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编号:10242427
人胶质细胞源神经营养因子在大肠埃希菌中高效表达
http://www.100md.com 《中华实验和临床病毒学杂志》 2000年第4期
     作者:陈惠 徐群渊 杨新科

    单位:陈惠(中国康复研究中心 北京 100077);徐群渊(首都医科大学);杨新科(病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室)

    关键词:

    中华实验和临床病毒学杂志000426 胶质细胞源神经营养因子(GDNF)是近几年来发现并克隆成功的一种新的神经营养因子,它对不同神经元的生长、发育过程都有重要的影响〔1-3〕。GDNF对中脑多巴胺能(DA)神经元具有存活、支持作用,对损伤的DA能神经元具有修复作用〔4,5〕。GDNF除对DA能神经元有特异性营养作用外,还对胆碱能神经元、去甲肾上腺素能神经元、运动神经元及外周神经系统的各类感觉神经元、交感神经元等均有很强的营养作用。GDNF对6-羟基多巴(OHDA)及神经毒MPTP损伤的黑质纹状体多巴胺能神经元有保护及修复、再生的功能。甚至黑质多巴胺能神经元通向纹状体的神经纤维被切断后加入GDNF能使绝大多数该类神经元免于死亡。GDNF对Parkinson′s(PD)和Alzheimer′s(AD)病的预防和治疗作用在于减慢DA能神经元退变过程,并使残存的DA能神经元轴突增生而增加功能活性以补偿退变的神经元〔1,4,6〕。因此,PD大鼠模型动物脑内注射GDNF可明显改善其行为缺陷〔4,6〕,应用GDNF可延缓神经元退变过程,减轻各种原因造成的神经系统损伤〔7-9〕。由于GDNF在体内表达水平很低,难以从组织中提取,因此,必须采取基因工程手段克隆中国人自己的GDNF基因,构建高效表达载体以获得具有生物学活性的可溶性的非融合蛋白,为研究治疗PD、AD、ALS提供更多的途径。
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    1 材料和方法

    1.1 酶及载体 限制性核酸内切酶、Sepharose-6B-heparin等购自华美生物工程公司。高效表达载体PBV220由病毒学研究所基因工程室赠送。

    1.2 GDNF引物设计 GDNF mRNA成熟肽端缺乏起始密码子,为获得纯天然非融合蛋白,在上游引物设计时加入起始密码子ATG。5′端引物:TAGGATCCATGTCACCAGATGAACA

    AATGGCA,3′端引物:GCAAGCTTCAG

    ATACATCCACACCTT;5′和3′端引物分别引入酶切位点BamH Ⅰ和Hind Ⅲ。

    1.3 RT-PCR扩增GDNF cDNA 从人胶质细胞瘤组织中提取总RNA,按Promega试剂盒推荐方法,35个循环获得GDNF cDNA,该片段经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切纯化备用。
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    1.4 酶切图谱分析重组GDNF质粒 碱法提取pBV220,用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶解后纯化出pBV220大片段,加入GDNF cDNA片段,T4 DNA ligase等连接反应过夜,连接反应液转化大肠埃希菌TG1,挑取阳性转化子进行扩增,再纯化出重组GDNF质粒,用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ消化分析重组质粒相对分子质量大小。

    1.5 重组质粒的表达与纯化 重组GDNF质粒在TG1中大量扩增,收获工程菌超声破碎离心,取其上清进行Sepharose-6B-heparin亲和层析,用0.15~1.5 mol/L NaCl,50 mmol/L PBS(pH8.0)连续梯度洗脱,收获A(280 nm)洗脱峰,置PEG浓缩至所需体积。用Bradford法定氮〔10〕。以15% SDS-PAGE考染分析重组GDNF相对分子质量。

    1.6 重组GDNF生物学活性分析 解剖镜下挑取9 d龄鸡胚背根神经节对不同浓度GDNF(50,100,200,400 ng/ml)测其生物学活性。96孔“U”板,每孔加入RPMI1640 25 μl,神经节一个,不同浓度重组GDNF 25 μl,鸡血浆25 μl,凝血酶25 μl,阴性对照补加RPMI 1640 25 μl。置5% CO2孵箱37℃培养36~72 h判定结果。
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    2 结果

    2.1 RT-PCR扩增结果 按Promega试剂盒推荐方法从人胶质瘤组织中提取总RNA,经RT-PCR 35次循环后,1.4%PAGE显示PCR产物约405 bp的特异性扩增条带。

    2.2 重组人GDNF高效表达载体组建与酶切图谱鉴定 pBV220和PCR产物GDNF基因分别经BamH Ⅰ、Hind Ⅲ消化后再纯化出所需片段,加入连接酶连接过夜,转化大肠埃希菌扩增,纯化出rhGDNF DNA,用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ双酶解鉴定证明插入片段与预计大小一致(图1)。

    1~7:重组GDNF DNA约405 bp;8,9:marker

    图1 重组GDNF质粒酶切图谱鉴定
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    Fig.1 Restriction map of recombinant human

    GDNF plasmid

    1-7:Recombinant human GDNF DNA of

    405 bp;8:Marker; 9:700 bp

    2.3 重组GDNF的纯化与鉴定 收获培养液,超声破碎离心,上清过亲和层析柱连续梯度洗脱,收集洗脱峰,经Bradford法测其蛋白质含量约4 mg/L 15%SDS-PAGE显示GDNF单体的相对分子质量约15 000,见图2。

    图2 15%SDS-PAGE测定rhGDNF
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    相对分子质量

    Fig.2 Molecular weight of rhGDNF

    measured by 15% SDS-PAGE

    S:rh GDNF. M: Molecular weight marker

    2.4 重组GDNF的生物学活性测定结果 以50~400 ng/ml重组GDNF用于背根神经节均显示促神经节纤维生长作用,以200 ng最强,50 ng减弱,400 ng则出现对神经节纤维生长的抑制作用,结果见图3。

    3 讨论

    重组GDNF工程菌在超声破碎时加入PMSF经亲和层析显示单一洗脱峰,而不加PMSF约在0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl时出现两个洗脱峰,PAGE显示前者为一条带,后者为两条带,大带相对分子质量同前者约15 000,小带14 000,各带均对DGR显示出生物学活性。因此,认为在无PMSF时出现的14 000带可能系15 000 GDNF被某种蛋白酶降解所致。
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    文献报道重组GDNF在原核表达系统为不溶性包涵体蛋白,需要恢复天然折叠状态才具有生物学活性,而活性要低于可溶性蛋白10~50倍。本文报道的重组GDNF为可溶性蛋白组分,不需重新折叠即对DGR有明显的促生长作用。重组GDNF基因全序列测定与文献〔2〕比较显示第344位A变为G,即由原来的天门冬氨酸变为甘氨酸;单一碱基改变并未引起GDNF理化性质改变,仍然具有较强的生物学活性;这或许因为改变的碱基靠近羧基末端;本文所示的碱基改变也可能由于GDNF cDNA来源于非正常组织或是PCR技术本身还是种族不同造成,其确切原因有待进一步探索。本文组建的高效表达载体在一升大肠杆菌中可表达约4 mg可溶性蛋白质,使在实验室大量获得纯化GDNF产品成为可能,使应用GDNF成为研究治疗帕金森氏病、早老性痴呆等神经系统退行性疾病的有效途径。

    A:阴性对照.B:200 ng rhGDNF
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    图3 重组GDNF促鸡胚背根

    神经节生长状况

    Fig.3 Promoting growth of chicken embryo

    DGR by recombinant human GDNF

    A:Negative control. B:200 ng of rh GDNF

    该课题为北京市科学技术委员会重点项目

    参 考 文 献

    1,Miller G,Martin D,Cullen T. Central administration of rhGDNF cause augmentation of dopaminergic activity in vivo.1994,Soc.Neurosci Abstract,20:1300.
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    2,Lin LFH,Doherty Dr,Lile JD,et al.A glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science,1993,260:1130-1132.

    3,Len FH,Lin,Tie Jin Zhang,et al.Purification and qualification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein age binding. Anal Biochem,1994,72:248-254.

    4,Don M Gash,Zhi ming Zhang,et al.Function recovery in Parkinsonian monkeys treated with GDNF.Nature,1986,380:21.
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    5,Lin LF,Zhang TJ,Collins F,et al.Purification and initial characterization of rat B49 glial cell line-derived neurotrophic factor.J Neurochem,1994, 63:758-768.

    6,Jyh Gong, Cabriel Hon,Len Fen H.Lin,Catherlve:Glial cell line derived neurotrophic factor extracts neurotrophic effects on dopaminergic neurons in vitro and promotes their survival and regrowth after damage by 1 methyl 4 phenyl pyridinium. J Neurochem,1996,66:74-82.

, 百拇医药     7,E Benda T,Tomac A,Hoffer BJ, et al.Glial cell line-derived neurotrophic factor stimulates fiber formation and survival in cultured neurons form peripheral autonomic ganglia. J Neurosci Res,1995,40:270-284.

    8,Schubert D,Ling N,Baird A. Multiple influences of a heparin binding growth factor on neuronal development. J Cell Biol,1987,104:635-643.

    9,Beck KD,Knusel B,Hefta F.The nature of the trophication of brain derived neurotrophic factor and insulin like growth factor-1, and basic fibroblast factor on mesencephalic dopaminergic neurons developing in culture. Neurosci, 1993,52:855-866.

    10,Bradford MM. A rapid and sensitive method for quantitation of micorgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding. Annal Biochem,1976,72:248-254.

    (收稿日期:1999-03-21)

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