戊型肝炎病毒结构区基因ORF2在Pichia pastoris中的分泌表达
作者：佟玉品 毕胜利 张明程 鲁健 詹美云
单位：中国预防医学科学院病毒学研究所肝炎病毒研究室 北京 100052
关键词：
中华实验和临床病毒学杂志000428 戊型肝炎是近年来被发现的一种较为严重的新型肝炎，经消化道传播，世界各地均有流行，戊型肝炎疫苗是预防和控制其流行的有效手段之一，而基因工程抗原作为候选疫苗有很好的应用前景。已被证实，戊型肝炎病毒(HEV)结构区基因ORF2编码蛋白具有较强的免疫学活性。HEV基因工程抗原的研制主要集中于ORF2上。目前，ORF2基因已成功在原核细胞、昆虫细胞中得到表达，表达产物均有一定免疫原性〔1〕。酵母表达系统以其表达产物类似于天然蛋白、能保持很好的生物学活性、表达条件易于控制、易于工业化生产等优势作为疫苗研制的载体已被成功应用。但国内外尚未见应用酵母系统表达戊型肝炎ORF2的报道。为探讨戊型肝炎基因工程疫苗生产的新途径，我们利用甲醇营养型酵母表达系统成功地表达了HEV ORF2基因，并对相关问题进行了讨论。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 质粒、菌株及酵母表达系统试剂质粒pPIC9K,酵母菌株GS115，GS115 Albumin,GS115β-gal, 大肠埃希菌TOP10F等均购自美国Invitrogen 公司的多拷贝巴氏毕赤酵母表达系统试剂盒，其他试剂均按试剂盒说明进行配制。
1.2 工具酶与试剂 限制性内切酶SnaBⅠ,Bg1Ⅱ，NotⅠ等均为New England Biolabs公司产品。Klenow 酶，Taq DNA聚合酶，T4DNA连接酶均为Promega公司产品。HEV ORF2单克隆抗体为本室制备，戊型肝炎阳性患者血清来自临床戊型肝炎病人，经血清学检测证实HEV IgG阳性的患者。重组HEV ORF2基因工程抗原为ORF2基因在大肠杆菌表达系统中表达产物，由本室制备〔2〕。
1.3 HEV ORF2基因克隆 PCR引物参考我国戊型肝炎病毒基因组cDNA序列〔3〕设计，由中科院微生物所合成。上游引物5′-cgtacgtaGCGGTCGCTCCGGC
, 百拇医药
CCATG-3′,引入SnaBⅠ位点。下游引物5′-ataagaatgcggccgCTATAACTCCCG
AG-3′,引入NotⅠ位点。PCR扩增ORF2基因112-660氨基酸，全长1.65 kb。扩增产物经Klenow酶补平回收，SnaBⅠ和NotⅠ酶切处理后与经相应酶切处理的pPIC 9K载体连接，转化。重组质粒经酶切鉴定，筛选其中一株阳性克隆经ABI 377A型DNA测序仪进行序列测定，命名为pPIC9K ORF2。
1.4 转化酵母细胞筛选多拷贝转化子 将pPIC9K ORF2,pPIC9K质粒经Bg1Ⅱ酶切线性化处理，以电转方法转化GS115，转化细胞涂于MD平皿上，经30℃培养2 d后将生长的His阳性克隆用灭菌双蒸水悬浮，按每平皿1×105细胞涂于含G418不同浓度的YPD平皿，其中G418含量分别为0，1.0,2.0,3.0,4.0 mg/ml。继续30℃培养3～5 d后，G418抗性克隆长出。
, 百拇医药
1.5 表型检测与诱导表达 将G418高抗性克隆分别在MD和MM培养基中培养，筛选Muts的克隆接种于5 ml BMGY培养基中，30℃培养36 h后离心弃上清，细胞沉淀中加入1.5 ml BMMY培养基中继续培养3 d，并于每24 h补充甲醇，维持其终浓度0.5%。诱导结束后将菌液离心，取上清进行ELISA及SDS-PAGE电泳检测。
1.6 ELISA检测表达产物活性 建立双夹心ELISA法检测表达产物的免疫学活性。步骤如下:①包被小鼠抗-HEVORF2单抗；②加酵母分泌表达上清，以重组ORF2原核表达纯化抗原作为阴性对照，单纯载体诱导表达上清作为阴性对照；③加HEV IgG抗体阳性患者血清；④加HRP标记抗人IgG抗体；⑤加TMB底物显色并终止。应用酶标分析仪测定ELISA反应各孔吸光度A值(450 nm)。
2 结果
2.1 HEV ORF2基因克隆 应用PCR方法成功从HEV ORF2 cDNA中扩增到约1.65 kb的DNA条带，回收片段，连接于pPIC9K，重组质粒经相应酶切鉴定，电泳条带和预期设计相符。选择一阳性克隆，DNA测序证实其序列和读码框架皆正确。
, 百拇医药
2.2 筛选多拷贝转化子及诱导表达产物分析 应用电转方法转化效率很高，重组质粒及载体对照转化GS115后于MD平皿上皆有大量His阳性克隆产生，进一步将这些克隆进行G418筛选，发现G418在4.0 mg/ml浓度时仍有数百个克隆产生，经表型检测后，筛选表型为Muts的克隆进行诱导表达，取表达上清直接进行ELISA检测，从约400株克隆中共筛选到若干株较高活性克隆，将这些阳性克隆划单斑，挑取单克隆再诱导，直获得较为稳定表达的克隆。SDS-PAGE电泳发现这些克隆表达带型不尽一致。表1显示5株阳性克隆各挑取3个单菌落进行诱导表达后直接取表达上清进行ELISA的检测结果。从表1可以看出，利用甲醇营养型酵母系统表达的HEV ORF2抗原是特异的。
3 讨论
HEV ORF2 已被证实为编码结构蛋白的基因，在其5′端含有一典型的信号肽序列，3′包含了一个主要的免疫原性表位。因此从ORF2来源的基因工程抗原可以广泛应用于戊型肝炎病毒感染的诊断及疫苗研究。基于原核细胞表达的HEV ORF2已成功地应用于戊型肝炎的诊断，但疫苗的研究尚未有突破进展。Li等〔4〕于1997年报道，其将编码HEV ORF2第112-660氨基酸的基因在昆虫细胞表达系统中进行表达，在培养基中得到以相对分子质量50 000蛋白为主的HEV表达蛋白，并能自身装配形成病毒样颗粒(VLPs)。作者认为，VLPs的形成可能成为很有前景的戊型肝炎重组疫苗。作为VLPs形成的必要条件之一，在基因结构中ORF2 N端前111氨基酸必需删除，这样表达蛋白才能经转录后修饰，被细胞蛋白酶降解继而释放到培养基中〔4〕。另外Yarbough等也有类似报道，其将112-660氨基酸编码基因在昆虫细胞表达时可以得到基本均一的表达产物。纯化的这种62 000可溶性蛋白作为免疫源对猕猴进行免疫保护研究，结果免疫猴子能产生保护性免疫反应，抵抗HEV的攻击〔5〕。由于昆虫细胞表达系统作为疫苗研制的载体尚未通过FDA批准，而酵母表达系统在疫苗研制中已得到广泛应用，因此，我们试将ORF2基因编码112-660氨基酸部分克隆到酵母分泌型载体，在巴氏毕赤酵母细胞中进行表达。结果令人鼓舞，通过改变阳性克隆的各种诱导条件，如pH值、诱导时间、甲醇浓度、不同培养基等，最终确定了获得较高免疫活性的诱导条件，得到了分泌表达活性较高的克隆。为戊型肝炎的疫苗研制探索了一条新的途径。
, http://www.100md.com
表1 5个阳性表达菌株诱导表达上清ELISA检测结果(A值)
Fig.1 ELISA results of induced supernatants from 5 positively expressed strains (A value) 克隆编号
No.clone
菌 株
Strains
阳性对照
Positive control*
阴性对照
Negative control
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HEV60
HEV79
HEV110
HEV116
HEV182
1
1.409
1.244
1.569
1.565
1.495
-
-
, 百拇医药
2
1.578
1.138
1.086
1.521
1.432
-
-
3
1.575
1.264
0.872
1.151
, http://www.100md.com
1.093
-
-
平均值
Average
1.521
1.215
1.176
1.412
1.340
1.806
0.000
*:阳性对照为重组HEV ORF2原核表达抗原，其浓度为2 μg/ml
, 百拇医药
*:Recombinant HEV ORF2 protein expressed in E.coli as positive control (2 μg/ml)
本课题由国家九五攻关课题基金资助(03-10-20)
参 考 文 献
1，Robison RA,Burgess WH,Emerson SU,et al. Structural characterization of recombinant hepatitis E virus ORF2 proteins in baculovirus-infected insect cell.Protein Express Purifi,1998,12:75-84.
2，毕胜利，江永珍，赵洪兰，等.戊型肝炎病毒结构区抗原在大肠杆菌中的表达和分析.病毒学报,1996,12:118-120.
, http://www.100md.com
3，毕胜利,刘崇柏,曹学义,等.我国戊型肝炎病毒基因组cDNA全序列测定及分析.病毒学报,1992,8:271-279.
4，Li TC,Yamakawa,Y,Suzuki K,et al.Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus.J Virol,1997,71,7207-7213.
5，Yarbough PO,Krawczyski K,Tam AW,et al. Prevention of hepatitis E using r62k subunit vaccine:full challenge in cynomolgus macaques. In:Viral Hepatitis and Liver Disease. Rizzetto M, Purcell RH,Gerin JL,et al editied.Turin:Edizioni Mincrva Medica,1997,650-655.
(收稿日期：2000-02-24), http://www.100md.com
单位：中国预防医学科学院病毒学研究所肝炎病毒研究室 北京 100052
关键词：
中华实验和临床病毒学杂志000428 戊型肝炎是近年来被发现的一种较为严重的新型肝炎，经消化道传播，世界各地均有流行，戊型肝炎疫苗是预防和控制其流行的有效手段之一，而基因工程抗原作为候选疫苗有很好的应用前景。已被证实，戊型肝炎病毒(HEV)结构区基因ORF2编码蛋白具有较强的免疫学活性。HEV基因工程抗原的研制主要集中于ORF2上。目前，ORF2基因已成功在原核细胞、昆虫细胞中得到表达，表达产物均有一定免疫原性〔1〕。酵母表达系统以其表达产物类似于天然蛋白、能保持很好的生物学活性、表达条件易于控制、易于工业化生产等优势作为疫苗研制的载体已被成功应用。但国内外尚未见应用酵母系统表达戊型肝炎ORF2的报道。为探讨戊型肝炎基因工程疫苗生产的新途径，我们利用甲醇营养型酵母表达系统成功地表达了HEV ORF2基因，并对相关问题进行了讨论。
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1 材料和方法
1.1 质粒、菌株及酵母表达系统试剂质粒pPIC9K,酵母菌株GS115，GS115 Albumin,GS115β-gal, 大肠埃希菌TOP10F等均购自美国Invitrogen 公司的多拷贝巴氏毕赤酵母表达系统试剂盒，其他试剂均按试剂盒说明进行配制。
1.2 工具酶与试剂 限制性内切酶SnaBⅠ,Bg1Ⅱ，NotⅠ等均为New England Biolabs公司产品。Klenow 酶，Taq DNA聚合酶，T4DNA连接酶均为Promega公司产品。HEV ORF2单克隆抗体为本室制备，戊型肝炎阳性患者血清来自临床戊型肝炎病人，经血清学检测证实HEV IgG阳性的患者。重组HEV ORF2基因工程抗原为ORF2基因在大肠杆菌表达系统中表达产物，由本室制备〔2〕。
1.3 HEV ORF2基因克隆 PCR引物参考我国戊型肝炎病毒基因组cDNA序列〔3〕设计，由中科院微生物所合成。上游引物5′-cgtacgtaGCGGTCGCTCCGGC
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CCATG-3′,引入SnaBⅠ位点。下游引物5′-ataagaatgcggccgCTATAACTCCCG
AG-3′,引入NotⅠ位点。PCR扩增ORF2基因112-660氨基酸，全长1.65 kb。扩增产物经Klenow酶补平回收，SnaBⅠ和NotⅠ酶切处理后与经相应酶切处理的pPIC 9K载体连接，转化。重组质粒经酶切鉴定，筛选其中一株阳性克隆经ABI 377A型DNA测序仪进行序列测定，命名为pPIC9K ORF2。
1.4 转化酵母细胞筛选多拷贝转化子 将pPIC9K ORF2,pPIC9K质粒经Bg1Ⅱ酶切线性化处理，以电转方法转化GS115，转化细胞涂于MD平皿上，经30℃培养2 d后将生长的His阳性克隆用灭菌双蒸水悬浮，按每平皿1×105细胞涂于含G418不同浓度的YPD平皿，其中G418含量分别为0，1.0,2.0,3.0,4.0 mg/ml。继续30℃培养3～5 d后，G418抗性克隆长出。
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1.5 表型检测与诱导表达 将G418高抗性克隆分别在MD和MM培养基中培养，筛选Muts的克隆接种于5 ml BMGY培养基中，30℃培养36 h后离心弃上清，细胞沉淀中加入1.5 ml BMMY培养基中继续培养3 d，并于每24 h补充甲醇，维持其终浓度0.5%。诱导结束后将菌液离心，取上清进行ELISA及SDS-PAGE电泳检测。
1.6 ELISA检测表达产物活性 建立双夹心ELISA法检测表达产物的免疫学活性。步骤如下:①包被小鼠抗-HEVORF2单抗；②加酵母分泌表达上清，以重组ORF2原核表达纯化抗原作为阴性对照，单纯载体诱导表达上清作为阴性对照；③加HEV IgG抗体阳性患者血清；④加HRP标记抗人IgG抗体；⑤加TMB底物显色并终止。应用酶标分析仪测定ELISA反应各孔吸光度A值(450 nm)。
2 结果
2.1 HEV ORF2基因克隆 应用PCR方法成功从HEV ORF2 cDNA中扩增到约1.65 kb的DNA条带，回收片段，连接于pPIC9K，重组质粒经相应酶切鉴定，电泳条带和预期设计相符。选择一阳性克隆，DNA测序证实其序列和读码框架皆正确。
, 百拇医药
2.2 筛选多拷贝转化子及诱导表达产物分析 应用电转方法转化效率很高，重组质粒及载体对照转化GS115后于MD平皿上皆有大量His阳性克隆产生，进一步将这些克隆进行G418筛选，发现G418在4.0 mg/ml浓度时仍有数百个克隆产生，经表型检测后，筛选表型为Muts的克隆进行诱导表达，取表达上清直接进行ELISA检测，从约400株克隆中共筛选到若干株较高活性克隆，将这些阳性克隆划单斑，挑取单克隆再诱导，直获得较为稳定表达的克隆。SDS-PAGE电泳发现这些克隆表达带型不尽一致。表1显示5株阳性克隆各挑取3个单菌落进行诱导表达后直接取表达上清进行ELISA的检测结果。从表1可以看出，利用甲醇营养型酵母系统表达的HEV ORF2抗原是特异的。
3 讨论
HEV ORF2 已被证实为编码结构蛋白的基因，在其5′端含有一典型的信号肽序列，3′包含了一个主要的免疫原性表位。因此从ORF2来源的基因工程抗原可以广泛应用于戊型肝炎病毒感染的诊断及疫苗研究。基于原核细胞表达的HEV ORF2已成功地应用于戊型肝炎的诊断，但疫苗的研究尚未有突破进展。Li等〔4〕于1997年报道，其将编码HEV ORF2第112-660氨基酸的基因在昆虫细胞表达系统中进行表达，在培养基中得到以相对分子质量50 000蛋白为主的HEV表达蛋白，并能自身装配形成病毒样颗粒(VLPs)。作者认为，VLPs的形成可能成为很有前景的戊型肝炎重组疫苗。作为VLPs形成的必要条件之一，在基因结构中ORF2 N端前111氨基酸必需删除，这样表达蛋白才能经转录后修饰，被细胞蛋白酶降解继而释放到培养基中〔4〕。另外Yarbough等也有类似报道，其将112-660氨基酸编码基因在昆虫细胞表达时可以得到基本均一的表达产物。纯化的这种62 000可溶性蛋白作为免疫源对猕猴进行免疫保护研究，结果免疫猴子能产生保护性免疫反应，抵抗HEV的攻击〔5〕。由于昆虫细胞表达系统作为疫苗研制的载体尚未通过FDA批准，而酵母表达系统在疫苗研制中已得到广泛应用，因此，我们试将ORF2基因编码112-660氨基酸部分克隆到酵母分泌型载体，在巴氏毕赤酵母细胞中进行表达。结果令人鼓舞，通过改变阳性克隆的各种诱导条件，如pH值、诱导时间、甲醇浓度、不同培养基等，最终确定了获得较高免疫活性的诱导条件，得到了分泌表达活性较高的克隆。为戊型肝炎的疫苗研制探索了一条新的途径。
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表1 5个阳性表达菌株诱导表达上清ELISA检测结果(A值)
Fig.1 ELISA results of induced supernatants from 5 positively expressed strains (A value) 克隆编号
No.clone
菌 株
Strains
阳性对照
Positive control*
阴性对照
Negative control
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HEV60
HEV79
HEV110
HEV116
HEV182
1
1.409
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平均值
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1.521
1.215
1.176
1.412
1.340
1.806
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*:阳性对照为重组HEV ORF2原核表达抗原，其浓度为2 μg/ml
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*:Recombinant HEV ORF2 protein expressed in E.coli as positive control (2 μg/ml)
本课题由国家九五攻关课题基金资助(03-10-20)
参 考 文 献
1，Robison RA,Burgess WH,Emerson SU,et al. Structural characterization of recombinant hepatitis E virus ORF2 proteins in baculovirus-infected insect cell.Protein Express Purifi,1998,12:75-84.
2，毕胜利，江永珍，赵洪兰，等.戊型肝炎病毒结构区抗原在大肠杆菌中的表达和分析.病毒学报,1996,12:118-120.
, http://www.100md.com
3，毕胜利,刘崇柏,曹学义,等.我国戊型肝炎病毒基因组cDNA全序列测定及分析.病毒学报,1992,8:271-279.
4，Li TC,Yamakawa,Y,Suzuki K,et al.Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus.J Virol,1997,71,7207-7213.
5，Yarbough PO,Krawczyski K,Tam AW,et al. Prevention of hepatitis E using r62k subunit vaccine:full challenge in cynomolgus macaques. In:Viral Hepatitis and Liver Disease. Rizzetto M, Purcell RH,Gerin JL,et al editied.Turin:Edizioni Mincrva Medica,1997,650-655.
(收稿日期：2000-02-24), http://www.100md.com