The activity of this promoter-like sequence seems to be independent of SP1 presence.
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【Key words】 PrP gene; Promoter regions(genetics); Transcription,genetic; Transfection
克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease,CJD)又称可传播性海绵样脑病(Transmissible spongiform encephalopathies,TSE)或朊病毒病(Prion disease)，是一类涉及中枢神经系统的退行性脑病。其致病因子目前被认为是朊蛋白(Prion or PrP)。正常人的朊蛋白被证实是由细胞PrP基因编码产生，其基因位点位于20号染色体短臂〔1〕。正常的朊蛋白与致病性朊蛋白具有相同的氨基酸序列，其空间结构发生变化后由正常的以α螺旋为主的结构(PrPC)转变为异常的以β片层为主的结构(PrPSc)。这种病变的PrPSc沉积在脑组织中，引起神经系统的病理变化，导致临床症状的出现〔2〕。同时，出现的PrPSc还可促使正常的PrPC转变为致病的PrPSc〔3〕。
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研究显示，不同组织来源的细胞中朊蛋白的表达程度差异很大，主要出现于神经细胞中〔4，5〕。细胞间朊蛋白表达的差异提示在朊蛋白表达的控制区域可能存在着组织特异性的调节单位。目前对PrP启动子及其调控区域的研究甚少。本实验从人外周血白细胞中扩增出人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列，对这段序列的进一步检测发现具有启动子样活性。同时还证实在神经细胞中细胞转录增强子SP1的含量较上皮类细胞明显为低，PrP启动子样序列的活性似乎不依赖于SP1。
1 材料和方法
1.1 PCR 扩增PrP外显子Ⅰ及其上游序列〔6〕的引物由上海生工公司合成，p1：GGC/CGG/CCG/CCC/GCC/GCG/GGG；p2：CTG/CCT/CGG/TCG/TGA/GGA/GAG。提取人白细胞DNA，1 μg模板DNA与2.5 U pwo polymerase(Boehringer Mannheim公司产品)，200 μmol/L dNTP，1 μmol/L的引物进行PCR反应，反应条件为97℃ 1 min，65℃ 1 min，72℃ 1 min，共35个循环。
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1.2 质粒构建 PCR产物在T4DNA磷酸激酶(Promage公司产品)的作用下进行末端磷酸化，与pUC19 Hinc Ⅱ酶切片段连接，转化大肠埃希菌XL1-blue。经过酶切鉴定(Hind Ⅲ, BamH Ⅰ和Nar Ⅰ，Hind Ⅲ)后选出正向克隆的质粒命名为pUC-p。重组质粒中的插入片段用ABI377自动分析仪测序。以Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切pUC-p，游离回收插入片段，定向克隆至质粒pBLCAT6相应位点，构成质粒pCAT6-p。
1.3 细胞培养及转染 COS7、HeLa、sh-sy5y细胞系在含10%小牛血清的DMEM(GIBCO BRL公司产品)培养液中生长。细胞生长至70%～80%时采用磷酸钙法转染〔7〕，简述如下：4 μg质粒DNA，1.6 μg pCMV-Lac-z DNA 与15 μl 2mol/L氯化钙，150 μl 2×HBS液(280 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L Na2HPO4，12 mmol/L葡萄糖，50 mmol/L HEPES)，室温作用20 min，缓慢滴加至单层培养细胞。
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1.4 CAT表达量的检测 转染48 h后收获细胞。离心沉定细胞，用0.35 ml裂解液(CAT ELISA试剂盒提供)悬浮，室温作用10 min。反复冻融3次，3 000 r/min离心10 min，收集上清。取200 μl用CAT ELISA试剂盒(Boehringer Mannheim公司产品)检测CAT表达量，405 nm光波下测吸光度A值。取100 μl加50 μl 4 mg/ml ONPG(SIGMA公司产品)，37℃水浴1 h，在420 nm光波下测β-gal的A值。
1.5 细胞蛋白提取与浓缩 分别收集培养3～5 d的上述三种细胞，离心去上清。沉淀用100 μl PBS悬浮，反复冻融3次，3 000 r/min 离心10 min，取上清。经浓缩离心管(Pall Filtron公司产品)浓缩，蛋白质定量试剂(Bio-Rad公司产品)定量，-70℃保存。
1.6 条带移动实验 oligo-SP1为40 bp的人乳头瘤病毒(Human papilloamvirus,HPV)16型双链DNA(nt 7 836-7 875)，其含有DNA结合蛋白SP1的结合位点〔8〕。探针标记采用末端标记法，2 μg oligo-SP1、10 μCi γ-32-P-ATP、5 U T4 DNA 磷酸激酶，37℃作用1 h。酒精沉淀干燥，溶于50 μl的TE中。10 μg细胞提取物与0.5-2 μl32P标记的oligo在300 μg/ml牛血清白蛋白、5 μmol/L DTT、10 μmol/L亚精胺和0.5～1.0 μg dIdC的条件下室温反应30 min。反应结束后进行5%的非变性PAGE胶电泳，真空干胶后放射自显影。条带移动实验的竞争抑制实验所用的竞争物oligo-HPV18-WT(5′-AGC/TTA/GGG/AGT/AAC/CGA/AAA/CGG/TA-3′)为HPV18 DNA序列。oligo-T7(5′-TCGATAATACGACTCAC
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TATAGGGAGAGATC-3′)为T7启动子序列。与32P标记的oligo反应之前，HeLa细胞提取物先与50及400倍的未标记竞争oligo反应20 min。
2 结果
2.1 人PrP外显子Ⅰ及其上游序列 以提取的正常人外周血白细胞DNA为模板扩增出203 bp的PrP外显子Ⅰ及其上游序列。其核苷酸序列结果见图1。此序列与Puckett报道的人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列〔6〕相比较，同源性为90.8%。对这段序列进一步分析未发现有TATA盒结构存在，但GC含量高达79.8%，同时含有3个CCGCCC序列。这一结构为细胞转录因子SP1的结合位点。
图1 人PrP基因外显子Ⅰ及其上游核苷酸序列
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Fig.1 The nucleotide sequence of the human PrP gene
Exon Ⅰ and its upstream segment
2.2 人PrP外显子Ⅰ及其上游 序列具有启动子样活性 将构建的带有人PrP外显子Ⅰ及其上游序列的CAT报道质粒分别瞬时转染COS7、HeLa、Sh-sy5y 3种细胞系，进行CAT表达值测定。与空载体pBLCAT6 CAT检测结果相比，人PrP外显子Ⅰ及其上游序列在HeLa细胞、COS7细胞和Sh-sy5y细胞中分别可诱导产生2.0、3.0及2.5倍的CAT表达增强(图2)。这提示此段序列可能具有弱的启动子样功能。
图2 人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列具有启动子样活性
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Fig.2 The sequence of the human PrP gene Exon Ⅰ and its
upstream segment has promoter-like activity
1:HeLa cells. 2:Sh-sy5y cells. 3:COS7 cells. The values
of CAT expression were the averaged from at least
three independent transfections
2.3 不同细胞中SP1的含量有差异 为了观测SP1蛋白在不同组织来源的细胞中其含量有无差异，从而进一步推测SP1对此段启动子样序列的影响，我们提取细胞蛋白与带有SP1特异性结合位点的双链oligo〔8〕进行条带移动实验。结果显示三种细胞提取物均可同32P标记的oligo形成多个蛋白-DNA复合物(图3)，其中复合物A的泳动位置与文献报道的SP1-DNA复合泳动位置相似〔8〕。同时可以看出复合物A的含量在HeLa细胞中最高，而在COS7和Sh-sy5y细胞中几乎没有(图3)，而三种细胞提取物的SDS-PAGE电泳图形几乎没有差别。提示不同组织来源的细胞系中SP1的含量差别很大。为了进一步确定复合物A的确为SP1-DNA复合物，我们在条带移动实验的基础上进一步进行竞争抑制实验。图4显示HeLa细胞提取物所形成的复合物A在有50倍未标记的带有SP1结合位点的同源oligo-HPV18-WT存在时条带消失，而不受等量未标记无SP1结合位点的oligo-T7的影响。其他蛋白-DNA复合物在此浓度的竞争oligo条件下基本不受影响。表明复合物A确系SP1蛋白结合物。
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图3 三种细胞中内源性SP1的检测
Fig.3 Detection of endogenous SP1 in three tested cell lines
1：COS7.2：HeLa.3：Sh-sy5y. Arrows A to E indicated the different protein-DNA complexes,arrow F represented the unbound probe oligo
3 讨论
一般启动子都有一个共同的结构模式，在-25～-35位有TATA盒，具有较高的转录活性。也有一些启动子不具有TATA盒，为富含GC的启动子，多属于看家基因，一般含数个分离的转录启始点〔9〕。另外，还有一类启动子既不含TATA盒，也没有GC富含区〔10〕。在我们的实验中，从人白细胞DNA中克隆出的这段PrP外显子Ⅰ及其上游序列即显示GC富含的特点，且经过不同细胞系的转染，证实这段序列确实具有启动子的作用。与TATA盒启动子相比，TATA-less启动子的活性一般较弱，我们的实验结果也证明了这点。此外，所克隆的PrP外显子Ⅰ及其上游序列仅为203 bp，有可能缺少组织特异性增强子序列，这也可能是CAT相对表达值较低的原因。
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SP1是一种DNA结合蛋白，它可与相应的靶DNA结合，促进基因的转录。其结合位点通常位于ATTA盒和非TATA盒启动子的前面〔8，9〕。我们获得的具有启动子样活性的PrP外显子Ⅰ及其上游序列显示出极高的“GC”含量，其中具有多个可能的SP1结合位点。但等量细胞提取物的条带移动实验结果显示SP1在不同组织来源的细胞系中含量不同，在神经母细胞瘤细胞系Sh-sy5y中含量极低。而人PrP外显子Ⅰ及其上游序列却能在SP1含量极低的Sh-sy5y和COS7细胞，以及SP1含量较高的HeLa细胞均显示出启动子活性，甚至在前两种细胞系中的活性还略高于HeLa细胞。这提示转录激活蛋白SP1对这一非TATA启动子在上述两种细胞系中的活性并非起关键作用，还可能存在有其他细胞转录因子，甚至是组织特异性转录因子决定了这一启动子的活性。
所用细胞提取物来自HeLa细胞系。1：未加任何竞争抑制物；2，3：400和50倍未标记oligo-HPV18-WT；4，5：400和50倍未标记oligo-T7.箭头A-E表示不同的蛋白-DNA复合物，箭头F表示未结合的探针oligo
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图4 竞争抑制实验鉴定特异性SP1-DNA复合物
Fig.4 Identification of the specific SP1-DNA complex
using competitive inhibition test
The extracts used in the assay were derived from HeLa cells.1:Without any competitor;2 and 3:400-and 50-fold cold homologous competitor oligo-HPV18-WT;4 and 5:400-and 50-fold cold heterogenous oilgo-T7.Arrows A to E indicate the different protein-DNAcomplexes,arrow F represents the unbound probeoligo
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PrP基因存在于人及动物的体细胞内，为一相对保守基因。但PrP蛋白多存在于中枢神经细胞〔4，5〕。这提示可能会存在有某种或某些神经组织特异性转录增强因子或蛋白控制着PrP启动子的活性。我们实验结果也显示了这种可能性的存在。对神经组织特异性转录增强因子或蛋白的筛选及鉴定必将有助于阐明PrP基因的转录特点，为朊病毒病的发病机理研究和有效的防治提供科学基础。
以往实验显示细胞转录激活因子NF1在子宫颈癌细胞系HT3和C33A中的表达量有所差别〔11〕，SP1/SP3的含量在不同生长阶段的粘膜上皮细胞中也有差别〔12〕。我们的实验结果表明，SP1在上皮来源的HeLa细胞中含量较高，而纤维组织来源细胞COS7和神经组织来源细胞Sh-sy5y中含量极低，这再次证明了这种上皮细胞广泛存在的活性蛋白在其他组织中表达甚低。不同组织来源的细胞中其活性蛋白含量的差异，将影响基因表达调控序列在不同细胞中的作用，从而影响基因的表达。
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本文为国家863高科技发展计划资助项目(863-102-11-03-05)
参 考 文 献
1，Sparkes RS,Simon M,Cohn VH,et al.Assignment of the human and mouse prion protein genes to homologous chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A,1986,83：7358-7362.
2，Prusiner SB.Molecular biology of prion diseases. Science,1991,252：1515-1522.
3，Brown P,Preece MA,Will RG.“Friendly fire” in medicine:hormones, homografts,and Creutzfeldt-Jakob disease.Lancet,1992,340：24-27.
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4，Baybutt H,Manson J. Characterization of two promoters for prion protein (PrP) gene expression in neural cells. Gene,1997,184：125-131.
5，孙宪锋，董小平，张宝云，等.人朊病毒多肽抗体的制备及应用.中华微生物和免疫学杂志，2000，20:70-73.
6，Puckett C,Concannon P,Casey C,et al. Genomic structure of the human prion protein gene. Am J Hum Genet,1991,49：320-329.
7，Dong XP,Stubenrauch F,Beyer-Finkler E,et al.Prevalence of deletions of YY1-binding sites in episomal HPV 16 DNA from cervical cancers. Int J Cancer,1994,58：803-808.
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8，Dong XP,Pfister H.Overlapping YY1-and abrrant SP1-binding sites proximal to the early promoter of human papillomavirus type.J Gen Virol,1999,80：2097-2101.
9，Lee K, Richardson CD,Razik MA,et al.Multiple potential regulatory elements in the 5' flanking region of the human alpha 1a-adrenergic receptor. DNA Seq,1998,8：271-276.
10，Tone M,Thompson SA,Tone Y,et al.Regulation of IL-18(IFN-gamma-inducing factor) gene expression. J Immunol,1997,159：6156-6163.
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11，董小平，刘红，Pfister H.细胞转录调节因子YY1及其对人乳头瘤病毒16型早期启动子P97抑制效应广泛存在于人上皮细胞.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12：217-222.
12，Apt D,Watts RM,Suske G,et al. High SP1/SP3 ratios in epithelial cells during epithelial differentiation and cellular transformation correlate with the activation of the HPV-16 promoter.Viology,1996,224：281-291.
(收稿日期：2000-06-21)
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单位：中国预防医学科学院病毒学研究所病毒形态研究室 北京 100052
关键词：朊蛋白基因；启动区(遗传学)；转录；遗传；转染
中华实验和临床病毒学杂志000401 【摘要】 目的 鉴定朊蛋白(PrP)基因转录启动子位置。方法 利用聚合酶链反应(PCR)扩增人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列，序列鉴定后插入CAT报道质粒pBL-CAT6，分别转染HeLa、COS7和Sh-sy5y细胞系，检测CAT表达值；提取三种细胞蛋白，以条带移动实验检测细胞转录激活因子SP1含量。结果 人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列为GC富含，带有多个SP1可能性结合位点，但无明显TATA盒；瞬时转染结果显示这段序列可诱导2～3倍的CAT表达增强；定量移动条带实验证明HeLa细胞中含有较高浓度的SP1，而COS7和Sh-sy5y细胞中SP1含量极低。结论 人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列具有启动子样功能，为弱的非TATA盒启动子；不同组织来源的细胞中SP1含量不同，在神经细胞系Sh-sy5y中人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列的启动子活性似乎不依赖于SP1蛋白。
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The sequence of the human PrP gene Exon Ⅰ and its upstream segment has promoter-like activity
SUN Xianfeng, DONG Xiaoping, ZHOU Wei
(Institute of Virology,Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, China)
【Abstract】 Objective The human PrP gene locates at the short-arm of the 20th chromosome. This article is was to map the promoter that transcribes the human PrP gene. Methods The sequence of the human PrP gene Exon Ⅰ and its upstream segment were amplified using PCR, and inserted into a CAT reporter plasmid pBL-CAT6 after sequence analysis. The values of the relative CAT expression under the control of this fragment were evaluated after transiently transfected into HeLa, COS7 and Sh-sy5y cell lines. The amounts of transcription activator SP1 in these three cell lines were calculated with band-shift assays. Results Analysis of the human PrP gene Exon Ⅰ and its upstream segment showed a GC-rich sequence, with several potential SP1 binding sites, but without any TATA-box. Under the control of this fragment, the CAT expressions were 2-3 folds increased in transient transfection. Quantity band-shift assays revealed that SP1 was enriched in HeLa cells, but undetectable in COS7 and Sh-sy5y cells. Conclusion The sequence of the human PrP gene Exon Ⅰ and its upstream segment functions as a promoter-like sequence, probably being as a weak TATA-less promoter. Cells derived from different tissues contain different amount of SP1. The activity of this promoter-like sequence seems to be independent of SP1 presence.
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【Key words】 PrP gene; Promoter regions(genetics); Transcription,genetic; Transfection
克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease,CJD)又称可传播性海绵样脑病(Transmissible spongiform encephalopathies,TSE)或朊病毒病(Prion disease)，是一类涉及中枢神经系统的退行性脑病。其致病因子目前被认为是朊蛋白(Prion or PrP)。正常人的朊蛋白被证实是由细胞PrP基因编码产生，其基因位点位于20号染色体短臂〔1〕。正常的朊蛋白与致病性朊蛋白具有相同的氨基酸序列，其空间结构发生变化后由正常的以α螺旋为主的结构(PrPC)转变为异常的以β片层为主的结构(PrPSc)。这种病变的PrPSc沉积在脑组织中，引起神经系统的病理变化，导致临床症状的出现〔2〕。同时，出现的PrPSc还可促使正常的PrPC转变为致病的PrPSc〔3〕。
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研究显示，不同组织来源的细胞中朊蛋白的表达程度差异很大，主要出现于神经细胞中〔4，5〕。细胞间朊蛋白表达的差异提示在朊蛋白表达的控制区域可能存在着组织特异性的调节单位。目前对PrP启动子及其调控区域的研究甚少。本实验从人外周血白细胞中扩增出人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列，对这段序列的进一步检测发现具有启动子样活性。同时还证实在神经细胞中细胞转录增强子SP1的含量较上皮类细胞明显为低，PrP启动子样序列的活性似乎不依赖于SP1。
1 材料和方法
1.1 PCR 扩增PrP外显子Ⅰ及其上游序列〔6〕的引物由上海生工公司合成，p1：GGC/CGG/CCG/CCC/GCC/GCG/GGG；p2：CTG/CCT/CGG/TCG/TGA/GGA/GAG。提取人白细胞DNA，1 μg模板DNA与2.5 U pwo polymerase(Boehringer Mannheim公司产品)，200 μmol/L dNTP，1 μmol/L的引物进行PCR反应，反应条件为97℃ 1 min，65℃ 1 min，72℃ 1 min，共35个循环。
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1.2 质粒构建 PCR产物在T4DNA磷酸激酶(Promage公司产品)的作用下进行末端磷酸化，与pUC19 Hinc Ⅱ酶切片段连接，转化大肠埃希菌XL1-blue。经过酶切鉴定(Hind Ⅲ, BamH Ⅰ和Nar Ⅰ，Hind Ⅲ)后选出正向克隆的质粒命名为pUC-p。重组质粒中的插入片段用ABI377自动分析仪测序。以Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切pUC-p，游离回收插入片段，定向克隆至质粒pBLCAT6相应位点，构成质粒pCAT6-p。
1.3 细胞培养及转染 COS7、HeLa、sh-sy5y细胞系在含10%小牛血清的DMEM(GIBCO BRL公司产品)培养液中生长。细胞生长至70%～80%时采用磷酸钙法转染〔7〕，简述如下：4 μg质粒DNA，1.6 μg pCMV-Lac-z DNA 与15 μl 2mol/L氯化钙，150 μl 2×HBS液(280 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L Na2HPO4，12 mmol/L葡萄糖，50 mmol/L HEPES)，室温作用20 min，缓慢滴加至单层培养细胞。
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1.4 CAT表达量的检测 转染48 h后收获细胞。离心沉定细胞，用0.35 ml裂解液(CAT ELISA试剂盒提供)悬浮，室温作用10 min。反复冻融3次，3 000 r/min离心10 min，收集上清。取200 μl用CAT ELISA试剂盒(Boehringer Mannheim公司产品)检测CAT表达量，405 nm光波下测吸光度A值。取100 μl加50 μl 4 mg/ml ONPG(SIGMA公司产品)，37℃水浴1 h，在420 nm光波下测β-gal的A值。
1.5 细胞蛋白提取与浓缩 分别收集培养3～5 d的上述三种细胞，离心去上清。沉淀用100 μl PBS悬浮，反复冻融3次，3 000 r/min 离心10 min，取上清。经浓缩离心管(Pall Filtron公司产品)浓缩，蛋白质定量试剂(Bio-Rad公司产品)定量，-70℃保存。
1.6 条带移动实验 oligo-SP1为40 bp的人乳头瘤病毒(Human papilloamvirus,HPV)16型双链DNA(nt 7 836-7 875)，其含有DNA结合蛋白SP1的结合位点〔8〕。探针标记采用末端标记法，2 μg oligo-SP1、10 μCi γ-32-P-ATP、5 U T4 DNA 磷酸激酶，37℃作用1 h。酒精沉淀干燥，溶于50 μl的TE中。10 μg细胞提取物与0.5-2 μl32P标记的oligo在300 μg/ml牛血清白蛋白、5 μmol/L DTT、10 μmol/L亚精胺和0.5～1.0 μg dIdC的条件下室温反应30 min。反应结束后进行5%的非变性PAGE胶电泳，真空干胶后放射自显影。条带移动实验的竞争抑制实验所用的竞争物oligo-HPV18-WT(5′-AGC/TTA/GGG/AGT/AAC/CGA/AAA/CGG/TA-3′)为HPV18 DNA序列。oligo-T7(5′-TCGATAATACGACTCAC
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TATAGGGAGAGATC-3′)为T7启动子序列。与32P标记的oligo反应之前，HeLa细胞提取物先与50及400倍的未标记竞争oligo反应20 min。
2 结果
2.1 人PrP外显子Ⅰ及其上游序列 以提取的正常人外周血白细胞DNA为模板扩增出203 bp的PrP外显子Ⅰ及其上游序列。其核苷酸序列结果见图1。此序列与Puckett报道的人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列〔6〕相比较，同源性为90.8%。对这段序列进一步分析未发现有TATA盒结构存在，但GC含量高达79.8%，同时含有3个CCGCCC序列。这一结构为细胞转录因子SP1的结合位点。
图1 人PrP基因外显子Ⅰ及其上游核苷酸序列
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Fig.1 The nucleotide sequence of the human PrP gene
Exon Ⅰ and its upstream segment
2.2 人PrP外显子Ⅰ及其上游 序列具有启动子样活性 将构建的带有人PrP外显子Ⅰ及其上游序列的CAT报道质粒分别瞬时转染COS7、HeLa、Sh-sy5y 3种细胞系，进行CAT表达值测定。与空载体pBLCAT6 CAT检测结果相比，人PrP外显子Ⅰ及其上游序列在HeLa细胞、COS7细胞和Sh-sy5y细胞中分别可诱导产生2.0、3.0及2.5倍的CAT表达增强(图2)。这提示此段序列可能具有弱的启动子样功能。
图2 人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列具有启动子样活性
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Fig.2 The sequence of the human PrP gene Exon Ⅰ and its
upstream segment has promoter-like activity
1:HeLa cells. 2:Sh-sy5y cells. 3:COS7 cells. The values
of CAT expression were the averaged from at least
three independent transfections
2.3 不同细胞中SP1的含量有差异 为了观测SP1蛋白在不同组织来源的细胞中其含量有无差异，从而进一步推测SP1对此段启动子样序列的影响，我们提取细胞蛋白与带有SP1特异性结合位点的双链oligo〔8〕进行条带移动实验。结果显示三种细胞提取物均可同32P标记的oligo形成多个蛋白-DNA复合物(图3)，其中复合物A的泳动位置与文献报道的SP1-DNA复合泳动位置相似〔8〕。同时可以看出复合物A的含量在HeLa细胞中最高，而在COS7和Sh-sy5y细胞中几乎没有(图3)，而三种细胞提取物的SDS-PAGE电泳图形几乎没有差别。提示不同组织来源的细胞系中SP1的含量差别很大。为了进一步确定复合物A的确为SP1-DNA复合物，我们在条带移动实验的基础上进一步进行竞争抑制实验。图4显示HeLa细胞提取物所形成的复合物A在有50倍未标记的带有SP1结合位点的同源oligo-HPV18-WT存在时条带消失，而不受等量未标记无SP1结合位点的oligo-T7的影响。其他蛋白-DNA复合物在此浓度的竞争oligo条件下基本不受影响。表明复合物A确系SP1蛋白结合物。
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图3 三种细胞中内源性SP1的检测
Fig.3 Detection of endogenous SP1 in three tested cell lines
1：COS7.2：HeLa.3：Sh-sy5y. Arrows A to E indicated the different protein-DNA complexes,arrow F represented the unbound probe oligo
3 讨论
一般启动子都有一个共同的结构模式，在-25～-35位有TATA盒，具有较高的转录活性。也有一些启动子不具有TATA盒，为富含GC的启动子，多属于看家基因，一般含数个分离的转录启始点〔9〕。另外，还有一类启动子既不含TATA盒，也没有GC富含区〔10〕。在我们的实验中，从人白细胞DNA中克隆出的这段PrP外显子Ⅰ及其上游序列即显示GC富含的特点，且经过不同细胞系的转染，证实这段序列确实具有启动子的作用。与TATA盒启动子相比，TATA-less启动子的活性一般较弱，我们的实验结果也证明了这点。此外，所克隆的PrP外显子Ⅰ及其上游序列仅为203 bp，有可能缺少组织特异性增强子序列，这也可能是CAT相对表达值较低的原因。
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SP1是一种DNA结合蛋白，它可与相应的靶DNA结合，促进基因的转录。其结合位点通常位于ATTA盒和非TATA盒启动子的前面〔8，9〕。我们获得的具有启动子样活性的PrP外显子Ⅰ及其上游序列显示出极高的“GC”含量，其中具有多个可能的SP1结合位点。但等量细胞提取物的条带移动实验结果显示SP1在不同组织来源的细胞系中含量不同，在神经母细胞瘤细胞系Sh-sy5y中含量极低。而人PrP外显子Ⅰ及其上游序列却能在SP1含量极低的Sh-sy5y和COS7细胞，以及SP1含量较高的HeLa细胞均显示出启动子活性，甚至在前两种细胞系中的活性还略高于HeLa细胞。这提示转录激活蛋白SP1对这一非TATA启动子在上述两种细胞系中的活性并非起关键作用，还可能存在有其他细胞转录因子，甚至是组织特异性转录因子决定了这一启动子的活性。
所用细胞提取物来自HeLa细胞系。1：未加任何竞争抑制物；2，3：400和50倍未标记oligo-HPV18-WT；4，5：400和50倍未标记oligo-T7.箭头A-E表示不同的蛋白-DNA复合物，箭头F表示未结合的探针oligo
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图4 竞争抑制实验鉴定特异性SP1-DNA复合物
Fig.4 Identification of the specific SP1-DNA complex
using competitive inhibition test
The extracts used in the assay were derived from HeLa cells.1:Without any competitor;2 and 3:400-and 50-fold cold homologous competitor oligo-HPV18-WT;4 and 5:400-and 50-fold cold heterogenous oilgo-T7.Arrows A to E indicate the different protein-DNAcomplexes,arrow F represents the unbound probeoligo
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PrP基因存在于人及动物的体细胞内，为一相对保守基因。但PrP蛋白多存在于中枢神经细胞〔4，5〕。这提示可能会存在有某种或某些神经组织特异性转录增强因子或蛋白控制着PrP启动子的活性。我们实验结果也显示了这种可能性的存在。对神经组织特异性转录增强因子或蛋白的筛选及鉴定必将有助于阐明PrP基因的转录特点，为朊病毒病的发病机理研究和有效的防治提供科学基础。
以往实验显示细胞转录激活因子NF1在子宫颈癌细胞系HT3和C33A中的表达量有所差别〔11〕，SP1/SP3的含量在不同生长阶段的粘膜上皮细胞中也有差别〔12〕。我们的实验结果表明，SP1在上皮来源的HeLa细胞中含量较高，而纤维组织来源细胞COS7和神经组织来源细胞Sh-sy5y中含量极低，这再次证明了这种上皮细胞广泛存在的活性蛋白在其他组织中表达甚低。不同组织来源的细胞中其活性蛋白含量的差异，将影响基因表达调控序列在不同细胞中的作用，从而影响基因的表达。
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本文为国家863高科技发展计划资助项目(863-102-11-03-05)
参 考 文 献
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(收稿日期：2000-06-21)
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